Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Riepilogo

Microdissezione laser è una tecnica che consente il recupero di cellule scelte da piccole quantità di parenchima. Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per gli studi di trascrittomica. Il nostro protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro collezione.

Abstract

Microdissezione laser (LMD) è una tecnica che consente il recupero di cellule e tessuti selezionati da piccole quantità di parenchima ^1,2. Le cellule sezionato possono essere utilizzati per una varietà di indagini, come gli studi di proteomica, trascrittomica o di valutazione o analisi del DNA cromosomico ^2,3. Un'applicazione particolarmente impegnativa LMD è l'analisi del trascrittoma, che, a causa della instabilità del RNA ^4, può essere particolarmente importante quando le cellule vengono sezionati da tessuti che sono ricchi di RNasi, come il pancreas. Un protocollo microdissezione che consente una rapida identificazione e raccolta delle cellule bersaglio è essenziale in questa impostazione per abbreviare il tempo di movimentazione del tessuto e, di conseguenza, per garantire la conservazione dell'RNA.

Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di cellule beta pancreatiche da campioni chirurgici di essere utilizzati per lo studio trascrittomica ^5. Piccoli pezzi di pancreas di circa 0,5-1 cm ³ sono stati tagliati dai margini sani figuranti di campioni resecati pancreas, incorporati in Tissue-Tek Compound ottobre, immediatamente congelati in refrigerata 2-metilbutano, e conservati a -80 ° C fino al sezionamento. Quaranta sezioni seriali di spessore 10 um sono state tagliate su un criostato in un ambiente -20 ° C, trasferite individualmente i vetrini, essiccate all'interno del criostato per 1-2 min, e conservati a -80 ° C.

Immediatamente prima della procedura microdissezione laser, le sezioni sono state fissate in ghiaccio freddo, preparata etanolo al 70% per 30 sec, lavato da 5-6 cali di ghiaccio freddo acqua trattata con DEPC, e disidratato per un minuto due incubazioni in ghiaccio freddo 100% etanolo seguita da xilene (che viene usato per la disidratazione del tessuto) per 4 min, sezioni di tessuto sono state poi essiccate dopo per 3-5 min. È importante sottolineare che tutti i passi, eccetto l'incubazione in xilene, sono stati eseguiti utilizzando ghiacciata reagenti - una modifica su un protocollo precedentemente descritto ^6. Utilization di reagenti ghiaccio freddo ha determinato un aumento marcato della autofluorescenza intrinseca delle cellule beta, e facilitato il loro riconoscimento. Per microdissezione, quattro sezioni erano disidratati ogni volta: due sono stati posti in una pellicola protettiva tubo da 50 ml, per proteggere i tessuti da umidità e sbiancamento, gli altri due sono stati immediatamente microdissezione. Questa procedura è stata eseguita utilizzando un PALM MicroBeam strumento (Zeiss) che impiega il laser a pressione Auto catapultando (AutoLPC) modalità. Il completamento di cellule beta / dissezione isolotto da quattro criosezioni necessari non più di 40-60 min. Le cellule sono state raccolte in un unico AdhesiveCap e lisate con 10 microlitri di tampone di lisi. Ogni singolo campione di RNA per analisi trascrittomica stata ottenuta combinando 10 campioni cellulari microdissezione, seguita da estrazione RNA utilizzando il Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Questo protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro rilevazione rapida e precisa e Collezione. Ulteriore miglioramento di questa procedura potrebbe consentire la dissezione delle cellule beta fenotipicamente diversi, con possibili implicazioni per una migliore comprensione dei cambiamenti associati al diabete di tipo 2.

Protocollo

1. Congelamento di tessuto pancreatico umano

1. Rimuovere il tessuto adiposo, vasi sanguigni, nervi e tessuto parenchimale non con un bisturi e pinzette, e tagliare il tessuto pancreatico in pezzi (~ 0,5-1 cubetti di cm).
2. Posizionare un pezzo tessuto pancreatico nel centro di un Cryomold, e coprire completamente con freddo Tissue-Tek Compound ottobre Mettere il Cryomold in un vaso il cui fondo è ricoperto di pre-raffreddato 2-metilbutano e snap-congelamento in azoto liquido. Conservare il campione congelato a -80 ° C.

2. Preparazione di sezioni congelate

1. Indossare guanti durante tutte le misure per evitare la denaturazione di RNA.
2. Pulire il coltello criostato, portacampione e pennello con il freddo di etanolo 100% e RNase Away. Posizionare il tessuto congelato all'interno del criostato.
3. Attendere che il, coltello e pennello tessuto raggiungere -20 ° C. Etichettare il SuperFrost Plus diapositive e pre-raffreddare dentro la camera di criostato in attesaper il tessuto di raggiungere -20 ° C.
4. Applicare il Tissue-Tek Compound PTOM porta campione e posizionare il tessuto congelato in alto.
5. Una volta che il Tissue-Tek OCT è congelato tagliare il cryoblock e rimuovere ogni eccesso di Tissue-Tek Compound ottobre con una lama di rasoio.
6. Tagliare un totale di 40 consecutivi 10 fette micron dal blocco di tessuto pancreatico. Inoltre si consiglia di tagliare una prima fetta e mezzo per essere salvati per i disegni panoramica della sezione del pancreas che può facilitare l'individuazione di isole all'interno delle fette durante il processo di microdissezione.
7. Trasferire la sezione della lama al centro di un vetrino SuperFrost Plus toccando il retro del vetrino con il dito (coperta da un guanto) per riscaldare solo la regione in cui la sezione deve aderire.
8. Asciugare il 1-2 min sezioni all'interno del criostato a -20 ° C, dopo di che li metti in una scatola scorrevole posta in ghiaccio secco. Conservare le sezionia -80 ° C.
9. Se necessario, pulire la lama del coltello con tovaglioli di carta e fredda di etanolo al 100%.

