Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi

Riepilogo

Procedure su micropiastra sono descritte per l'analisi colorimetrica o fluorimetrica dell'attività enzimatica extracellulare. Tali procedure consentono la rapida saggio di tale attività in un gran numero di campioni ambientali in tempi gestibile.

Abstract

Gran parte del ciclo dei nutrienti e lavorazione del carbonio in ambienti naturali avviene attraverso l'attività degli enzimi extracellulari rilasciati da microrganismi. Così, misurazione dell'attività di questi enzimi extracellulari può dare intuizioni aliquote di processi livello dell'ecosistema, quali la decomposizione della materia organica o azoto e fosforo mineralizzazione. I saggi di attività enzimatica extracellulare nei campioni ambientali tipicamente coinvolgono esponendo i campioni a substrati colorimetrici o fluorimetrici artificiali e il monitoraggio del tasso di idrolisi del substrato. Qui si descrivono i metodi su micropiastra per queste procedure che consentano l'analisi di un gran numero di campioni in un breve lasso di tempo. I campioni vengono lasciati reagire con substrati artificiali entro 96 pozzetti o pozzo profondo blocchi micropiastre, e l'attività enzimatica viene successivamente determinati mediante assorbimento o fluorescenza del prodotto finale risultante utilizzando un tipico Reade micropiastrar o fluorimetro. Tali procedure ad alto rendimento facilitare non solo i confronti tra siti o ecosistemi spazialmente separati, ma anche di ridurre sostanzialmente il costo di tali dosaggi, riducendo i volumi complessivi dei reagenti necessari per campione.

Introduzione

Microrganismi come batteri e funghi ottengono nutrienti e il carbonio di composti organici complessi attraverso la produzione di enzimi extracellulari. Questi enzimi idrolizzano tipicamente polimeri in subunità più piccole che possono essere presi in cella. Pertanto, a livello ecologico, questi enzimi extracellulari microbici sono responsabili di gran parte della mineralizzazione dei nutrienti e la decomposizione della materia organica che si verifica in ambienti naturali. Enzimi come cellobioidrolasi (CBH) e β-glucosidasi sono importanti per la degradazione della cellulosa e lavorare all'unisono per catalizzare l'idrolisi di cellulosa in glucosio ^1,2, che fornisce un substrato di carbonio utilizzabile per l'assorbimento e l'assimilazione microbica. L'enzima fosfatasi rilascia gruppi fosfati inorganici solubili da organofosfati, essenzialmente mineralizzanti fosfato e renderlo disponibile per l'uso da maggior parte degli organismi ^3. Altri enzimi, come N-acetilglucosaminidasi (NAGase), sono important in degrado chitina e può fare sia il carbonio e l'azoto disponibile per acquisizione microbica ^4.

Una delle procedure per il saggio di attività enzimatica extracellulare microbica in ambienti naturali è l'uso di p-nitrofenil artificiale (p NP) substrati collegati, un approccio che è stato originariamente sviluppato per rilevare l'attività della fosfatasi terreno ^5. Questo approccio si basa sul rilevamento di un prodotto finale colorato, p-nitrofenolo, che viene rilasciato quando il substrato artificiale viene idrolizzato dall'enzima appropriato. Il p-nitrofenolo può essere successivamente quantificato colorimetro misurando la sua assorbanza a circa 400-410 nm. Questo metodo è stato poi applicato a rilevare altri enzimi come NAGase ^6, ed è stato utilizzato in vari studi guardando microbica attività enzimatica extracellulare in terreni e sedimenti ^7-9.

