Misurazione di pH vacuolare e di Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; In Lievito Cell Sospensioni

Riepilogo

PH vacuolare e di citosolica può essere misurata in lieviti vivi ( S. cerevisiae) Cellule utilizzando tinture fluorescenti raziometrici localizzate a specifici compartimenti cellulari. Noi descriviamo procedure per la misurazione del pH vacuolare di con BCECF-AM, la quale localizza al la vacuolo nel lievito, e del pH citosolico con un citosolica raziometrico GFP pH-sensibile al (lievito pHluorin).

Abstract

Vacuolare e di pH citosolica sono altamente regolamentati in cellule di lievito e di occupano un ruolo centrale nella complessiva omeostasi pH. Noi descriviamo i protocolli per la la misurazione raziometrica di del pH in vivo usando di pH-sensibili fluorofori localizzate al il vacuolo o di citosol. PH vacuolar viene misurata usando BCECF, che localizza al la vacuolo in lievito quando introdotto in cellule nella sua forma estere acetossimetil. PH citosolico è misurata con un GFP pH-sensibile al espressa sotto controllo di un promotore lievito, lievito pHluorin. Metodi di misura della rapporti di fluorescenza in sospensioni cellulari lievito negli una fluorimetro sono descritte. Attraverso questi protocolli, le misurazioni singole punto di tempo di pH in condizioni diversi o in differenti mutanti di lievito sono stati confrontati e di le variazioni di pH nel corso del tempo sono stati monitorati. Questi metodi sono stati anche adattati a una formato di lettore di piastre di fluorescenza per gli esperimenti di ad alta-di throughput. Vantaggi di misure di pH raziometrici oltre altri apsono anche descritti procci attualmente in uso, i potenziali problemi sperimentali e soluzioni, e le prospettive per uso futuro di queste tecniche.

Introduzione

pH omeostasi è un processo dinamico e di altamente regolato in tutti gli organismi ^1,2. Processi biochimici sono strettamente regolati da pH, e di ambienti di intracellulari sono sintonizzati ai range di di pH strette per consentire attività ottimale delle le enzimi residenti. Tuttavia, intracellulare pH omeostasi può essere contestata da rapidi cambiamenti in pH ambientale, turni di metabolici, e di alcuni vie di segnalazione. In aggiunta, pH intracellulare può servire di per sé come un segnale importante. Infine, molti organelli mantengono valori pH lumenal che sono distinti dal citosol circostante e essenziale per le funzioni organello-specifici.

Le lieviti Saccharomyces condivide cerevisiae un certo numero di meccanismi omeostasi pH con con eucarioti superiori ^2. In gli organelli acide del il pathway endocitica / lisosomiale, pH è controllato in primo luogo dalla altamente conservata vacuolare protone-translocating ATPasi (V-ATPasi), agendo in tandem con molti scamgers dipendenti dal gradiente di di pH. Tutte le cellule eucariotiche hanno anche meccanismi di esportazione protonica. In funghi e piante, un secondo, pompa di protonica distinto a livello della membrana plasmatica, Pma1, le esportazioni protoni metaboliche e si crede di essere il maggiore fattore determinante di pH citosolica e di potenziale di membrana plasmatica. La flessibilità genetica di S. cerevisiae e la sua importanza commerciale, hanno reso esso un modello molto interessante e importante per lo studio pH l'omeostasi ^2.