3. Disidratazione delle sezioni congelate

1. Preparare i reagenti: versare 30 ml preparata etanolo 70%, 30 ml di acqua trattata con DEPC, 2x30 ml di etanolo 100% e 30 ml di xilene in provette da 50 ml Cellstar (Falcons); freddo e conservare tutti i reagenti (tranne xilene) su ghiaccio.
2. Pulire lo spazio di lavoro sotto il cofano con il 100% di etanolo e RNaseZAP.
3. Processo due criosezioni come segue: fissare in ghiaccio freddo etanolo al 70% per 30 secondi, lavare con 5-6 rapidi cali in ghiaccio freddo DEPC-acqua trattata, disidratare due volte per 1 minuto in etanolo ghiacciato al 100%, incubare per 4 min in xilene a temperatura ambiente (25 ° C), e asciugare all'aria per 3-5 min. Ripetere questa operazione con un altro paio di criosezioni.
4. Inserire due criosezioni secchi back to back in una provetta da 50 ml Cellstar avvolto con un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce e dall'umidità.

4. Microdissezione laser di beta-cellule con PALM MicroBeam, Zeiss

1. Pulire il microscopio con RNaseZAP e montare il tappo adesivo in RoboMover.
2. Impostare le seguenti impostazioni: set di filtri 09 (eccitazione: 450-490 nm, emissione> 515 nm), AutoLPC modo, l'energia laser del 50%, 65% fuoco del laser, laser 100% della velocità, distanza di 5 micron tra gli scatti AutoLPC, 6 distanza pm alla linea, altezza di lavoro: -10.100.
3. Inserire una diapositiva nello stadio.
4. Individuare le cellule beta autofluorescenti sotto visualizzazione microscopica (5x o 10x).
5. Passare alla lente 40x, selezionare le cellule beta con lo strumento "mano libera" di selezione e microdissect utilizzando il laser.
6. Cattura il tessuto di quattro criosezioni disidratati in una AdhesiveCap.
   Commento 1: il tempo per analizzare le cellule beta di un cryosection disidratato non deve superare i 10-20 minuti, per evitare la reidratazione delle sezioni di tessuto che porterebbe aRNA degrado.
   Commento 2: verificare la riuscita del processo di microdissezione mediante ispezione visiva dopo aver spostato il palco per il checkpoint.

5. Lisi di microdissezione tessuto cellulare Beta Enriched

1. Rimuovere il AdhesiveCap dal RoboMover.
2. Pipettare 10 microlitri di tampone di estrazione (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) nel coperchio del AdhesiveCap e incubare capovolta a 42 ° C per 30 min.
3. Centrifugare a 10.000 xg e mettere il lisato in ghiaccio secco. Conservarlo a -80 ° C fino a quando l'estrazione dell'RNA viene eseguita.
4. Ripetere i passaggi da 3.) A 5.) Con tutte le altre sezioni.

6. Estrazione RNA

1. Unire tutti e dieci i lisati 10 pl
2. Procedere con l'isolamento di RNA, lavorando a temperatura ambiente secondo il protocollo del RNA Isolation Kit PicoPure, Arturo, con un rapporto di 1:1 tampone di estrazione (XB) al 70% di etanolo (incluso il trattamento DNasi).

7. RNA Analisi

1. Utilizzare 1 RNA pl per l'analisi di qualità e quantità utilizzando un Agilent 2100 Bioanalyser (picoChip). Valutazione quantitativa viene effettuata in riferimento ad un RNA standard, caricati in parallelo sul chip.

Risultati

Come mostrato in figura 1, il protocollo modificato disidratante portato ad un miglioramento di autofluorescenza cellule beta rispetto al precedente protocollo pubblicato ^6. L'applicazione del protocollo descritto, ciascuno dei 39 campioni chirurgici pancreatiche è stato usato per generare 40 criosezioni seriali per una media di 31'544'704 micron ³ tessuto / pancreatico campione (range: 8'742'390 - 81'522'153 micron ³⁾ come mostrato nella

Discussione

Descriviamo un metodo affidabile per la microdissezione laser (LMD) di isole umane da un campione del pancreas chirurgico. A condizione che un microscopio LMD è disponibile, questa procedura potrebbe essere attuata in qualsiasi istituto di ricerca di eseguire pancreatectomies parziali, aumentando in tal modo l'accesso al materiale umano da entrambe le isole non-diabetici e di tipo 2 soggetti diabetici. Questo è particolarmente rilevante data la scarsità di pancreas offerto per l'isolamento delle isole. Aspett...

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-metilbutano (isopentano)	ROTH	3.927,1
AdhesiveCap (opaco, 500 pl)	ZEISS	415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	210 261	con gonna supporto
Cellstar Tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227,261
Dietile pirocarbonato (DEPC)	SIGMA	D 5758
Ghiaccio secco
Etanolo assoluto	VWR	20821.310
Azoto liquido
Pennello
PALM MicroBeam	ZEISS
Peel-a-Way embedding stampi (troncato), 12 x 12 mm	ProSciTech	RR12	Top mm interno 22x22, profondità 21 millimetri
Arcturus PicoPure congelato RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT 0204
Morsetto di plastica
Rasoio
RNase-Free DNasi Set	Qiagen	79254
RNaseZAP	SIGMA	R 2020
Scalpel /lama chirurgica	Techno Taglio	2800111
SuperFrost Plus adesione microscopio diapositive	Thermo Scientific	J1800AMNZ	25x75x1.0 millimetri
Tissue-Tek ottobre Compound	Sakura	4583 o 0807000022
Pinzetta	BRAUN	BD168R
Xilene	VWR	28975.291