Un approccio alternativo che era originally sviluppato per valutare l'attività glucosidasi extracellulare in ambienti acquatici ^10,11 fa uso di 4-metilumbelliferone (MUB) substrati collegati. Il prodotto finale rilasciato (4-metilumbelliferone) è altamente fluorescente e può essere rilevato utilizzando un fluorimetro con un'impostazione eccitazione / emissione intorno a 360/460 nm. Una varietà di substrati artificiali MUB-legati sono disponibili, permettendo la misurazione fluorimetrica dell'attività di almeno tanti enzimi (ad esempio β-glucosidasi, cellobioidrolasi, Nagase, fosfatasi) come può essere dosati utilizzando la procedura colorimetrica p NP-substrato. Altri enzimi extracellulari microbici, quali la leucina aminopeptidasi proteina-degradanti, possono essere dosati fluorometrically usando 7-ammino-4-metil (COU) substrati collegati. Sia MUB-e substrati COU-legati sono stati utilizzati per determinare l'attività enzimatica in vari campioni terrestri e acquatici ^12,13.

Mentre gli studi precedenti hanno described micropiastra fluorometrico o colorimetrico approcci per determinare l'attività enzimatica extracellulare ^14, c'è la necessità di una chiara presentazione di come condurre tali analisi. Qui mostriamo le procedure per lo svolgimento di tecniche ad alta velocità micropiastra per l'analisi dell'attività enzimatica extracellulare in suoli e sedimenti che utilizzano l'approccio substrati NP-linked p colorimetrica e nelle acque naturali, utilizzando la tecnica di fluorescenza substrati MUB-linked. Ci concentriamo sulla misurazione delle attività di β-glucosidasi, NAGase, e fosfatasi come questi enzimi possono essere legati al carbonio, azoto, fosforo e ciclismo, rispettivamente. Tuttavia, le procedure qui descritte possono essere applicate alla misurazione di altri enzimi extracellulari usando differenti substrati artificiali.

Protocollo

L'analisi colorimetrica di extracellulare Enzyme Activity in terreni e sedimenti

1. Preparazione del substrato e Soluzioni tampone per analisi colorimetriche di Enzyme Activity

1. Preparare H 50 mM tampone acetato (pH 5,0-5,5) mescolando 50 ml di 0,1 M di acido acetico (2,87 ml di acido acetico glaciale in 500 ml di acqua), 150 ml di acetato di sodio 0,1 M, e 200 ml di acqua distillata ₂ O. Regolare il pH a 5,0-5,5 con 0.1 M di acido acetico, se necessario.
2. Preparare una soluzione di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) in H ₂ O distillata O.
3. Preparare le soluzioni di substrato NP-linked p in 50 mM tampone acetato. Per eseguire il test della fosfatasi preparare 5 mM p NP-fosfato in 50 mM tampone acetato, per saggiare β-glucosidasi preparare 5 mM p NP-β-glucopiranoside, per saggiare NAGase preparare 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Preparare tutte le soluzioni del substrato in sterili da 15 ml o 50 ml provette da centrifuga. Le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per 2-3 settimane.

2. Determinazione di una standard per convertire assorbanza a p NP Concentrazione

1. Preparare soluzioni standard di p-nitrofenolo in 50 mM tampone acetato. Le concentrazioni dovrebbero spaziare 0,025-1 mm.
2. Trasferimento tre repliche di 100 ml di ciascuna concentrazione ad una chiara micropiastra a 96 pozzetti. Aggiungere 10 ml di NaOH 1 M e 190 microlitri distillata H ₂ O a ciascun pozzetto.
3. Record assorbanza a 410 nm usando un lettore di micropiastre.
4. Concentrazioni di moltiplicarsi in curva standard di 0.3 per ottenere μmoles p NP 300 per volume di reazione microlitri. Tracciare una curva di assorbanza vs micromol di p NP. La pendenza della curva serve come fattore di conversione (C) che si riferiranno assorbanza a micromol di p NP in ciascuna reazione enzimatica.

3. Condurre il Enzyme Assay

1. Per il suolo, preparare un impasto di ogni campione da dosare in una sterile provetta da centrifuga da 15 ml a Concentrazionezione di circa 1 g / ml ^-1 usando 50 mM di tampone acetato. Per i sedimenti, aggiungere tampone acetato sufficiente a rendere l'impasto facilmente pipettable. L'esatto volume di slurry necessaria varierà a seconda del numero di enzimi dosati, ma è consigliato un minimo di 5 ml. Vortex ogni impasto fino a quando tutte zolle di terreno o nel sedimento sono dispersi e notare il volume finale.
2. Re-vortice ogni slurry e pipettare immediatamente 150 ml in ciascuna delle sei pozzetti su un blocco 96 pozzetti Deepwell (Figura 1). È importante vortice accuratamente e frequentemente per mantenere in sospensione le particelle del terreno. Lasciare almeno due pozzetti per blocco vuoto per servire come controllo substrato. Nota: ritagliare il fine di punte per pipette con le forbici prima di dispensare come fanghi suolo tendono a intasare punte. Preparare un blocco a 96 pozzetti per ciascun enzima da dosare.
3. Versare circa 5 ml di tampone acetato in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per aggiungere 150 ml di buffer alla last due pozzetti di ciascun campione (questi saranno i controlli tampone campione) e le due pozzetti di controllo substrato (Figura 1)
4. Versare circa 10 ml della soluzione di NP-substrato p appropriato in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per aggiungere 150 microlitri della soluzione di substrato per i primi quattro pozzetti di ciascun campione e le due pozzetti di controllo substrato (Figura 1). Notare il tempo come la reazione inizia non appena viene aggiunta la soluzione di substrato.
5. Incubare le piastre a temperatura ambiente (22 ° C) per 0,5-4 ore. Tempo di incubazione può variare a seconda del livello di attività in campioni e l'enzima da dosare. Per la maggior parte dei terreni e sedimenti, fosfatasi e β-glucosidasi richiedono tempi di incubazione di 0,5-1,5 ore, mentre NAGase e di altri enzimi richiedono tempi di incubazione di> 2 ore.
6. Mentre i test sono incubando preparare chiari 96 pozzetti per leggere l'assorbanza. Preparare una micropiastra per ogni blocco Deepwell (vale a dire per ogni enzyme analizzati). Pipettare 10 ml 1 M NaOH e 190 ml di acqua distillata in ciascun pozzetto della micropiastra. Nota: NaOH rallenta la reazione enzimatica e solleva il pH che esalta il colore della NP p rilasciato durante la reazione.
7. Dopo l'incubazione, centrifugare i blocchi da 96 pozzetti a 2,000-5,000 xg per 5 minuti per far sedimentare particelle di terreno.
8. Utilizzare una pipetta multicanale a ritirare 100 microlitri di ogni bene, facendo attenzione ad evitare il pellet, e trasferirlo al corrispondente bene preparata chiaro micropiastra a 96 pozzetti.
9. Accendere il lettore per micropiastre e configurare il software necessario. Record assorbanza a 410 nm. Se l'assorbanza di un particolare bene è superiore al limite di rilevazione lineare del lettore di piastre, che ben diluire 1:1 con acqua e ri-misura. Se assorbanza è ancora troppo elevato, il test deve essere ripetuto con un tempo di incubazione più breve.

4. Determinazione della massa a vuoto dei Campioni

1. Pipettare 1 ml di ciascuna sampl e impasto in una teglia di alluminio pre-pesate.
2. Secco in un forno di essiccazione a 75 ° C per 48 ore e pesare. Sottrarre il peso della vaschetta da questo valore per ottenere la massa secca di terreno o nel sedimento in 1 ml di slurry. Moltiplicare per un fattore di 0,15 per determinare la massa secca del campione nei 150 microlitri aggiunti a ciascun pozzetto nel saggio enzimatico.

5. Calcolo del Enzyme Activity per lavaggio di massa di terreno o nel sedimento

1. Calcola assorbanza finale di ogni campione sottraendo l'assorbanza di controllo campione dalla assorbanza analisi del campione. Se i controlli substrato hanno un elevato assorbimento (circa> 0.060) quindi sottrarre anche quelli.
2. Calcola attività enzimatica in μmoles hr ^-1 g massa secca ^-1 dall'equazione:

L'attività enzimatica = assorbanza finale / (C x tempo di incubazione x campione secco di massa)

Analisi fluorescente di extracellulare Enzyme Activity in acque naturali

tle "> 1. Preparazione del substrato, Standard e Soluzioni tampone per le analisi fluorimetrica di Enzyme Activity

1. Preparare 200 pM soluzioni di substrati MUB-collegati (ad esempio 4-MUB-β-glucopiranoside, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminide) disciogliendo il substrato adatto in sterile (autoclave) distillata H ₂ O in sterili da 15 ml o 50 ml provette da centrifuga. Avvolgere i tubi in alluminio per escludere la luce e conservare in frigorifero prima dell'uso. Substrati devono essere stabili per almeno 1 settimana se conservato in questo modo.
2. Preparare uno standard MUB facendo una soluzione stock di 100 micron 4 metilumbelliferone in sterile distillata H ₂ O. Conservare in frigorifero in ambra o bottiglia stagnola avvolto. Immediatamente prima dell'uso, diluire la soluzione 100 mM stock di 1/10 in H ₂ O sterile per ottenere una soluzione di lavoro di 10 pM per saggi enzimatici.
3. Preparare una soluzione stock di 100 mM tampone bicarbonato sciogliendo 8,4 g di NaHCO _{3 in 1 LH 2 O e autoclave. Diluire questa soluzione a 1/20 in H 2 O sterile come necessario per ottenere una soluzione di lavoro di 5 mm per saggi enzimatici.}

2. Organizzazione di campioni di acqua su un 96-Well Nero micropiastre

1. Organizzare una micropiastra per ciascun enzima seguendo l'esempio illustrato nella Figura 2. Si noti che consenta replica adeguata, standard e controlli, questa procedura può saggiare l'attività di un singolo enzima fino a nove campioni di acqua su una micropiastra a 96 pozzetti nero.
2. Versare circa 5 ml del primo campione in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per pipette200 microlitri in tutti i pozzetti nella colonna 1 della micropiastra (s). Eliminare i puntali delle pipette usate e ripetere se necessario per ogni campione di acqua per riempire le colonne 1-9.

3. Impostazione di Campione, standard, spegnere, e controlli substrato

1. Impostare i controlli per tenere conto di campioni, standards, substrato e tempra sulla stessa micropiastra nero come i campioni (Figura 2).
2. Controlli a campione contengono acqua campione e tampone bicarbonato, e non vengono utilizzati nei calcoli di attività, ma dimostreranno la lettura coerenza in tutto il corso dell'esperimento. I controlli quench consistono di acqua campione e una quantità standard del tag fluorescente e sono utilizzati per misurare la diffrazione di fluorescenza in acqua campione. Substrato e controlli standard sono costituiti da tampone o-substrato collegato o l'etichetta fluorescente norma, rispettivamente, e bicarbonato.
3. Versare circa 5 ml di 5 mM tampone bicarbonato in un serbatoio pipetta pulita. Pipettare 50 ml di tampone nei pozzetti da 1 a 9 nelle righe D ed E per formare due replicare pozzetti di controlli a campione per campione. Ha Cambia pipette poi trasferire 200 ml di tampone bicarbonato per pozzi da 10 a 12 nelle righe A e H.
4. Ridurre l'illuminazione ambiente attenuando o spegnendo lillum na come standard fluorescente è sensibile alla luce.
5. Versare circa 5 ml di 10 mM 4-metilumbelliferone in un serbatoio pipetta pulita. Dispensare 50 ml nei pozzetti da 1 a 12 in fila H, e in pozzi da 1 a 9 in righe G e F per formare tre repliche di controlli tempra per campione e controlli generali standard. O mettere la micropiastra al buio o coprire con un coperchio opaco per ridurre il degrado luce del MUB.
6. Accendere il fluorimetro e set-up tutti i software necessari per essere pronto a leggere prima di aggiungere il substrato. Nota: alcuni bulbi fluorometro possono richiedere un tempo di warm-up di 3 minuti o più.
7. Versare circa 5 ml di substrato appropriato MUB-linked (ad esempio 4-MUB-fosfato) in un serbatoio pipetta pulita. Utilizzare una pipetta a 12 canali per pipettare 50 ml in pozzetti da 1 a 12 nella riga A, e in pozzi da 1 a 9 nelle righe B e C per formare tre test ripetuti per ogni campione e tre controlli substrato. IMMEDIATAMENTEy passare al punto 4.1, fluorescenza registrazione.