In Oltre ad essere i driver di primari di organello acidificazione, V-ATPasi di sono altamente regolamentati enzimi di e la il nostro laboratorio di è interessato a meccanismi di regolazione V-ATPasi la comprensione. Verso questo obiettivo, abbiamo sono state utilizzando in misure di pH in vivo di pH vacuolare e di citosolica: 1) a monitorare le risposte al mutevoli condizioni extracellulari, come ad esempio deprivazione glucosio e readdition, 2) ai esaminare gli effetti di mutazioni che compromesso di attività V-ATPasi, e di 3) per esplorare la coordinamento di degli organelli e di al plasma a membrana pompe protoniche ^3-5. Questi esperimenti divennero possibile solo attraverso lo sviluppo di solidi indicatori di pH raziometrici suscettibili di utilizzare in cellule di lievito. . Pianta et al primo luogo ha mostrato che BCECF (2'7'-Bis-(2-carbossietil) -5 - (e 6)-carbossifluoresceina), che è stato usato ampiamente per misurare il pH citosolico in cellule di di mammifero, accumula nel vacuolo lievito anziché il citosol ^6. Questa differenza nella BCECF localizzazione è stata attribuita ad le molte enzimi idrolitici in il vacuolo, che sono probabilmente responsabile per il clivaggio dell'estere metilico acetossi da BCECF-AM (estere acetossimetil di BCECF) e ritenzione vacuolare ^6. Ali et al. ⁷ ulteriormente sviluppato di misura del pH vacuolare usando BCECF e adattati queste misurazioni per un formato di lettore di piastre di fluorescenza. Brett et al. Introdotta lievito pHluorin come un mezzo di misurare pH citosolico in lievito da esprimendo un r plasmide-borneatiometric GFP pH-sensibile al ⁸ sotto controllo di un lievito-specifico promotore ^9.

La spettri di eccitazione di entrambi BCECF e di lievito pHluorin sono sensibili ai pH, in modo da essi sono utilizzati come indicatori di pH raziometrici in cui il rapporto di di fluorescenza presso due lunghezze d'onda di eccitazione, misurati ad una singola lunghezza d'onda di emissioni, fornisce una misura di pH ^8,10. Questi sensori di pH vacuolari e di citosolica di lievito sono stati utilizzati per entrambe le misurazioni a cella singola e di basato sulla popolazione. Misurazioni monocellulari ^6,11 sono eseguite da microscopia a fluorescenza e analisi di immagine. Fluorescenza vacuolar o citosolico presso i due lunghezze d'onda è misurato per ogni cella. Le misurazioni basati sulla popolazione vengono eseguite sia in un lettore di micropiastra con adeguate capacità di fluorescenza o in un fluorimetro. Noi abbiamo generalmente fatto i nostri misurazioni di in un fluorimetro, perché fornisce un facile accesso per aggiunta di componenti di come ad esempio glucosio durante condizionatamisurazioni di cinetiche continuo. I nostri protocolli di di laboratorio attuali per la misurazione di del pH vacuolare e di citosolica sono elencati di qui di seguito; entrambi sono anche facilmente adattati a saggi di per micropiastre.

Protocollo

1. Misurazione del pH vacuolare In Vivo Uso di BCECF-AM

1. Grow un 50 ml coltura liquida del il ceppo di lievito per essere misurato in il supporto desiderato durante la notte. L'obiettivo è di avere le cellule in di fase mid-log (OD600 (densità ottica a 600 nm) la misurazione di approssimativamente 0,8 per la sospensione).
2. A pellet le cellule di lievito per centrifugazione. Risospendere il pellet in 0,6 ml del terreno crescita e trasferimento ad un provetta microcentrifuga che è stato pesato precedenza. A pellet le cellule di nuovo in un microcentrifuga a 2.000 xg per 60 sec. Rimuovere il surnatante il più completamente possibile e poi pesare il pellet di cellule. Risospendere il pellet ad una densità finale di 0,5 g / ml (w / v); una cultura di questo volume vi darà un pellet di cellule di approssimativamente 200 mg, e la 200 microlitri di buffer di sarebbe aggiunto alla dare un volume finale di 400 microlitri.
3. Aggiungere BCECF-AM per la sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 50 mM da un 12 mM magazzino preparata in DMSO. Mescolare bene e poi incUbate le cellule a 30 ° C per 30 min. su una piattaforma dondolo o di tamburo rullo.
4. Mentre le cellule sono incubando, preparare tamponi di calibrazione. Il buffer calibrazione contiene 50 mM MES (2 - (N-morfolino) acid etansolfonico), 50 mM HEPES (4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acid), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 0,2 M acetato ammonio, 10 sodio azide mM, e di 10 mM 2-desossiglucosio, e corretta al fine il pH valori appropriati per il la vostra gamma di calibrazione con NaOH o HCl. (Attenzione: Sodio azide è altamente tossico e deve essere maneggiato con cura.) Per la misura di del pH in cellule di wild-type, ci saremmo preparare parecchi miscele di taratura a pH 5,5 a 6.5, ma per i mutanti attesi di avere una vacuolare pH più alcalino ( vma mutanti), ci saremmo preparare aggiuntivi, tamponi pH più elevati.
5. Aliquotare 2 ml di tampone di di calibrazione per ogni del pH in 15 ml provette coniche, e di aggiungere monensin (15 mM magazzino) e di nigericina (2 mM magazzino) per dare concentrazioni finali di 110 mcM monensin e 15 mM Nigericina, respectively. Mescolare bene su un miscelatore vortex. (Attenzione: Sia la monensin e la nigericina sono tossici e di dovrebbero essere maneggiati con cura.)
6. Quando il tempo di incubazione BCECF-AM è completato, pellet la sospensione cellulare mediante centrifugazione per 30 sec presso 2.000 xg in una microcentrifuga. Risospendere le cellule è di 1 ml di mezzo di crescita carente glucosio e centrifugare come sopra. Ripetere questa fase di lavaggio una volta, e quindi risospendere il pellet in 200 pl di mezzo di crescita senza di glucosio. Posto sul ghiaccio.
7. Aggiungere 20 microlitri della sospensione cellulare a ciascuna provetta calibrazione pH preparato sopra. Incubare a 30 ° C per 30-60 min. su un tamburo rullo.
8. Impostare il fluorimetro per misurare alternativamente presso di eccitazione lunghezze d'onda di 450 nm e 490 nM, entrambi i con una lunghezza d'onda di 535 nm emissione di. Impostare la temperatura camera del campione a 30 ° C. Eseguire tutte le misurazioni con agitazione continua della miscela, in il cuvetta.
9. Aggiungere 1.96 ml su 1 mM MES (regolata a pH 5 o 7 seconda del pH delle crescita di medio delle cellule 'unand il disegno sperimentale). Aggiungere 20 l di sospensione cellulare nella cuvetta. Initiate misure di fluorescenza. Noi raccogliamo entrambi cinetica continuo e di dati tempo di punti d'ancoraggio in differenti esperimenti di. Per dati cinetici continui, prendiamo misurazioni ogni 6 sec per 5 min, quindi aggiungere glucosio per una concentrazione finale di glucosio di 50 mM, e continuare misurazione per 5-10 min. Per le misurazioni singoli di tempo-point, noi generalmente prendiamo misurazioni di presso 1 e di 5 min. dopo aggiunta delle cellule ai della cuvetta, aggiungere glucosio come nelle le misure cinetiche, e poi prendere un'altra misurazione 5 min. dopo addizione glucosio. Queste aggiunte possono essere variate, e componenti addizionali (inibitori, etc) possono anche essere aggiunte.
10. Dopo le misure sperimentali sono completi, togliere le provette di calibrazione da 30 ° C incubazione e trasferire l'intero volume 2 ml per ciascun alla cuvetta fluorimetro. Misurare fluorescenza presso le stesse impostazioni (cfr. 1.8) ogni 5 s sopra un totale di 30 sec per ogni campione.
11. Esportare dati di fluorescenza a Microsoft Excel. (Per il nostro fluorimetro, questo richiede l'esportazione dei dati come testo in forma delimitato da tabulazioni e l'importazione in Excel.) Procurarsi una curva di calibrazione da parte il calcolo del rapporto di di fluorescenza a 490 nm a 450 nm per ciascun miscela di calibrazione. Il rapporto di fluorescenza viene poi tracciata vs pH per ottenere una curva di calibrazione.
12. Convertire i dati sperimentali ai rapporto di fluorescenza e calcolare pH usando la curva standard. PH vacuolar può allora tramato contro tempo (cinetica di modifiche del pH) né confrontato sotto varie condizioni (figura 1) o in differenti ceppi mutanti.

