Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Riepilogo

Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.

Abstract

Iniezione intraparenchimale di un vettore virale consente la manipolazione condizionale gene in distinte popolazioni di neuroni o regioni specifiche del sistema nervoso centrale. Dimostriamo una tecnica stereotassica iniezione che permette l'espressione del gene bersaglio o silenziamento nel corno dorsale del midollo spinale del mouse. La procedura chirurgica è breve. Richiede laminectomia di una singola vertebra, che prevede il recupero rapido dell'animale e motilità perfetta della colonna vertebrale. Iniezione controllata di un piccolo volume di sospensione vettore a bassa velocità e l'uso di una cannula microsiringa con vetro smussato minimizzare la lesione tissutale. La risposta immunitaria locale al vettore dipende dalle proprietà intrinseche del virus impiegati, nella nostra esperienza, è minore e di breve durata, quando un ricombinante adeno-associated virus viene utilizzato. Un gene reporter come migliore proteina fluorescente verde facilita distribuzione spaziale monitoraggio del vettore, e l'efficacia e cellulare specificity della trasfezione.

Introduzione

Le tecnologie avanzate di manipolazione genica condizionale nel topo consentono molteplici approcci per l'esplorazione di sinapsi e collegamenti funzionali del sistema nervoso centrale. Transgeni può essere regolata da piccole molecole come effettori doxiciclina agenti su un transattivatore della tetraciclina controllato, che può essere progettato per funzionare come un repressore o un attivatore della trascrizione genica, o tamoxifene riconoscere un mutato ligando dominio di legame del recettore di estrogeno ¹ . Modifica irreversibile transgene è comunemente ottenuto da acido desossiribonucleico (DNA) ricombinasi. Cre (ricombinazione cause) e Flp (enzima ricombinazione flippase) catalizzare l', inversione escissione o la traslocazione di frammenti di DNA che vengono affiancati da loxP (luogo di x crossing over, P1) o Frt (target riconoscimento flippase) siti, rispettivamente, ^1. Le applicazioni includono l'attivazione del gene o silenziamento inducibile e acido ribonucleico (RNA) ingerenza ^{2. Espressione condizionale reporter fluorescente o enzimatica come β-galattosidasi o fosfatasi alcalina può essere usato per etichettare neuroni ed esaminare la loro organizzazione topica e connettività 3. Grandi progetti di mutagenesi in Nord America ( http://www.norcomm.org/index.htm ) e in Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) producono librerie di cloni di cellule staminali embrionali di topo con obiettivi gene condizionali e le trappole che alla fine coprono l'intero genoma del mouse. Topi generati da questi cloni possono essere attraversata con un numero crescente di topi che esprimono ricombinasi DNA sotto promotori o loci specifici per una particolare popolazione di neuroni di manipolazione genica selettiva ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).}

Tuttavia, limitando la manipolazione genetica di popolazioni distinte di neuroni o regioni particolari di interesse non può essere ottenuto genetica mira solo se un promotore specifico per la popolazione neurone di interesse non è noto o non espresso da tutti i neuroni della regione di interesse. Nel midollo spinale, disegni sperimentali possono richiedere restrizione spaziale della manipolazione genetica di uno o due segmenti cranio-caudale. Iniezione stereotassica di un vettore virale che esprime Cre o Flp consente di limitare ricombinazione genica per regioni nel midollo spinale di topi in cui si affiancano frammenti di DNA da loxP o siti FRT, cosiddetti alleli floxed o flrted. A differenza di riarrangiamenti del DNA costitutivo, con la conseguenza di incroci animali con topi che esprimono ricombinasi, questa strategia consente anche il controllo temporale su attivazione genica o silenziamento. Vettori virali codificanti floxed o flirtato transgeni offre un'opzione di inversione di manipolazione del gene nei topi esprimere la corresponding valle ricombinasi di un neurone-specifica promotore. Diversi vettori ricombinanti con affinità per i neuroni sono disponibili ^4. Alta capacità (gutless) adenovirus, virus adeno-associati, virus dell'herpes simplex e lentivirus sono comunemente utilizzati vettori neurotropici. Selezione del virus appropriato per una domanda di ricerca è una parte cruciale del disegno sperimentale. Dimensione del transgene, percorso di consegna, specificità dell'infezione di neuroni a differenza di cellule gliali, efficacia infezione, effetti collaterali tossici infiammatori e devono essere considerati ^4.

Qui descriviamo l'iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale del midollo spinale, una tecnica che usiamo per la regolazione genica condizionale nella nostra ricerca sulla neurobiologia del dolore. Il corno dorsale riceve l'input afferente da primari neuroni somatosensoriali inclusi i neuroni nocicettivi. Interneuroni locali elaborare le informazioni prima di neuroni di proiezione che trasmettono dail corno dorsale al cervello ^5. Dimostriamo l'infezione di neuroni del corno dorsale a livello segmentale spinale L4 con neurotropico ricombinante virus adeno-associato (rAAV) che esprime migliorato proteina fluorescente verde (EGFP) sotto un promotore di citomegalovirus costitutivamente attivo.

Protocollo

La procedura chirurgica descritta è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) della Columbia University.

1. Preparazione delle apparecchiature e delle particelle sospensione di virus

1. Pulire e disinfettare le attrezzature, sterilizzare gli strumenti chirurgici e le punte notch V che verranno utilizzati per fissare vertebra L1.
2. Tirare e pipette di vetro conici. Usiamo pipette che hanno un diametro di punta di 40 micron e sono smussati con un angolo di 20 °. Sterilizzare le pipette di vetro.
3. Impostare il telaio stereotassico, montare l'iniettore microsiringa sulla manipolatore e collegare l'iniettore al controllore.
4. Collegare una delle pipette di vetro per la microsiringa utilizzando il kit di raccordo a compressione.
5. Rimuovere lo stantuffo dalla microsiringa e riempire la siringa con olio minerale. Oil Red O (1 - (2,5-dimetil-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenilazo)-2-naftolo) può essere aggiunto al olio minerale per aumentare la sua visibility. Reinserire lo stantuffo e spingerla per tutta la strada fino alla punta. Accuratamente evitare di creare una bolla d'aria.
6. Preparare la sospensione di particelle di virus in un armadio biosicurezza. Scongelare il virus congelato su ghiaccio e, immediatamente prima dell'uso, diluire con sterile PBS alla concentrazione di particelle desiderato.
7. Inserire la microsiringa nel supporto dell'iniettore.
8. Pipettare 5 microlitri della sospensione di virus su un foglio di plastica, ad esempio Parafilm. Abbassare la punta della pipetta di vetro nella goccia e tirare lo stantuffo per riempire la microsiringa. Creare una piccola bolla d'aria sulla punta della pipetta per evitare che si intasi.

2. Laminectomia

1. Preparare l'area di intervento pulendo panchina e piastra elettrica con disinfettante.
2. Anestetizzare il mouse. Usiamo l'anestesia per inalazione con isoflurano (3% durante l'induzione, 2% -3% durante la manutenzione).
3. Posizionare lubrificante su ciascun occhio per proteggere gli occhi dalla disidratazione durante l'funzionamento.
4. Accorciare il pelo della schiena al collo del mouse e disinfettare la pelle con salviette alternata di un antisettico topico come clorexidina o polivinilpirrolidone-iodio e il 70% di etanolo. Isolare il sito in modo asettico preparato con telo chirurgico e infiltrarsi nel sito di incisione con bupivacaina (0,25%, diluito 1:10 con soluzione fisiologica).
5. Incidere la pelle all'estremità caudale della gabbia toracica lungo la linea mediana (2-3 cm) e separare la fascia che copre la colonna vertebrale.
6. Poiché il midollo spinale smette di crescere in precedenza durante lo sviluppo postnatale rispetto alla colonna vertebrale, segmento spinale L4 si trova sotto la prima vertebra lombare (L1). Vertebra L1 si trova caudalmente alla vertebra che contiene l'ultimo paio di costole. Ed esporre vertebra L1, eliminando i piccoli muscoli della colonna vertebrale e dei legamenti attaccati alla superficie dorsale.
7. Sollevare leggermente e tenere premuto L1 vertebra con una pinza Adson. Utilizzare una pinza laminectomia dedicato per rimuovere la dorsale portion della vertebra (colonna vertebrale e lamina) ed esporre il midollo spinale. Evitare di danneggiare il midollo spinale.
8. Trasferire il mouse sulla piastra riscaldante nel telaio stereotassico. Monitorare la temperatura del mouse durante la successiva operazione.

3. Iniezione

1. Fissare vertebra L1 con punte tacca V. Le punte devono stabilizzare la colonna in modo che la vertebra non si sposta durante la respirazione.
2. Portare il microsiringa più vicino in modo che la punta della pipetta è al di sopra del sito di laminectomia. Abbassare lo stantuffo fino a visualizzare la sospensione di virus in uscita la pipetta. Rimuovere la goccia con la punta di cotone sterile.
3. Posizionare la punta della pipetta in più a parte rostrale del midollo spinale esposto. Centro la pipetta sopra il solco posteriore mediana, quindi spostare la punta 500 pm lateralmente. Abbassare la punta sulla superficie del cavo e la puntura della dura madre o, se si lavora con una pipetta di vetro unbeveled, utilizzare una cannula smussata in acciaio per forare il dura. Abbassare la punta della pipetta di vetro 300 micron nel midollo spinale.
4. Iniettare 1 ml di sospensione di virus a una velocità di 200 nl / min.
5. Al termine dell'iniezione, attendere almeno 2 minuti prima lentamente ritraendo la pipetta.
6. Ripetere i passaggi 3,3-3,5 al-caudale più porzione del midollo spinale esposta per ottenere una distribuzione completa del vettore virale in L4 segmento spinale. I due siti di iniezione si trovano rostrale e caudale del segmento L4, per evitare danni ai tessuti nella regione di destinazione.

4. Chiusura della ferita

1. Rilasciare vertebra L1 dalle fascette tacca le V e togliere il mouse dal telaio stereotassico.
2. Suturare la fascia con 5,0 Vicryl. La fascia chiuso prevede la copertura per il sito laminectomia.
3. Chiudere la pelle con punti di sutura in nylon o graffette chirurgiche.

5. Cura postoperatoria

1. Trasferire il mouse a una gabbia di recupero con morbido, biancheria da letto nonparticular. Mettere sul tegli laterali per la respirazione confortevole. Monitorare l'animale fino a quando non è completamente vigile, ambulatoriale e inizia a bere.
2. Forniamo analgesia post-chirurgica per 72 ore al giorno con iniezioni sottocutanee di carprofen (5,0 mg / kg).
3. Monitorare il recupero post-chirurgico mediante ispezione giornaliera per i primi 3 giorni, poi a giorni alterni o 3 giorni a settimana fino a quando l'esperimento è completo.
4. Rimuovere le suture cutanee o graffe 7 a 10 giorni dopo l'operazione, quando la guarigione della ferita è completa.
5. Euthanize l'animale al termine dell'esperimento.

Risultati

Rendimenti di trasfezione di successo l'espressione genica robusta nei neuroni del corno dorsale iniettato (Figura 1), risparmiando il corno dorsale del lato controlaterale, il corno ventrale e gangli delle radici dorsali.

Figura 1. La trasfezione di neuroni del corno dorsale. (A) Espressione della EGFP reporter fluorescente (verde) nel corno sinistro dorsale del midollo spinale L4, ...

Discussione

Iniezione stereotassica vettore permette il targeting neuroni del midollo spinale per applicazioni come la mappatura della rete neuronale basata sul virus transsynaptic diffondere ^6,7 o dissezione optogenetic ^8, la guida durante la rigenerazione assonale da lesioni ^9,10, o la terapia genica per la prevenzione o il trattamento di neurodegenerazione ^{11, 12.} Vettori virali sono stati utilizzati per la manipolazione del gene nel midollo spinale di studiare somatosensoriali, motori...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del materiale	Azienda	Numero di catalogo
Piastra di base della colonna vertebrale	David Kopf Instruments	912
Piccolo animale strumento stereotassico	David Kopf Instruments	900
Mouse gas anestesia testa porta	David Kopf Instruments	923-B
Supporti di base regolabili	David Kopf Instruments	982
V notch picchi	David Kopf Instruments	987
Piccolo animale temperatura del sistema di controllo	David Kopf Instruments	TCAT-2LV
Adson forcipe	Strumenti Scienza Belle	11006-12
Laminectomia pinza	Strumenti Scienza Belle	11223-20
UltraMicroPump (uno) con SYS-Micro4 controller	Mondo Strumenti di precisione	UMP3-1
Microsiringa, 65RN	Hamilton	7633-01
RN raccordo a compressione, 1 mm	Hamilton	55750-01
Vetro borosilicato capillari	Mondo Strumenti di precisione	1B100F-4
Microgrinder	Narishige	EG-44