Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Riepilogo

Adenovirale trasferimento genico nelle cellule T CD4 naive con transgenici espressione del recettore adenovirus Coxsackie permette l'analisi molecolare della differenziazione delle cellule T regolatorie In vitro.

Abstract

Cellule T regolatorie (Treg) sono essenziali per fornire la tolleranza immune da auto così come a certi antigeni estranei. Tregs può essere generato da CD4 naive cellule T in vitro con TCR-e co-stimolazione in presenza di TGFβ e IL-2. Questo porta il potenziale enorme per terapie future, tuttavia, le molecole e vie di segnalazione che la differenziazione di controllo sono in gran parte sconosciuti.

Cellule T primarie possono essere manipolati attraverso l'espressione genica ectopica, ma non riescono metodi comuni di indirizzare il più importante stato naif della cellula T prima del riconoscimento dell'antigene primaria. Qui, forniamo un protocollo di esprimere geni ectopiche nelle cellule T CD4 naive in vitro prima di indurre la differenziazione Treg. Si applica la trasduzione con l'adenovirus replica-carente e spiega la sua generazione e la produzione. L'adenovirus può occupare una grande inserti (fino a 7 kb) e può essere dotato di promotori per realizzare alta e transitori Sovraespression nelle cellule T. E trasduce efficacemente le cellule T naive topo se esprimono un recettore adenovirus Coxsackie transgenico (CAR). Importante, dopo l'infezione le cellule T naive rimangono (CD44 ^{bassa, alta} CD62L) e di riposo (CD25 ^-, CD69 ^-) e possono essere attivate e differenziate in Tregs simili alle cellule non infette. Così, questo metodo consente la manipolazione di cellule CD4 T differenziamento cellulare dal suo inizio. Essa assicura che l'espressione genica ectopica è già in atto quando i primi eventi di segnalazione della stimolazione iniziale TCR induce cambiamenti cellulari che alla fine portano a Treg differenziazione.

Introduzione

Tregs sono cruciali per mantenere la tolleranza immunitaria e per smorzare le risposte immunitarie superamenti. Treg sopprimere l'attivazione delle cellule T astanti. Di conseguenza, l'ablazione del Tregs porta ad autoimmunità fatale e autodistruzione guidato da cellule T attivate ^1. Treg sviluppano nel timo durante la selezione negativa dei CD4 precursori single-positive, ma possono anche differenziarsi in periferia da CD4 naive cellule T dopo stimolazione antigene a basso dosaggio con subottimale di co-stimolazione ^1,2. Timica Treg sembra sopprimere l'autoimmunità tessuto contro auto-antigeni, mentre periferica Treg sono stati implicati nel fornire tolleranza nell'intestino o polmonari. Questi indotta Treg potentemente prevenire l'attivazione delle cellule T dopo il riconoscimento di antigeni estranei nella mucosa, tra antigeni ambientali da cibo e aria, batteri commensali, e allergeni ^3,4. Inoltre, Tregs sono cruciali per stabilire la tolleranza materna al peptidi fetali ⁵ e quello di prevent malattia del trapianto contro l'ospite ^6. Allo stesso tempo, Tregs anche mediare effetti indesiderati attenuando sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali ^7,8. L'elemento caratterizzante Tregs è l'espressione del sottoinsieme specificando-fattore di trascrizione Foxp3, un fattore di trascrizione dominio contenente forcella-testa che è necessario e sufficiente per conferire funzione ^9,10 Treg. Alcune vie di segnalazione che possono indurre l'espressione Foxp3 sono noti. Tuttavia, i processi molecolari che controllano, regolano o modulano Treg differenziazione in risposta al recettore delle cellule T innescando sono meno conosciuti.

Tregs molto efficace può essere indotta in vitro mediante la stimolazione delle cellule T CD4 naive con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 in presenza di TGFβ e IL-2 ^11. Come l'emergente Treg sono funzionali in vivo, la manipolazione di molecole che promuovono la differenziazione Treg porta un enorme potenziale per il futuro therapies, per esempio, il trattamento di asma, malattia di Crohn, e trapianto ^11,12. Viceversa, la modulazione terapeutica di molecole per bloccare differenziazione Treg può fornire beneficio in futuro approcci di trattamento combinato dei pazienti con tumori.

Saggi in vitro hanno differenziazione state fondamentali per la descrizione delle modifiche molecolari che sono associati con T sottoinsieme differenziazione cellulare. Al momento, i tentativi sperimentali per cercare o schermo per prodotti genici che la differenziazione delle cellule T sono controllo ostacolata dal fatto che i metodi più comuni di espressione genica ectopica falliscono nelle cellule T naive. Per esempio, elettroporazione e trasduzione retrovirale sono efficaci solo in cellule T attivate. Contrariamente alle aspettative iniziali, trasduzione lentivirali, che è in genere efficace in cellule quiescenti, necessita di pre-attivazione delle cellule T naive dalle citochine ^13. Inoltre, il trasferimento di cDNA o mRNA durante elettroporazionecomporta depolarizzazione della membrana plasmatica, che si conferisce caratteristiche di attivazione delle cellule T e può anche mobilizzare ^{Ca2 +} segnalazione e attivare le proteine ​​NFAT (osservazione inedito e rif. ^14). Analogamente, per la trasduzione retrovirale, le cellule T naive devono essere attivati ​​per 18 - 40 hr. Durante questo tempo, la rottura della membrana nucleare nel corso della divisione cellulare si verifica e consente la successiva integrazione genomica del vettore retrovirale ^15. Questi metodi non sono quindi in grado di affrontare la regolazione molecolare precoce di cellule T incontro iniziale con l'antigene, che è la fase determinante di differenziazione delle cellule T helper.

Trasduzione adenovirale è noto per conferire espressione genica transiente ectopica in un certo numero di tipi di cellule umane che esprimono il recettore umano Coxsackie adenovirus (CAR). Procede senza necessità di attivazione delle cellule o la progressione del ciclo cellulare. L'espressione superficiale di CAR è essenziale per l'attacco del virus efficiente e interiorizzazione, e l'espressione transgenica della versione troncata CARΔ1 sotto una T promotore specifico delle cellule è stato trovato per rendere timociti topo e cellule T suscettibili alle infezioni adenovirale ^16. È importante sottolineare che il transgene non altera sviluppo timociti o differenziazione in vitro di cellule CD4 T naive in diversi sottoinsiemi (dati non mostrati; rif ^17.). Adenovirus-mediata trasduzione di cellule T è stato precedentemente utilizzato per la sovraespressione ^17,18 e knock-down approcci ^19,20. Le cellule T transgeniche possono essere purificati da disponibile in commercio DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref ^17.). Importante, trasduzione adenovirale permette un'elevata espressione di un gene di interesse in cellule T naive senza indurre segni evidenti di attivazione. Le cellule T rimangono ingenui ^(basso CD44, CD62L ^alto) e di riposo (CD25 ^-, CD69 ^-) dopo infection e può essere attivato e differenziate in Treg simili alle cellule non infette.

Produzione di adenovirus ricombinanti può essere raggiunto dopo la trasfezione di cellule con plasmidi HEK293A adenovirali (Figura 1). Questi plasmidi contengono in genere il tipo di adenovirus 5 genoma umano con i geni E1 ed E3 eliminati per rendere adenovirus ricombinanti replicazione-incompetenti ^21. Cellule HEK293A completano carenza di replica in quanto sono stati immortalati attraverso l'integrazione stabile di adenovirus tosato ^22. Dal momento che i vettori adenovirus sono di grandi dimensioni (~ 40 kb) e di conseguenza non è adatto per la tradizionale restrizione enzimatica clonazione, abbiamo impiegato il sistema Gateway. Il gene di interesse viene inizialmente clonato in un vettore voce più piccola, dal quale può essere facilmente trasferito nel vettore adenovirale destinazione tramite reazione di ricombinazione lambda (LR) ^23. Abbiamo costruito la pCAGAdDu vettorecombinando il promotore CAG (pollo promotore actina e CMV enhancer), con una cassetta di espressione contenente siti di LR che fiancheggiano il procariotica CCDB selezione marcatore ^24. Questa cassetta di espressione è fuso ad un sito interno ingresso ribosoma (IRES) elemento che permette coexpression dell'infezione marcatore proteina fluorescente verde rafforzata eucariotica (eGFP), che è fuso ad una sequenza contenente l'ormone della crescita bovina poly (A)-segnale. Abbiamo scelto le sequenze cis-regolatori CAG, poiché il prototipo promotore CMV è risultato essere altamente attivazione-dipendente e pertanto sfavorevole per l'espressione genica in cellule T naive.

Qui, forniamo un protocollo per efficiente in vitro Treg differenziazione e un metodo per trasdurre CD4 naive cellule T senza attivazione (Figura 2). Il metodo consente di espressione genica ectopica o abbattere CD4 precedenti differenziazione delle cellule T allo stato ingenuo. Esso consente di testare l'effetto di un overexpressed gene di interesse durante le prime manifestazioni di segnalazione alla stimolazione TCR iniziale fino T impegno sottoinsieme delle cellule. Nostri esperimenti di validazione forniscono anche la base per stabilire simile all'applicazione adenovirus nella differenziazione di altri sottoinsiemi T cellule quali Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o cellule tfh.

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Protocollo

1. La clonazione di un gene di interesse in un vettore di ingresso

1. Clonare il gene di interesse in un vettore di ingresso. Amplificazione PCR del gene seguita da ligazione smussato-end in un vettore topoisomerasi-coupled (es pENTR / D-TOPO) o di restrizione enzimatica clonazione può essere utilizzato per questa procedura.

2. Trasferimento del gene di interesse nel pCAGAdDu destinazione Vector

1. Trasferire il gene di interesse da parte del vettore di ingresso nel vettore di destinazione dalla LR ricombinazione (es. Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Questo creerà il vettore di espressione adenovirale (Figura 1).
2. Linearizzare 10 pg del vettore di espressione adenovirale in una raccolta di limitazione PacI, precipitare il DNA e risospendere in acqua ad una concentrazione di 3 mg per 100 microlitri. Linearizzazione libera le ripetizioni invertite virali (ITR), che sono necessari per la replicazione e incapsidazione del vDNA Iral in particelle virali.

3. Generazione del Virus lisato Primaria

1. Seme 1 x 10 ⁵ cellule HEK293A in 2 ml RPMI (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e incubare le cellule per 6-14 ore a 37 ° C in un 10% CO ₂ incubatore per consentire loro di aderire. Le cellule devono quindi essere di circa il 50% di confluenza.
2. Lipofezione: Trasferimento 6 ml di reagente jetPEI in 94 ml di 50 mM NaCl, brevemente vortice. Aggiungere la soluzione mista di 100 pl linearizzato vettore adenovirus mentre vortex e incubare questa miscela di trasfezione per 15 - 30 min a temperatura ambiente.

Eseguire tutti i passaggi seguenti, alle opportune condizioni di biosicurezza per l'infezione da adenovirus!

3. Erogare la soluzione a gocce sulla cella contenente ben HEK293A e incubare le cellule a 37 ° C e 10% di CO _2. Quando si utilizza un indicatore di fluorescenza, valutare il transfeefficienza ction visivamente dopo 12-36 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. Aggiungere 0,5 ml di mezzo fresco ogni 3 giorni.
4. Controllare ogni 2 - 3 giorni con un microscopio ottico a fluorescenza o per effetto citopatico (CPE), che sono le zone con le cellule allargata e arrotondata che iniziano a staccarsi. Ciò è indicativo di generazione virus efficiente. Al verificarsi di zone più ampie di CPE (Figura 3), ci vorranno 24-72 ore prima di tutte le cellule sono infettate.
5. Quando tutte le cellule mostrano segni di CPE, ma prima di un distacco totale di cellule avviene, staccano le cellule pipettando delicatamente e trasferire le cellule con supernatante (SN, 3-5 ml) in una provetta di polistirene da 15 ml.
6. Congelare le cellule nella SN in ghiaccio secco per 15 - 20 min e scongelare rapidamente a 37 ° C dopo la rottura delle cellule. Ripetere questo gelo-disgelo e-ciclo (F / TC) altre due volte. Tenere il lisato virus primario sul ghiaccio per l'uso all'interno di un giorno o congelarlo a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. Qualsiasi ulteriore F/ TC ridurrà il titolo del virus del 30 - 50%.