2. Misurazione del pH citosolico In Vivo Uso di Lievito pHluorin

1. Trasforma il ceppo di lievito desiderato con il pHluorin lievito plasmide da parte protocolli standard, e selezionare per la trasformanti su completati minima quantità di terreno uracile carente (SC-uracile).
2. Grow un 50 ml coltura liquida delle cellule trasformate in SC-uracile a di fase mid-log (OD _{600 = 0.8 o inferiore).}
3. Preparare gli standard di calibrazione come descritto per il pH vacuolare, ma buffer di ad una gamma di pH appropriato per misure di pH citosolici, generalmente di pH 6-8. Aliquotare 2 ml di tampone di calibrazione regolata alla pH desiderato in parecchie provette coniche 15 ml. Aggiungi monensin e di nigericina come descritto sopra (1.4) e mescolare bene.
4. Raccogliere le cellule per centrifugazione come descritto sopra, e risospendere il pellet in 600 microlitri della mezzo di crescita. Trasferire in un provetta da microcentrifuga pesato, e le cellule pellet per centrifugazione a 5.000 rpm per 30 sec. Risospendere il pellet in 1 ml di mezzo di crescita senza il glucosio (SC-uracile,-glucosio), le cellule a pellet di nuovo e ripetere. Dopo che il centrifugazione finale, rimuovere il surnatante come a fondo il più possibile e pesare il pellet di cellule. Risospendere celle a una densità finale di 0,5 g / ml in SC-uracile con nessuna glucosio.
5. Aggiungere 20 microlitri di sospensione cellulare a ciascuna provetta di tampone di calibrazione e di mescolare bene su un miscelatore vortex. Incubare a 30 ° C su un rotore tamburo di filatura per 60 min.
6. Impostare up il fluorimetro per la eccitazione a lunghezze d'onda 405 e 485 nm e di un lunghezza d'onda di 508 nm emissione di. Procedere con punto di singola volta o di misurazioni di cinetiche e la aggiunta di glucosio come descritto sopra per la misurazione BCECF.
7. Misurare fluorescenza dei campioni di taratura, e costruire una curva di calibrazione da per BCECF (cfr. 1,10-1,11). Un appezzamento di rapporto di di fluorescenza vs del pH è lineare sopra la gamma di la maggior parte delle misure di pH citosoliche (pH 6.0-8.0) ^9, in modo sperimentali le misure del rapporto di fluorescenza sono facilmente convertiti a pH.

Risultati

La Figura 1 presenta i dati di pH vacuolari ottenuti su cellule di lievito wild-type coltivate in ricco di medie (di lievito estratto di-peptone-destrano; YEPD) memorizzati nel buffer pH 5 con 50 mM MES. Abbiamo Spesso cresciamo le cellule in mezzo tamponato perché il pH del mezzo può cambiare abbastanza drammaticamente durante la crescita durante la notte, particolarmente per terreno minimo, e abbiamo trovato che il pH del mezzo di crescita può influenzare risposte di pH vacuolari ^3. Tutt...

Discussione

Noi abbiamo utilizzato questi protocolli per affrontare un certo numero di gli aspetti della pH omeostasi. Ad esempio, noi abbiamo confrontato le risposte citosoliche e di pH di cellule mutanti wild-type e V-ATPasi-carente ^4,5. Abbiamo inoltre esaminato gli effetti delle condizioni di crescita alterati, di pH particolarmente extracellulare, sulla risposta del pH vacuolare al glucosio ^3. È importante sottolineare che, le risposte che osserviamo sono entrambi coerenti con altri metodi di misurazione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250