4. Fluorescenza di registrazione

1. Leggere la fluorescenza iniziale subito dopo l'aggiunta del substrato alla micropiastra. Dopo la lettura di fluorescenza, incubare la micropiastra a temperatura ambiente (22 ° C) o al buio o coperto con un coperchio opaco per ridurre il degrado luce di MUB.
2. Il tempo di incubazione richiesta per misurare il potenziale massima dell'attività enzimatica in un campione di acqua dipenderà dalla concentrazione dell'enzima all'interno del campione. Poiché questo è sconosciuto prima della analisi è stata completata, la micropiastra dovrà essere letto a diversi intervalli di tempo. Tipicamente, lettura a intervalli di 10-15 minuti nel corso di 1 ora è accettabile per molti enzimi, anche se i campioni con attività molto alta per alcuni enzimi possono picco prima 10 min.
3. Continua a leggere la fluorescenza nella micropiastra agli intervalli indicati per almeno 1 ora. Essere sicuri di mantenere la micropiastra coperto o al buio tra la letturas.

5. Calcolo del Enzyme Activity per volume di acqua

1. Per ogni campione in ciascun intervallo di tempo calcolare i: significa fluorescenza campione iniziale (pozzetti D ed E), la fluorescenza del campione finale medio (pozzi AC), la fluorescenza media standard (pozzetti H10-11), e la media estinto controllo fluorescenza (pozzi FG).
2. Per ogni intervallo di tempo, calcolare l'attività enzimatica in nmoli hr ^-1 ml ^-1 dall'equazione:

L'attività enzimatica = (media del campione fluorescenza - media di fluorescenza del campione iniziale) / ((media fluorescenza / 0,5 mol) x forfettari (media placare il controllo di fluorescenza / dire fluorescenza) x forfettari (0,2 ml) x (tempo in ore))

3. Esaminare i valori di attività calcolati per ogni passo temporale. Determinare l'attività potenziale finale dal passo temporale con la più alta attività. Se i valori delle attività continuano ad aumentare poi successive fasi temporali possono essere richiesti, se i valori di attività rientrano througHout il corso della corsa, quindi eseguire nuovamente con intervalli di tempo più brevi. Attività Finale è in nmoli di substrato consumato hr ^-1 ml ^-1, ma può essere scalata fino a esprimere come μmoles hr ^-1 L ^-1.

Risultati

Suoli e sedimenti acquatici in genere hanno apprezzabili livelli di attività enzimatica extracellulare come risultato di comunità microbiche allegate (biofilm) cresce sulla superficie delle particelle. Figura 3 mostra come questa attività cambia a seconda delle dimensioni delle particelle ottenute dal sedimento superficie di un terzo Flusso ordine nel nord del Mississippi, USA. Un precedente studio ha dimostrato che le comunità batteriche sulle particelle di sedimenti da questo flusso possono essere...

Discussione

Determinazione delle attività di una varietà di enzimi extracellulari microbiche in suoli e sedimenti può fornire indicazioni utili in tassi di mineralizzazione dei nutrienti e trasformazione di materia organica ^17. Tuttavia, i suoli possono variare nei loro livelli di umidità, quindi è importante standardizzare l'attività di suolo peso secco. Ciò richiede una fase di asciugatura addizionale (tipicamente di due giorni) oltre la semplice misurazione dell'attività enzimatica. Pertanto, a differe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers