Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri

Riepilogo

Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.

Abstract

Molti batteri patogeni intracellulari utilizzare protozoi d'acqua dolce come un serbatoio naturale per la proliferazione nell'ambiente. Legionella pneumophila, l'agente eziologico della legionario 'polmonite, guadagna un vantaggio su di batteri patogeni in vitro in coltura al momento della prima raccolti da cellule protozoi prima infezione di macrofagi mammiferi. Questo suggerisce che i fattori di virulenza importanti non possono essere adeguatamente espresse in vitro. Abbiamo sviluppato un sistema per l'adescamento trattabile L. pneumophila attraverso il suo naturale ospite protozoo Acanthamoeba castellanii prima dell'infezione cellula di mammifero. Il contributo di ogni fattore di virulenza può essere esaminata confrontando la crescita intracellulare di un ceppo mutante di wild-type batteri dopo aver riempito protozoo. GFP che esprimono L. wild-type e mutante ceppi pneumophila sono utilizzati per infettare monostrati protozoi in fase di caricamento, e ha permesso di raggiungere ultime fasi della crescita intracellulare. Batteri fluorescenti vengono quindi raccolte da queste cellule infette e normalizzati per spettrofotometria per generare numeri comparabili di batteri per una successiva infezione in macrofagi mammiferi. Per la quantificazione, batteri vivi sono monitorati dopo l'infezione usando la microscopia a fluorescenza, citometria a flusso, e mediante placcatura colonia. Questa tecnica mette in evidenza e si avvale del contributo della cellula ospite-dipendente l'espressione del gene imitando l'ambiente che si può incontrare in un percorso di acquisizione naturale. Questo approccio può essere modificato per ospitare qualsiasi batterio che utilizza un host intermediario come un mezzo per ottenere un vantaggio patogeno.

Introduzione

Numerosi batteri patogeni si sono adattati strategie generalizzate per sfruttare cellule ospiti per la sopravvivenza e la replicazione in un compartimento intracellulare. In molti casi, i meccanismi patogenetici sono simili tra protozoi e metazoi le cellule. Tuttavia, questi due microambienti sono molto diversi e possono provocare un'espressione differenziale di fattori di virulenza ^1-4. Il batterio della malattia del legionario 'Legionella pneumophila è ubiquitariamente associati agli ambienti d'acqua dolce in tutto il mondo ^5. È importante sottolineare che, L. pneumophila coltivato in cellule protozoarie prima infezione dei monociti umani acquisire un vantaggio patogeno, suggerendo che globali profili di espressione genica del batterio uscita una cella protozoo sono diverse da quella del coltivati ​​in vitro dell'organismo ^6-8. In natura, amebe acqua dolce forniscono nutrienti confini ricchi per l'amplificazione rapida di un batterio invasore. Acquisizione umana della L. pneumophila è spesso attribuita a inalazione di goccioline di acqua contaminata che contengono il batterio. È probabile che queste goccioline porto protozoi cellula batteri associati; dove cellule protozoarie sono più resistenti alle pratiche convenzionali di trattamento delle acque ^9,10. Infezione di macrofagi alveolari polmonari procede in modo quasi identico al ciclo di vita del batterio intracellulare in cellule ospiti protozoi ^11-13.

Per sopravvivere e replicarsi in cellule eucariotiche, L. pneumophila utilizza uno speciale sistema di secrezione di tipo IV ter chiamato Dot / Icm per fornire circa 300 "effettrici" proteine ​​nel citosol della cellula ospite ^14-16. Queste proteine ​​effettrici collettivamente funzionamento per sovvertire processi cellulari per generare un vano permissive per la replicazione del batterio ^17,18. Delezioni in qualsiasi dei 26 geni che costituiscono il Dot / Icm risultato trasportatore in ceppi difettosi per mult intracellulareiplication ^19-23. Storicamente, cancellazione di singoli geni codificanti effettori raramente portato in ceppi attenuati di crescita intracellulare. Questo fenomeno è stato attribuito a diverse ipotesi tra cui la funzione ridondante e copie paralogous di effettori.

