Microscopia correlativa per l'analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Riepilogo

Descriviamo un metodo di microscopia correlativa che combina 3D live-cell microscopia a luce fluorescente ad alta velocità e la tomografia crio-elettroni ad alta risoluzione. Dimostriamo la capacità del metodo correlativo di imaging dinamico, piccoli HIV-1 particelle interagiscono con le cellule HeLa ospitanti.

Abstract

Tomografia crio-elettroni (cryoET) permette la visualizzazione 3D delle strutture cellulari a risoluzione molecolare in uno stato prossimo al fisiologico ^1. Tuttavia, visualizzazione diretta dei singoli complessi virali nel loro ambiente cellulare ospite con cryoET è impegnativo ^2, a causa della natura infrequenti e dinamica di ingresso del virus, in particolare nel caso di HIV-1. Mentre time-lapse live-cell imaging ha prodotto una grande quantità di informazioni su molti aspetti del ciclo di vita del virus HIV-1 ^3-7, la risoluzione offerta dalla microscopia live-cell è limitata (~ 200 nm). Il nostro lavoro è stato finalizzato a sviluppare un metodo di correlazione che permette la visualizzazione diretta di eventi precoci di infezione da HIV-1, combinando live-cell a fluorescenza microscopia ottica, microscopia a crio-fluorescenza, e cryoET. In questo modo, i segnali cellule vive e crio-fluorescenti possono essere usate per guidare con precisione il campionamento in cryoET. Inoltre, le informazioni strutturali ottenute da cryoET può be integrato con i dati funzionali dinamici acquisita attraverso live-cell imaging di fluorescenza bersaglio marcato.

In questo articolo video, forniamo i dettagli sui metodi e protocolli di indagine strutturale del virus HIV-1 e interazioni ospite-cellulari utilizzando 3D live-cell imaging ad alta velocità correlativo e ad alta risoluzione cryoET analisi strutturale. Cellule HeLa infettate con HIV-1 particelle sono stati caratterizzati in primo luogo dalla microscopia confocale live-cell, e la regione che contiene la stessa particella virale è stata poi analizzati mediante tomografia crio-elettroni per i dettagli strutturali 3D. La correlazione tra le due serie di dati di imaging, imaging ottico ed elettronico di imaging, è stato realizzato utilizzando una fase microscopio ottico a fluorescenza crio-casa-costruita. L'approccio qui descritto sarà prezioso, non solo per lo studio delle interazioni delle cellule virus-ospite, ma anche per applicazioni più ampie in biologia cellulare, come la segnalazione cellulare, il traffico di recettore di membrana, e molti altri processi cellulari dinamici. </ P>

Introduzione

Tomografia crio-elettroni (cryoET) è una tecnica di imaging potente che permette a tre dimensioni (3D) visualizzazione di cellule e tessuti e fornisce approfondimenti nell'organizzazione di organelli nativi e strutture cellulari a risoluzione molecolare in un close-to stato fisiologico ^1. Tuttavia, il contrasto di intrinsecamente bassa macchia preparato congelato-idratato, combinata con la loro sensibilità alle radiazioni, rende difficile individuare aree di interesse all'interno di una cella e successivamente eseguire con successo la serie di inclinazione senza danneggiare l'area bersaglio. Per superare questi problemi, un approccio correlativo che combina microscopio ottico ed elettronico è necessario. Caratteristiche specifiche evidenziate dalla marcatura fluorescente vengono identificati e localizzati al microscopio ottico a fluorescenza, e quindi le loro coordinate sono trasferiti al microscopio elettronico per l'acquisizione dei dati strutturali resolution 3D elevate. Questo metodo correlativo aiuta localizzare il bersaglio unaReas di interesse da affrontare. A causa della limitazione dello spessore del campione con cryoEM (<300 nm), attualmente solo le regioni periferiche della cellula sono adatti per l'analisi strutturale 3D da CryoET. Riducendo ulteriormente lo spessore dei campioni congelati-idratato vitreo sezionamento ⁸ o da crio-fascio ionico focalizzato (FIB) fresatura ⁹ sarebbe espandere la capacità di rappresentazione correlativa.

In precedenza, i metodi correlativi sono stati utilizzati principalmente per facilitare l'acquisizione dei dati cryoET per grandi e statico delle strutture ^10-13. In questi studi, sono stati implementati crio-fasi di accettare griglie cryoEM e sta su sia un microscopio verticale o di un microscopio invertito ^10,11,14. Anche se il passaggio griglie sembra abbastanza semplice nei loro disegni, ci sono ulteriore trasferimento di passaggi necessari per la griglia EM, aumentando la probabilità che la griglia può essere deformato, danneggiato e contaminato. Abbiamo recentemente dimostrato un progresso tecnico inmicroscopia correlativa che ci permette di visualizzare direttamente gli eventi dinamici che sono per loro natura difficili da catturare, come l'HIV-1 e le interazioni delle cellule ospiti nelle fasi iniziali di infezione ^15. Abbiamo compiuto questo attraverso la progettazione e l'attuazione di una fase di campionamento crio-microscopia luce che si adatta un sistema a cartuccia per ridurre al minimo i danni del campione a causa di manipolazione della rete, facilitando così la correlazione. Il nostro design include un supporto integrato della cartuccia campione, consentendo sia crio-microscopia luce e crio-elettroni da eseguire, in sequenza, sullo stesso supporto del campione, senza trasferimento del campione, semplificando così il processo correlativo. Inoltre, abbiamo anche implementato una procedura di correlazione precisa e affidabile utilizzando fluorescenti sfere di lattice come marker fiduciali.

Protocollo

1. HeLa Cell Culture on Carbon-rivestito, Oro EM Finder Grids

1. Scarica luminescente il carbonio-lato di un R2 da 200 maglie / 2 Quantifoil oro EM griglia finder sotto i 25 mA per 25 sec.
2. Rivestire la griglia EM con fibronectina, da galleggianti che, carbonio rivolto verso il basso, su un 40 microlitri goccia di 50 mg / ml soluzione fibronectina, poi disinfettare sotto luce UV per 2 ore in una cappa di coltura di tessuti.
3. Piastra cellule HeLa sulla griglia ad una densità di 2 x 10 ⁴ cellule / ml (totale 2 cultura ml) in un piatto fondo di vetro cultura e crescere le cellule a 37 ° C, con il 5% di CO _2, in DMEM supplementato con 4,5 g / L di L-glutammina e glucosio, 10% di siero fetale di vitello siero, 100 unità / ml di penicillina, e 100 pg / ml streptomicina, per circa 18 ore. Cellule HeLa sono infettate dopo coltura O / N.

2. HIV-1 e live-cell imaging

1. Aggiungi un tracker cellula fluorescente (Red CMTPX, 1 ml / 2 ml) nella cultura con fondo di vetropiatto (dal punto 1.3) e incubare il piatto a 37 ° C per 10 minuti, per consentire up-take del colorante fluorescente.
2. Lavare le cellule con PBS e aggiungere 50 microlitri mezzo fresco pre-riscaldato.
3. Porre la capsula sulla camera di live-cell, a 37 ° C, di un Campo sweep microscopio confocale a scansione. Selezionare più campi (10-15 posizioni) che contengono 1-3 cellule / quadrati, con le celle tra due fasi di mitosi, quando sono più spread-out e piatta (vedi figure 2c e 2d), dal momento che richiede cryoEM regioni relativamente sottili di campione. Conservare queste posizioni per il futuro di imaging (passo 2.5).
4. Infettare le cellule con VSV-G pseudo-tipizzate HIV-1 particelle contenenti GFP-Vpr (usiamo 40 pl di un campione contenente 40 ng / ml di p24). Quando aggiungendo le particelle del virus nel fondo del piatto, fare attenzione a non disturbare la griglia EM, poiché le posizioni per l'imaging sono già stati selezionati e memorizzati.
5. Subito dopo l'aggiunta di virioni, raccogliere TIme-lapse ad alta velocità immagini confocali 3D, nelle posizioni precedentemente selezionati (dal punto 2.3) per 20-40 min.
6. Immagini confocali sono state acquisite utilizzando MetaMorph e analizzati dal automatizzato di monitoraggio di particelle 3D per la dinamica delle particelle singole utilizzando il software Imaris (vedere Figura 1). Dal momento che stiamo correlando il comportamento dinamico di diffrazione limitata HIV-1 particelle con ultrastruttura cellulare, time-lapse live-cell imaging e il monitoraggio delle particelle 3D sono fondamentali per il risultato. Tuttavia, per una struttura grande e statico, una semplice immagine di fluorescenza (senza live-cell) sarebbe sufficiente per l'analisi correlativa.

3. Frozen-idratato EM Preparazione del campione

Per ridurre al minimo l'intervallo di tempo tra la raccolta dell'ultima immagine confocale e crio-fissazione del campione, la FEI Vitrobot (o altro dispositivo di vetrificazione) deve essere iniziato e preparato per immersione-congelamento durante la raccolta di immagini di fluorescenza live-cell confocale.

1. Accendere il dispositivo vetrificazione e impostare la temperatura clima a 22 ° C, il bersaglio umidità al 100%, il tempo blotting a 7 secondi, e l'attesa e drenare il tempo di 1 sec.
2. Posizionare il contenitore griglia nel stantuffo dewar e preparare etano liquido freddo. Montare il dewar sul dispositivo vetrificazione.
3. Subito dopo il live-cell imaging confocale (sezione 2), posizionare il piatto di coltura su un blocco di rame raffreddato a ghiaccio e trasferirlo alla sala di preparazione del campione cryoEM. Caricare la griglia EM sulle pinzette specializzati e rapidamente asciugare lontano qualsiasi supporto sulla griglia. L'assorbente è manuale, con carta da filtro, dopo che 4 ml di soluzione di 15 nm perline oro mescolato con 0,2 micron microsfere fluorescenti vengono immediatamente immessi in rete. Le perle oro usati come marcatori fiduciali per aiutare raccolta dati tomografici e allineamento. Le microsfere fluorescenti sono utilizzati per aiutare correlazione tra le immagini fluorescenti e cryoEM (Cfr. Figure 2c-2F).
4. Caricare le pinzette sul dispositivo vetrificazione e istruire il dispositivo per cancellare e immergersi congelare in etano liquido ^16. I parametri blotting ottimizzati per ottenere risultati migliori sono: tempo di macchia, 7 sec; macchia offset, 0, tempo di scarico, 1 sec, temperatura, 22 ° C, e l'umidità, al 100%.
5. Trasferire la griglia frozen-idratato ad un supporto per l'imaging cryoEM cryoET immediato, o ad un dewar di azoto liquido stoccaggio per un uso successivo.

4. Cryo-microscopia a fluorescenza luce

È necessario un sistema di home-built, camera campione crio-fluorescenza e fase (Figura 3) per effettuare passaggi 4,1-4,10. Le specifiche dettagliate e descrizione della fase possono essere trovati in giugno et al. ^15.

1. Riempire un auto-pressione di azoto liquido dewar di azoto liquido, almeno 2 ore prima di iniziare la microscopia ottica crio-fluorescenza (vedi Figura 3a).
2. Montare un autocostruito crio-fFase campione luorescence ¹⁵ (figura 3) su un microscopio a fluorescenza invertito, come ad esempio una Olympus IX 71.
3. Collegare l'ingresso di azoto liquido della fase di crio-campione per la auto-pressione dewar e posizionare la presa di protezione troppo pieno di azoto liquido in un contenitore idoneo. Collegare una linea di gas azoto secco a un manicotto posto sopra la lente obiettivo una lente caldo e dal gelo.
4. Posizionare una piattaforma di blocco di rame (freccia nera nella figura 3b) nella camera di crio-stadio per il caricamento della griglia campione congelato-idratato. Raffreddare e riempire la camera del crio-stage in rame con azoto liquido attraverso la linea di ingresso dalla auto-pressione di riempimento dewar.
5. Quando la crio-stadio raggiunge la temperatura dell'azoto liquido (in ~ 4-6 min), trasferire il contenitore griglia (dal punto 3.5) per la crio-stage.
6. Posizionare la griglia campione congelato-idratato nella cartuccia campione EM sul blocco rame e clip la gliberati in posizione utilizzando un anello a C (se si utilizza una cartuccia Polara microscopio), o posizionare un anello di rame pre-raffreddata in cima (nero punta di freccia in Figura 3d), per mantenere la griglia in posizione e anche per un facile recupero della griglia dopo crio-imaging di fluorescenza (se per un non-Polara crio-microscopio elettronico).
7. Posizionare la cartuccia (dal punto 4.6) nella camera interna del crio-stadio (bianco punta di freccia in Figura 3b).
8. Cerca e trova le stesse particelle di virus dai dati live-cell imaging. Poiché la griglia EM ha un indice, è semplice per localizzare la stessa particella in griglia in entrambe le immagini dal vivo di cellule e immagini crio-florescence.
9. Acquisire crio-DIC e immagini GFP nelle posizioni individuate in crio-condizione utilizzando un microscopio ottico con un lungo lavoro (2,7-4 mm) lente dell'obiettivo. Durante la rappresentazione crio-fluorescenza, controllare periodicamente il livello di azoto liquido nella crio-stadio e riempirlo, se necessario, per mantenere la fase di esempio -170° C.
10. Al completamento di crio-imaging di fluorescenza, riportare accuratamente la cartuccia campione alla piattaforma di blocco rame e conservare la cartuccia in un dewar di azoto liquido per future analisi cryoET con un sistema Polara. Se si utilizza un non-Polara crio-microscopio elettronico, rimuovere l'anello di rame, recuperare la griglia del campione, trasferirli in un contenitore griglia, e conservare il campione in un liquido di azoto dewar fino a quando il campione viene esaminato da cryoET.
11. Per l'analisi dei dati, sovrapporre le immagini crio-DIC e GFP acquisite (dal punto 4.9, vedere la Figura 4b) e correlare le posizioni dei segnali GFP nell'immagine crio-fluorescenza con quelli ottenuti nella serie live-cell imaging.

5. Crio-elettroni tomografia

1. Caricare la cartuccia campione nella stazione crio-trasferimento di un microscopio elettronico equipaggiato con una pistola ad emissione di campo, come ad esempio G2 Polara microscopio.
2. In modalità a basso dosaggio di ricerca con un ingrandimento di 140X, identify e salvare i quadrati della griglia associati (dal punto 4.11) in un file di scena.
3. In modalità a basso dosaggio di ricerca con un ingrandimento di 3500 X, inserire un 100 micron obiettivo diaframma, ricerca e salvare tutte le posizioni correlate con segnali GFP in un secondo file palco.
4. In modalità a bassa dose di esposizione, trovare un'area vuota per regolare l'intensità del fascio ad una dose di 1 o 2 e ^- / A ² e perfezionare l'asse di inclinazione, utilizzando la funzione y palco, bruciando via il ghiaccio in una regione di carbonio senza importanza con diverse perline d'oro.
5. In modalità bassa dose-fuoco, regolare la distanza di messa a fuoco per ~ 3 micron e regolare l'angolo di allineare la direzione di messa a fuoco per essere parallelo all'asse di inclinazione.
6. In modalità a basso dosaggio di ricerca, recuperare posizioni salvate (dal punto 5.3), regolare l'altezza eucentrica campione e controllare il range di inclinazione per l'area di interesse. Acquisire un'immagine di proiezione con una bassissima dose di elettroni (~ 1 e ^- / a ²⁾ a 8 a 10 micron di sfocatura, in manifestazionimodalità ure, per confermare le particelle del virus correlate per tomografia crio-elettroni.
7. Passare alla modalità a basso dosaggio-focus. In TEM menù automatico funzioni, precedere l'altezza eucentrica automatizzato e concentrare le funzioni di messa a fuoco.
8. Impostare i parametri per l'acquisizione di un tilt-serie. Per la figura 4 in questo lavoro, angoli di inclinazione che vanno ± 70 °, al di sotto e al di sopra di 45 °, al 3 ° e 2 ° di inclinazione con incrementi, rispettivamente, sono stati utilizzati, con un 6 micron defocus e circa 70 e ^- / A ² dose totale.
9. Ripetere i passi 5.7 e 5.8 per tutte le posizioni salvate. Software Batch tomografia può essere utilizzato per la raccolta dati automatizzata per più posizioni per aumentare il throughput.

6. Ricostruzione tridimensionale utilizzando IMOD ¹⁷

1. Ispezionare la serie tilt crudo per regolare i valori minimi e massimi di densità e di determinare se vi è alcun fine di essere esclusi a causa della grande spostamento dell'immagine.
2. Avviare eTomo e pannello tomogramma configurazione utilizzando tipo di asse, dimensioni in pixel, diametro fiduciali, ecc. Poi creare script com.
3. Configurare la finestra principale in modo tale che le varie fasi del calcolo tomogramma possono essere regolati / seguite contemporaneamente. Modificare i parametri necessari ed eseguire i programmi specifici che sono necessari per ogni fase di lavorazione (vedi eTomo esercitazione, http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ).
4. Nella fase finale, creare uno stack completo allineata (con un errore medio residuo inferiore a 0,6) e ricostruire tomogrammi utilizzando un algoritmo di retroproiezione ponderata in IMOD.
5. Denoising potenziali aree di interesse con un programma 3D non lineare anisotropa diffusione bordo migliorando implementato in IMOD con i parametri appropriati per migliorare il contrasto e la nitidezza.

Risultati

Per caratterizzare il comportamento dinamico delle particelle del virus, cellule HeLa infettate con HIV-1 sono state ripreso mediante microscopia confocale live-cell ad alta velocità ed i movimenti delle particelle sono state analizzate mediante rilevamento automatizzato particella 3D (Figura 1). Per evitare che il lasso di tempo di alcuni minuti che si possono verificare tra raccolta dell'ultima immagine live-cell confocale e tuffo di congelamento (che può essere abbastanza a lungo per perdere co...

Discussione

Abbiamo presentato una serie di semplici protocolli di fornire un approccio correlativo avanzato per analizzare gli eventi cellulari dinamici usando time-lapse imaging di fluorescenza confocale, live-cell seguita da cryoET. Il nostro sviluppo metodologico di correlare 3D live-cell imaging ad alta risoluzione cryoET è fondamentale per studiare molti problemi biologici complessi, come ad esempio la visualizzazione (non statico, come riportato in precedenza) e diffrazione di particelle rare, dinamiche limitate virali e le...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.