4. Virus Amplificazione

1. Seed e far crescere le cellule HEK293A al 90% di confluenza in un piatto di coltura 14 cm tessuto.
2. Infettare le cellule con la metà del lisato virus primario (1,5 - 2,5 ml) e incubare le cellule per almeno 36 ore. Quasi tutte le celle devono essere infettate poi, che può essere determinata mediante microscopia a fluorescenza. Per la ri-amplificazione di un già amplificato (cioè più concentrata) stock virus, infettare HEK293A ad una molteplicità di infezione (MOI) di 50 (vedere 6.3).
3. Le cellule devono essere raccolte quando tutti loro mostrano CPE, ma prima di distacco. Con la produzione di virus efficiente questo stato viene raggiunto entro 48 ore dopo l'infezione. (Se ci vogliono fino a una settimana, prendere in considerazione un altro giro di amplificazione, aumentando la quantità di magazzino adenovirus usati per l'infezione descritto al punto 4.2.)
4. Staccare le cellule pipettando dolce e cellule di trasferimento e SN in una provetta di polistirene da 50 ml. Spin celle in basso a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
5. Rimuovere il SN e risospendere il pellet in un opportuno volume di media o SN (ca. 1 ml).
6. Eseguire 3 F / TC per disturbare le cellule e centrifugare a 800 xg per 15 min a 4 ° C. Togliere il SN che contiene le particelle del virus (cioè il lisato virus concentrato), e un'aliquota del lisato virus per conservarlo a -80 ° C.

5. Virus Titer Determinazione

1. Seed 10 A549 ⁵ cellule per pozzetto in 5 pozzetti di una 12-pozzetti in 1 ml di mezzo e lasciare che le cellule aderiscono per 6 ore.
2. Usare 1 ml di adenovirus concentrato (scongelati in ghiaccio) per eseguire una diluizione del siero in media (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) e aggiungere 10 microlitri per pozzetto. Lascia un bene non infetto per regolare il gating in citometria a flusso.
3. Dopo 36 ore, togliere il SN, lavare con PBS e staccare le cellule (per esempio mediante tripsinizzazione). Per le precauzioni di sicurezza, si consiglia di fissare cells in 100 microlitri 4% paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente e lavata con PBS contemporaneamente.
4. Effettuare una analisi FACS di espressione marcatore dell'infezione. Plot 'lisato virale microlitri applicato' contro il numero assoluto di cellule infette (Figura 4). Determinare il campo lineare di infezione e calcolare il titolo per ml di virus diluito dalla curva standard sopra la gamma lineare con x = 1,000 microlitri.

6. L'infezione delle cellule T

1. Isolate le cellule T CD4 naive / riposo da DO11.10 tg; topi Tg CARΔ1 utilizzando MACS (CD4 + T Naive cellulare Isolamento Kit II) o FACS ordinamento (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
2. Per gli esperimenti su piccola scala, pipettare un volume appropriato di lisato virale per ottenere una MOI di 50 in un pozzetto di una piastra 96 ​​pozzetti a fondo tondo.
3. Aggiungere fino a 4 x 10 ⁵ cellule T in un volume finale di infezione di 50 microlitri in terreno cellule T (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, NEAA 1x, 1x MEM Essentialvitamina, 1x L-glutammina, 1:250.000 Mercaptoetanolo, 10 HEPES mm).
   Esempio:
   Un MOI di 50 deve essere utilizzato per infettare 3 x 10 ⁵ cellule T; il titolo virale è 3 x 10 ⁹ ml ^-1
   Volume di Virus = MOI x T numero di cellule / titolo virale = 50 x (3 x 10 ⁵⁾ / (3 x 10 ⁹ ml ^-1) = 0.005 ml

Nota: per l'infezione del numero di cellule più grandi, Scale Up utilizzando un MOI di 50 in un volume infezione di 165 microlitri per 10 ⁶ cellule T naive in una provetta di polistirene con tazza sciolto (fino tp 3 ml per provetta).

4. Incubare le cellule per 90 min a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore.
5. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, togliere SN, risospendere in 200 l di PBS. Centrifugare nuovamente e togliere SN.

(Opzionale: le cellule possono essere nuovamente lavati per rimuovere il virus in modo più efficiente)

6. Risospendere le cellulein 200 microlitri di medie cellule T senza anticorpi stimolanti e senza IL-2 o di altre citochine e riposarsi per 40 ore a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore per consentire l'espressione del gene di interesse prima dell'attivazione.

7. T cellule attivazione e polarizzazione

1. Pipetta un volume di anti-CD3 e anti-CD28 perline accoppiati che è uguale al numero delle cellule (ad esempio 4 x 10 ⁵⁾ in una piccola tazza reagente, aggiungere il volume di 10 volte di PBS e metterle su una calamita per 2 min . Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 200 microlitri di polarizzazione media (per Treg: T medie delle cellule + 1 ng / ml TGFβ, 100 U / ml di IL-2).

Nota: Le cellule possono anche essere attivati ​​utilizzando piatti di coltura tissutale sensibilizzate con anticorpi anti-CD28 e anti-CD3, o in una forma specifica del recettore DO11.10 cellule T usando irradiati BALB / c splenociti pulsate con ovalbumina 323-339 antigene peptidico.

2. Centrifuge il riposato celle di prima, togliere il SN e risospendere le cellule in 200 microlitri polarizzante terreno contenente anti-CD3 e anti-CD28-anticorpi accoppiati perline. Incubare per 72 ore a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore senza cambiare mezzo.

8. T cellulare fissazione e la colorazione per Citometria a Flusso

1. Lavare le cellule: Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, togliere SN, risospendere in 200 l di PBS. Centrifugare nuovamente e togliere SN. Eseguire tutte le seguenti fasi di lavaggio di conseguenza.
2. Risospendere le cellule in 100 microlitri soluzione colorante cellulare morto risolvibile e incubare per 30 minuti a 4 ° C.
3. Lavare le cellule, risospendere in 100 l di PBS, aggiungere 100 microlitri paraformaldeide al 4% in PBS, incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare le cellule, li risospendere in 200 ml ghiacciata 70% di metanolo in PBS e incubare per 30 minuti in ghiaccio.

Nota: Le celle possono essere trattati da ora in poi, senza precauzione rischio biologico!

5. Preparare 60 ml master-mix di 60 microlitri di PBS + 10 mcg / ml Fc-block (anti-FCR3 per bloccare legame non specifico). Lavare le cellule, li risospendere in 40 ml di PBS + anti-FCR3 e incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
6. Aggiungere 20 ml di PBS + anti-FCR3 contenente 1 mg PE-accoppiato anticorpo anti-Foxp3, mescolare bene e incubare a 4 ° C durante la notte.
7. Lavare le cellule due volte in PBS e analizzare le cellule su un citofluorimetro.

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Risultati

Virus Produzione

Per la generazione di viremia elevata, i tempi di raccolta delle cellule HEK293A nella produzione di virus primaria o amplificazione del virus è di fondamentale importanza. Rappresentativi immagini a contrasto di fase e fluorescenza con segni visivi di produzione di virus sono mostrati in Figura 3. Il CPE è stata osservata 10 giorni dopo la transfezione di cellule HEK293A con pCAGAdDu controllo vettoriale senza inserto. CPE sono caratterizzate dalla comparsa ...

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Discussione

Generazione Virus e titolazione

Per risultati ottimali trasfezione, la qualità e la quantità di vettore linearizzato appaiono più importante. Non abbiamo osservato effetti negativi sulla produzione di lisato primaria da una crescita eccessiva iniziale della cultura in quanto l'infezione procede rapidamente una volta che la produzione di virus efficiente verifica. Tuttavia, la produzione di virus dalle cellule HEK293A può essere influenzata da lunghi inserti che diminuiscono l'effici...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596