Alcuni fattori di virulenza sono espressi solo nel contesto della cellula ospite associata crescita intracellulare ^24. Abbiamo razionalizzato che se un effettore particolare è stato espresso soltanto nel contesto di infezione protozoo, quindi il contributo del effector non può essere confrontato con un ceppo selvatico quando entrambi sono stati coltivati ​​in vitro. L. pneumophila transizioni da un replicativa a una fase trasmissivo, che entra nella fase stazionaria cultura ^25. Il fenotipo di commutazione fase rappresenta l'esaurimento degli elementi nutritivi incontrato durante la crescita intracellulare ed è esemplificata attraverso il montaggio di flagelli per la motilità ^26. Perché L. pneumophila è più invaSIVE e virulenta quando raccolto da cellule protozoi, abbiamo cercato di sviluppare un metodo che più fedelmente rappresentato lo stato patogeno del batterio quando ha incontrato macrofagi host.

A tal fine, abbiamo sviluppato un saggio di adescamento protozoo versatile in grado di ospitare qualsiasi host adatto sia per i primi (cella priming) e la seconda (cella di destinazione) infezioni stadio. Il processo di infezione è trattabile mediante uso di batteri che esprimono stabilmente la proteina fluorescente verde (GFP). Il modello di infezione per il protozoo Acanthamoeba castellanii segue una metodologia ampiamente usato nel campo ^27. Per la fase di caricamento, L. ceppi pneumophila sono coltivati ​​in vitro alla fase stazionaria in mezzi liquidi per produrre etichettati 'trasmissive' batteri (Figura 1A). I batteri vengono quindi utilizzati per infettare monostrati di A. castellanii per 18 ore per ottenere una fase avanzata del ciclo di vita intracellulare. Vacuoli di grandi dimensioni contengonobatteri zione può essere visualizzata a questo punto di tempo utilizzando microscopia a fluorescenza (Figura 1A). Protozoi cellule vengono lisate e batteri recuperati dal lisato sono misurati per l'emissione a 512 nm usando un lettore di fluorescenza piastra. Fluorescenza è correlata con la densità ottica per calcolare molteplicità d'infezione (MOI) per l'infezione di cellule bersaglio (Figura 1, Correlazione * Curve). Dopo ore invasione (T ₀₎ e 18 post-invasione (T _18), le cellule bersaglio sono quantificati per la fluorescenza, che rappresenta i batteri intracellulari. Fluorescenza può essere monitorato mediante microscopia e citometria a flusso, e la conta può essere misurata mediante placcatura colonia. Il test di adescamento è sempre accompagnato da infezioni da wild-type L. pneumophila e un ceppo difettosa in Dot / Icm sistema secrezione di tipo IV (Δ DOTA) (Figura 1A). Ciò fornisce soprattutto controlli interni per i confronti diretti tra wild-type di unnd eventuali ceppi mutanti isogenici utilizzati nel processo di infezione. L'inclusione del ceppo virulento Δ DOTA durante la fase di adescamento imposta una soglia per l'osservazione della crescita attenuati fenotipi associati isogeniche ceppi mutanti che sono coltivate in vitro.

Protocollo

1. Preparazione di Legionella pneumophila Culture per le infezioni della fase di priming

1. Trasforma tutti L. ceppi pneumophila usare nel saggio con le plasmide pAM239, codificante un isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) inducibile proteina fluorescente verde (GFP) ^28. Streak i ceppi batterici sul ferro e cisteina integrato N-(2-acetammido)-2-acido aminoethanesulfonic (ACES) tamponata agar carbone estratto di lievito (CYEA) contenente 6,25 mg / ml di cloramfenicolo (CM) (per manutenzione plasmide) e incubare per 72 hr a 37 ° C.
2. Trasferire un inoculo del ceppo batterico in ACES integrate tamponato estratto di brodo di lievito (AYE) con 6,25 mg / ml CM e 1 mM IPTG e coltivare di fase stazionaria (O / N) su un agitatore orbitale a 37 ° C.
3. Confermare espressione GFP in colture in vitro utilizzando la microscopia a fluorescenza. Trasferire 10 microlitri di cultura su un vetrino sotto una coperturaslip e immagine utilizzando un obiettivo 60X con eccitazione GFP / cubo di emissione (AMG EVOS fl).
4. Diluire un'aliquota di 100 ml di ciascuna coltura in vitro a 1:10 con sterile H ₂ O. Fai il bianco con 100 pl AYE supporti con 1 mM IPTG e 6,25 mg / cm ml e acqua. OD600 prendere misure delle diluizioni utilizzando uno spettrofotometro (Bio-Rad intelligente Spec Plus). Calcolare il volume necessario per infettare un pozzo ad una MOI = 20 per ciascuna coltura in vitro: V = [(ameba seeded) x MOI] / [OD ₆₀₀ x (fattore di diluizione) x (costante)] = [(1 x 10 ⁶ ) x (20)] / [OD ₆₀₀ x (10) x (1 x 10 ^6)] = 2/OD _600. Concentrazione di batteri viene determinato come OD ₆₀₀ = 1.0 = 1 x 10 ⁹ UFC / ml.

2. Adescamento infezione stage utilizzando Acanthamoeba castellanii

1. Mantenere e coltivare le amebe in ATCC 712 medie PYG in 175 cm ² flaconi a temperatura ambiente.
2. Sostituire media in cul amebeture 24 ore prima di iniziare le colture batteriche liquidi. Lo stesso giorno liquido colture batteriche sono avviati, raccogliere e contare le cellule su un microscopio ottico utilizzando un emocitometro.
3. Diluire il amebe con mezzi freschi ad una concentrazione finale di 1 x 10 ⁶ cellule / ml. Seed 12 e piastre di coltura cellulare con aliquote da 1 ml di amebe con un pipettatore a ripetizione ed incubare a RT O / N.
4. Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti delle piastre di coltura cellulare da 12 pozzetti 3x con 1 ml di PBS sterile utilizzando una pipetta 10 ml sierologica e un aiuto pipetta manuale.
5. Dopo l'aspirazione di PBS, aggiungere 1 ml di infezione supporti (ATCC 712 supporti PYG meno glucosio, peptone, estratto di lievito e) con IPTG 1 mM e 6,25 mcg / ml cm a ciascun pozzetto. Incubare le piastre a RT per 1 ora.
6. Infettare pozzetti ad una MOI = 20. Centrifugare la piastra a 400 xg per 5 min (Eppendorf 5810R) e galleggiare in un bagno di acqua 37 ° C per 5 min. Trasferire la piastra ad un 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 18 ore.
7. Confermare le infezioni utilizzando l'imaging dal vivo cella di un microscopio a fluorescenza prima di ospitare la lisi cellulare e la raccolta di batteri.

3. Semina cellule THP-1 per l'infezione fase cella obiettivo

1. (Inizia questo processo 24 ore prima di impostare liquidi colture batteriche). Coltivare cellule THP-1 in un cm 75 ^due fiasche per colture a quasi confluenza in RPMI 1640 con 10% di siero siero fetale bovino (FBS).
2. Contare le cellule in sospensione utilizzando un emocitometro, diluire le cellule THP-1 in RPMI 1640 con 10% di FBS e 100 ng / ml forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule / ml , e la piastra in aliquote da 1 ml su piastre di coltura cellulare da 12 pozzetti. Incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C, 5% di CO _2.

4. Lavorazione dei batteri per infezione fase cella obiettivo dopo l'infezione stage adescamento

1. Aspirare il supporto dal amebe innescato.
2. Lyse l'unamoebae utilizzando 500 pl di ghiaccio freddo, sterile ultra-filtrata (UF) H ₂ O ed incubare a temperatura ambiente per 10 min.
3. Pool I lisati secondo ceppo e prendere una misura E _{512 nm} per ciascuno dei lisati aggregati utilizzando un lettore di piastra di fluorescenza (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).
4. Calcolare un misura ₆₀₀ DO per tutti i lisati pool: calcOD ₆₀₀ = 0,0008 (E ₅₁₂ - sfondo lisato) + 0,0019. La formula è stata precedentemente determinate dal grafico di un confronto diretto sia la DO ₆₀₀ e la E _{512 nm} misure di diluizioni di L. pneumophila GFP di tipo esprimendo fase stazionaria da coltura in vitro (Figura 1 *). I lisati di ameba non infetto, alle stesse condizioni sperimentali l'ameba infetta, sono usati come bianco e fornito un valore di correzione (lisato es sfondo), che è stato accolto nell'equazione. La t volume necessarioo infettare un pozzo ad una MOI = 20 viene calcolato per ciascun pool lisato: V = [(THP-1 seminate) x MOI] / [calcOD ₆₀₀ x (costante)] = [(1 x 10 ⁶⁾ x (20)] / [calcOD ₆₀₀ x (1 x 10 ^6)] = _20/600 calcOD.
5. Lavare le cellule THP-1 3x con PBS e aggiungere 1 ml fresco RPMI 1640 (10% FBS) in ciascun pozzetto. Incubare le cellule THP-1 per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO _2.
6. Infettare le cellule THP-1 al MOI calcolato utilizzando i lisati pool. Permettono una serie di pozzi di rimanere non infetto, serve come controllo negativo per l'analisi citofluorimetrica. Elaborazione dello stadio primer deve essere completato in meno di 30 minuti. I lisati sono tenuti su ghiaccio per limitare eventuali cambiamenti nell'espressione genica batterica prima dell'infezione.
7. Centrifugare la piastra, galleggiare per aumentare la temperatura, e incubare come nella fase di adescamento.
8. Un'ora dopo l'infezione, rimuovere il supporto mediante aspirazione e lavare i pozzetti 3 volte con PBS per rimuovere i batteri extracellulari.
9. Aggiungere 1 ml di fresh RPMI 1640 (10% FBS) ai pozzetti e restituire la piastra al incubatore. Il tempo subito dopo la sostituzione dei supporti serve come tempo zero (T _0). Incubare le cellule THP-1 per 14-16 ore a 37 ° C, 5% di CO _2.

5. Analisi sperimentale

5,1 imaging cellulare in diretta

Immagine i pozzetti infetti utilizzando un microscopio a fluorescenza (AMG EVOS fl) a 10X o 20X di ingrandimento (Figure 1A-D). Le immagini possono essere confrontati qualitativa o quantitativa per determinare i livelli di infezione sia in fase di innesco e di destinazione infezioni stadio cellulari.

5,2 Citometria a flusso

1. I picchi di emissione di diverse infezioni possono essere confrontati mediante citometria a flusso (BD FACS Calibur). Tripsinizzare gli infetti cellule THP-1 e delicatamente di lavaggio dai pozzetti mescolando in PBS con una pipetta.
2. Piscina le cellule tipo versare in 15 ml Falcon tubi e pellet a 1.800 xg per 2min nella centrifuga piano del tavolo.
3. Sospendere il pellet in 1 ml di PBS e trasferire ai tubi microcentrifuga da 1,5 ml.
4. Centrifugare le sospensioni a 1.800 x g (Eppendorf 5424) e risospendere il pellet in 1 ml di PBS. Se le sospensioni risultanti sono altamente torbidi (OD ₆₀₀ ≥ 1,0) devono essere diluiti in PBS supplementare (1:3) per impedire l'intasamento delle linee del citofluorimetro.
5. Utilizzare sterile filtrata PBS per l'equilibramento della citometria a flusso e per le fasi di lavaggio tra le iniezioni del campione. Tracciare l'avanti / lato dispersione di cellule bersaglio infettate prima iniezione di campioni di cellule bersaglio di infezione.
6. Raccogliere 20.000 eventi totali per ogni condizione con 488 nm di eccitazione laser e il canale FL1.
7. Porta post-acquisizione popolazioni cellulari di escludere le cellule non infette e l'intensità trama fluorescenza in un istogramma (FlowJo) (Figura 1E).

5,3 CFU placcatura

1. Esaminare l'efficienza of infezione mediante placcatura CFU delle cellule raccolte per citometria a flusso. Preparare diluizioni seriali dei campioni in ultra-filtrata H ₂ O a 10 ^-1, 10 ^-2 e 10 ^-3.
2. Piastra 20 pl di ciascuna diluizione su 1/3 di una piastra CYEA con 6,25 mg / ml CM.
3. Incubare le piastre a 37 ° C per 72 ore.
4. Contare le colonie con uno stuzzicadenti e contatore di cellule.

Risultati

Un risultato tipico per l'intero processo di infezione è descritto nella Figura 1. Vivo delle cellule al microscopio a fluorescenza che raffigurano monostrati di A.castellanii infettati con wild-type L. pneumophila durante la fase di adescamento è mostrato nella Figura 1A. Una misura di successo della fase di caricamento porterebbe ad una popolazione di circa il 90% delle cellule ospiti contenenti grandi vacuoli popolate con batteri GFP etichettati in questo MOI....

Discussione

Espressione genica batterico è strettamente controllata mediante una combinazione di progressione del ciclo di vita e di risposta ai segnali nel microambiente circostante. Vacuolare patogeni come L. pneumophila rispondere a una moltitudine di cellula ospite derivati ​​spunti quando compartimenti stagni in un phagosome. Come risultato collettivo di esaurimento nutrienti nella cellula ospite, il batterio compensa esprimendo fattori richiesti per diffusione successo ad una cellula ospite successivo ^25.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes