Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione

Riepilogo

Abbiamo misurato il rilascio della tensione in un assone, parzialmente lesionati con un dissettore laser per la misurazione simultanea della spettroscopia di forza eseguita su una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell'assone. Il protocollo sperimentale sviluppato valuta l'assone adesione al substrato cultura.

Abstract

La formazione di connessioni funzionali in una rete neuronale sviluppo è influenzato da stimoli estrinseci. La crescita dei neuriti dei neuroni in via di sviluppo è oggetto di segnali chimici e meccanici, ed i meccanismi con cui percepisce e risponde a segnali meccanici sono poco conosciuti. Chiarire il ruolo di forze nella maturazione delle cellule consentirà la progettazione di scaffold che può promuovere l'adesione cellulare e citoscheletro accoppiamento al substrato, e quindi migliorare la capacità di diversi tipi neuronali di rigenerarsi dopo una lesione.

Qui, descriviamo un metodo per applicare misure di spettroscopia di forza simultanee durante laser della lesione cellulare indotta. Misuriamo il rilascio della tensione nel assone parzialmente lesionata dal simultaneo monitoraggio interferometrico di una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell'assone. Il nostro protocollo sperimentale rileva il rilascio della tensione con la sensibilità piconewton, e la dinamica del rilascio della tensione arisoluzione temporale millisecondo. Pertanto, offre un metodo ad alta risoluzione per studiare come l'accoppiamento meccanico tra cellule e substrati può essere modulata mediante trattamento farmacologico e / o da distinti proprietà meccaniche del substrato.

Introduzione

Microscopia ottica è uno del sistema di imaging meno invasiva disposizione per osservare le cellule viventi. Con lo sfruttamento degli effetti, come la pressione di radiazione (come in pinzetta ottica ^1), o flusso di fotoni ad alta energia (come nel laser dissettore ^2), questa tecnologia è stata estesa a nano-manipolazione. Il sistema di imaging ottico fornisce un controllo preciso di visualizzare e manipolare gli obiettivi sub cellulari ^3. Allo stesso tempo, grazie alla calibrazione accurata della potenza del laser consegnato, strumenti ottici realizzano sia la manipolazione del campione morbido o invasivi con riproducibilità senza precedenti.

Diversi laboratori integrati, nello stesso setup sperimentale, pinzette ottiche e laser dissettore per ablazione organelli ^4, a fondere ⁵ celle diverse, o per stimolare le cellule dai guidato otticamente carichi ^6,7. Mentre pinzette ottiche, dopo la calibrazione della rigidezza ottica, consentonoil controllo della forza applicata alla cella su scala piconewton, sistemi dissezione laser può modulare manipolazione ottica, che varia da membrana foto-porazione all'ablazione di singoli organelli o dissezione di strutture sub-cellulari. Tuttavia, calibratura dissezione laser si basa sulla valutazione qualitativa dell'entità di manipolazione ottica rispetto alla energia fornita al campione, principalmente sulla base di analisi di immagini che illustra i cambiamenti morfologici dovuti al campione ^8. Nel metodo presentato, dimostriamo come eseguire la misurazione spettroscopia di forza durante la dissezione laser assonale di un neurone sviluppo, quantificare, su scala piconewton, la forza prodotta da un equilibrio alterato nella struttura citoscheletro di un compartimento subcellulare ^9. Neuroni coltivati ​​aderiscono al substrato, e polarizzano durante lo sviluppo. La fase di polarizzazione si verifica durante i primi cinque giorni in vitro. Alla seconda fase di polarizzazione, una delle estrusorizione neuriti diventa più lungo, e sarà differenziarsi per diventare l'assone ^10. Allungamento assonale in risposta alla forza di traino presso il cono di crescita è già stato modellato dal modello di Dennerl ^11. Recentemente, questo modello è stato esteso da ¹² a includere il ruolo di neuriti adesione ai substrati della matrice extracellulare. Questo modello biofisico, proposto dopo ¹³ osservazioni sperimentali, ha mostrato che tirando forze sul cono di crescita, si propaga lungo i neuriti, sono modulati da adesioni focali al substrato. Allo stesso modo, lesione assonale produce un rilascio locale di tensione propagare verso il corpo cellulare. Pertanto, abbiamo proposto che la misura tale tensione rilasciato in una posizione lungo l'assone tra la lesione e la soma cellulare offre la possibilità di valutare l'esito di smorzamento di adesioni focali inalterati.

Calibriamo l'energia necessaria fotone-flusso del laser dissettore per controllare l'entità del damag assonale inflittoe, da completo transection a lesione parziale. Dopo la calibrazione, si è ripetuta lesione parziale ai assoni di diversi neuroni differenzianti e sviluppato il protocollo di quantificare il rilascio della tensione, e così ottenuto un parametro quantitativo per stimare l'adesione del assone al substrato ^14.

Nel presente lavoro, si descrive in dettaglio il protocollo sviluppato, che rappresenta una precisa procedura sperimentale per valutare e confrontare con sensibilità piconewton assonale l'adesione al substrato in diverse condizioni sperimentali come trattamento chimico ^14, o diversi tipi di supporto di coltura cellulare.

Protocollo

1. Setup Optical

L'intero sistema ottico è stato descritto in precedenza ^15. Brevemente, il sistema di pinzette ottiche è basato su un onda continua itterbio (CW) fibra laser operante a 1064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulatore spaziale di luce (SLM) (LCOS-SLM, modello X10468-07 - Hamamatsu) varia la fase del fascio laser in ingresso IR per controllare la posizione del punto di messa a fuoco trapping sul piatto di coltura da Computer ologrammi generati. I Blu-pinzette software (collegamento web sul tavolo attrezzature) ologrammi generati liberamente disponibili proiettate sul modulatore spaziale di luce. L'interferometro per misure di spettroscopia di forza era basata su un fotodiodo a quattro quadranti (QPD, S5980 con C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) ed un fotodiodo (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).

La fonte dissezione laser pulsato è stato un sub-nanosecondo UV Nd: YAG laser a 355 nm (PNV-001.525-040, POWERCHIP nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Un acustico-modulatore ottico (MQ110-A3-UV, 355 nm silice fusa-AA-opto-elettronico) controllava la potenza del laser UV consegnato al campione.

L'ottica olografica pinzette laser e micro dissettore stati integrati su un microscopio verticale modificato (BX51 - Olympus) dotata di un 60X, 0,9 NA acqua immergendo objective.The fase del microscopio è composto da un motore 3-asse lineare DC micro-posizionamento sistema (M-126.CG1, Fisica-Instruments) che porta un piezoelettrico fase nano-posizionamento a 3 assi separati (P-733.3DD, Fisica-Instruments) per combinare il movimento grossolana del campione con la risoluzione sub-nanometrica della piezo- stadio. Il sistema del microscopio è stato dotato di due circuiti di controllo che agisce sinergicamente per mantenere il punto fuoco intrappolamento nella posizione giusta, a seconda della modalità di funzionamento selezionata (posizione o forza di serraggio, statica o dinamica) ^16. In particolare, un circuito di retroazione interna agisce su un palco piezoelettrico, per mantenere il tallone in una selectndr distanza dal centro trappola. L'altro circuito esterno controlla la posizione del portaoggetti motorizzato di sfruttare la regione attraversato dal piezoattuatore su un'area maggiore della sua corsa ¹⁷ disponibili. Quando il piezo stadi, raggiunge il limite della corsa disponibile in una direzione, il loop esterno sposta il micro percorso nella direzione opposta, così il piezo recupera verso la sua posizione centrale perché sta rilevando la perlina intrappolato aderito al campione. Quando il piezo-stadio raggiunge la posizione centrale della sua gamma naturalmente, il micro fase interrotta. Ulteriori dettagli del sistema sono riportati in Guiggiani et al ^16,17.

Un dispositivo Peltier (QE1 riscaldamento resistivo con TC-344B del riscaldatore a doppio canale - Warner Instruments) controlla la temperatura della coltura cellulare al microscopio (37 ° C). Nella cultura, pH e umidità sono stati mantenuti in condizioni fisiologiche per aerare un polidimetil custom-designedsilossano (PDMS) manicotto (integrando l'obiettivo microscopio) con CARBOGEN umidificata (95% O _2, 5% di CO _2).

2. Cell Culture Preparazione

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano. Colture primarie sono state ottenute da ippocampo di topi (C57BL6J, Charles River) giorno embrionale 18 (E18).

1. I neuroni sono state piastrate ad una concentrazione di 25.000 cellule / ml su fondo di vetro Petri (P35G-0-14-C - matek Corporation). La bassa concentrazione di cellule in coltura è necessaria per evitare la formazione di una fitta rete già nei primi giorni in vitro. Alla concentrazione cellulare menzionato, la probabilità di trovare cellule isolate con un neurite più lungo non collegato ad altre cellule è molto più alta.

3. Rivestimento Bead

1. Polymer microsfere (Ø 4 micron, COOH-terminato-Bangs Laboratories, codice prodotto PC05N/6700) sono stati rivestiti con poli-D-lisina seguendo la procedura descritta nel Polylink Protein Coupling Kit (Polysciences, codice prodotto 19539). Le perle sono rivestite con la stessa molecola utilizzata per coprire il supporto e la coltura favore cellule adesione.

4. Scegli isolato Neuron. Staccare un tallone dalla cultura substrato, Trappola e spostarlo Accanto al Neuron

1. Mettere il piatto cultura Petri sul palco microscopio. Dopo aver impostato la messa a fuoco sul campione di moto fase, correggere la posizione del illuminante obiettivo condensatore per impostare Kohler-illuminazione. Allineamento delle ottiche di illuminazione per impostare la condizione Kolher-illuminazione è necessaria per migliorare la qualità delle immagini luminose campo. Utilizzando tali condizioni di allineamento, è anche necessario per massimizzare l'efficienza di raccolta del laser IR (tramite condensatore oggettivo), dalla dispersione sonda intrappolato, effettuare il tracciamento interferometrica dal QPD e PD.
2. Pipettare pochi microlitri della soluzione patinati microsfere inal piatto cultura. Microsfere depositerà e di aderire al substrato della cultura. Il numero di microlitri iniettato nel piatto cultura dipende dalla concentrazione microsfere della soluzione di riserva. La condizione ideale è avere tra uno e due microsfere per campo dell'imaging di vista. Quando troppi microsfere vengono aggiunti al piatto di coltura, possono già attaccare caso ai neuroni coltivati.
3. Muoversi nel piatto cultura, alla ricerca di un neurone isolato con una neurite più lungo (l'assone), e salvare la posizione del palco microscopio.
4. Muoversi e cercare una perlina aderito al sostegno della cultura.
5. Accendere il laser a infrarossi cattura. In questa fase, non ologrammi vengono proiettate su SLM, e la posizione del punto laser IR coincide con la posizione spot laser UV. Impostare la posizione assiale dello spot IR 2-3 micron sopra la superficie di supporto cultura, dal movimento del microscopio.
6. Impostare la potenza del laser UV consegnato al campione da meno di 1 μW. GliUV laser dissettore è stato precedentemente tarato ^14:
   5-6 μW il supporto di vetro viene ablata
   4 μW una connessione neuronale è completamente sezionato
   2,5 μW una neurite è parzialmente lesionati
   <1 μW un'onda d'urto è prodotto nel piatto di coltura. L'onda d'urto ottico è abbastanza forte da staccare il tallone dal supporto di vetro.
7. Accendere il laser UV, lasciando il laser IR, e spostare il punto UV sopra il tallone aderito al movimento palco microscopio. Gli stacca tallone dalla superficie, ed è intrappolato dal laser IR. Quindi, spegnere il laser UV.
8. Spostare le intrappolati tallone diversi micrometri di sopra del supporto di vetro (20-30 micron). Sollevamento del tallone a questa posizione sarà impediva di contattare altre cellule mentre viene spostato verso il neurone precedentemente scelto. Portare il tallone nella posizione precedentemente salvata stadio. Impostare la velocità di fase a un valore basso (10 micron / sec), cosicché la forza di trascinamento del fluido non superi la trappola otticaforza ping.

5. Spostare la posizione Trappola rispetto al Dissector Spot Laser e Axon posizione da Computer Generated Hologram e calibrare il Optical pinzette Rigidità

1. Spostare il tallone verso il supporto in vetro di visualizzare l'assone. La sferetta è tenuta sopra la cella per evitare il contatto con essa (circa 5 micron sopra del supporto di vetro).
2. Spostare la fase di microscopio per spostare il punto attivo UV sul centro della larghezza del assone. Salvare la posizione attuale fase.
3. Spostare il focus posizione a pronti IR da ologramma generato al computer. In questa fase, la fase viene arrestato nella posizione scelta nel passaggio precedente. Quando il computer ologramma generato è proiettato sul SLM, il tallone intrappolata viene spostata rispetto alla assone. Abbiamo spostare il punto laser IR avere il tallone intrappolata allineato al centro del neurite, con il punto laser UV centrata sulla stessa neurite troppo. Lo spot IR e quindi il intrappolata tallone sono posizionati lungo i neuriti5-10 micron di distanza dal punto UV. Muoviamo la posizione del IR rispetto alla macchia UV in funzione della geometria neurite. Nel caso le pinzette ottiche non sono dotati di un sistema SLM, la posizione può essere variata specchi ribaltabili, o deflettori acustici ottiche, sul percorso ottico di IR. Il punto laser IR potrebbe essere posizionata 5-10 micron dalla macchia UV per evitare interazioni ottico del fascio dissezione con la sonda intrappolato, che potrebbe influenzare il moto browniano e alterare le tracce spettroscopia di forza.
4. Dopo aver definito la nuova posizione a pronti IR rispetto a macchia UV e posizione assone, spostare la fase di posizionare il tallone intrappolato dalla assone ed evitare collisioni con esso. Spostare la posizione assiale del tallone intrappolata di circa 2 micron sopra il vetro di copertura.
5. Allineare il QPD al centro le frange di interferenza su di esso: x e segnali differenziali y QPD sono zeri quando il QPD è centrato. Acquisire 5 secondi del moto browniano del tallone intrappolati dalla interferometrichemetro, a 50 KHz frequenza di campionamento. Avere la rigidità (pN / nm) e sensibilità (V / nm) della trappola ottica dal metodo spettro di potenza ^18.

6. Fissare il tallone alla Axon. Eseguire assotomia e simultanea Misura della forza

1. Sollevare la posizione tallone intrappolato circa 4 micron sopra il vetro di copertura, e spostarlo nella posizione di fase precedentemente salvata (vedi punto 3.2).
2. Spostare il tallone giù intrappolato verso l'assone finché non tocca la neuriti. La collisione tra tallone intrappolati e l'assone è controllata dal segnale QPD z rilevamento spostamento del tallone intrappolato nella direzione assiale.
3. Attendere 10 sec con il tallone intrappolata spinto contro l'assone di favorire l'adesione alla membrana neuriti.
4. Spostare il micro fase di spostare il tallone intrappolato dal assone, e quindi verificare la sua adesione alla membrana cellulare. Se il tallone aderito, sfugge dalla trappola ottica.
5. Spostare indietro la trappola laser sul tallone aderitoe attivare il ciclo forza-clamp con condizione forza pari a zero. In tal modo, i riposiziona piezo-fase del tallone, allegate alla cella, sul centro trappola ottica. Se il sistema non dispone di un controllo di retroazione, la posizione trappola laser può essere spostata dal palco microscopio per centrarlo sulla sonda aderito. Il centro della trappola è raggiunto quando i segnali QPD sono gli stessi quando il tallone è bloccata e non aderisce alla cella (x ed y segnali QPD pari a zero, e il segnale z QPD dà la stessa tensione somma dei quattro quadranti come quando il tallone è intrappolato lontano da qualsiasi superficie).
6. Impostare una condizione forza-clamp sull'asse z, posizionando il laser trapping leggermente nel centro del tallone (circa 100 nm), per generare un precarico sul aderito sonda intrappolato. Nel caso il sistema non è dotato di un controllo di forza-clamp, la posizione trappola ottica può essere sollevato fino a passi di 25 nm dalla fase microscopio. Il segnale z QPD permette il monitoraggio. Pertanto, utilizzare thiil segnale s per impostare la posizione della trappola laser rispetto alla sonda aderito. Tale pre-tensionamento è necessario per rilevare la tensione sulla membrana dopo la lesione assonale, e la conseguente diminuzione del moto browniano della sonda aderito. Un approccio simile è stato proposto di misurare il rilascio di tensione in un tether membrana da immagini video ^19.
7. Spegnere il ritorno di forza-clamp per misurare la forza sulla sonda aderito nella condizione di posizione-clamp (il piezo-stadio è bloccato).
8. Avviare la registrazione simultanea delle posizioni del tastatore intrappolate attraverso l'interferometro (20 KHz frequenza di campionamento), e la cellula durante laser assotomia time-lapse imaging in campo chiaro (20 Hz frame rate).
9. Accendere il laser UV per fornire impulsi laser fino a una lesione diventa visibile sull'immagine del l'assone (solitamente 200-400 impulsi ottici sono necessari Energia per impulso: 25. NJ), quindi spegnere il laser UV.
10. Continuare la registrazione dal interferometro per circa 3 min, fino a quando la x, yez QPD tracce di raggiungere un plateau.

7. Quantificare il totale tensione di uscita

1. Convertire le tracce QPD registrati (in Volt) per la sensibilità calibrata della trappola ottica, per ottenere le rispettive tracce in nanometri.
2. Filtrare il x, y, z e tracce di spostamento da un filtro passa alto con tagliato a 10 Hz.
3. Calcolare la varianza totale delle tracce filtrati rappresentano il moto browniano del tallone intrappolato. Calcola la varianza a 25 msec per le finestre di tempo di 500 msec (10.000 punti dati) ²⁰ sovrapposte. L'elevato filtraggio delle tracce passaggio esclude le variazioni del moto browniano a causa della fluttuazione della membrana o movimento actina corticale. Il moto browniano del tallone è ridotta dalle forze ottici e le forze di adesione sulla membrana cellulare. Quando la membrana è tesa a causa del rilascio di tensione sua viscosità è aumentata e quindi il moto browniano della perlina, rilevata immediatamente dopo assotomia, inizia a diminuire.
4. Definire t0: l'inizio della diminuzione del moto browniano varianza, dopo la consegna di energia laser UV. L'istante t0 tempo indica l'inizio del ceppo membrana.
5. Definire t1: la fine della diminuzione del moto browniano varianza (quando raggiunge un plateau). L'istante t1 tempo indica la fine del ceppo membrana.
6. Eseguire video tracking di detriti o un graffio sul supporto vetro di copertura, per misurare qualsiasi deriva del campione durante la misurazione della forza. Per tenere traccia della particella sul supporto di vetro, per prima cosa applicare soglie per le immagini in campo chiaro, per ottenere una pila di immagini binarie con la particella in bianco su sfondo nero. Poi, si traccia il centro particella di massa con una precisione sub-pixel (utilizzando il software freeware ImageJ).
7. Sottrarre la deriva misurato dalle tracce QPD spostamento. Moltiplicare le tracce QPD drift-corretti dai rispettivi rigidità ottico calibrato (k _x, k _{y, k z) per ottenere le Fx, Fy, Fz tracce in piconewtons.}
8. Calcolare la traccia forza totale come F _tot = √ ⁽² + Fx Fy Fz ² + ^2).
9. Calcola il rilascio totale di forza tra T0 e T1 come F _rilasciato = F _tot (t1) - F _tot (T0). La forza misurata in t0 deve essere sottratto perché è dovuto allo spostamento della sonda dal centro trappola, quando aderisce al tallone neuriti.
10. Calcolare l'area di contatto tra il tallone neuriti intrappolati e la posizione di punto laser UV: sulla misura di immagine in campo chiaro le lunghe (L) e corto (D) assi del neuriti intrappolato tra il tallone e la posizione di punto laser UV. L'area di contatto assone _assone è A = L x D.
11. Normalizzare il totale _rilasciato dalla pubblicato forza F l'area di contatto Un assone _assone.

Risultati

La cella genera forze di trazione sul substrato dai suoi adesioni focali. Forza generata da elementi del citoscheletro sono in equilibrio con la forza di contrasto del substrato cultura. Dopo laser indotta lesione del neurite, alcuni cavi citoscheletro Tensed sono interrotti e la loro tensione equilibrata viene rilasciato perché la forza opposta del substrato adesione è eliminato. La tensione rilasciata è parzialmente distribuita sulle adesioni focali inalterati, e il tallone attaccato alla membrana cellulare, tenuto...

Discussione

Riportiamo in questo lavoro un metodo quantitativo per confrontare l'adesione al substrato neuriti cultura, effettuando la misurazione simultanea forza spettroscopia laser durante lesione cellulare indotta. Il rilascio della tensione misurata è correlato al grado di adesione della cellula al substrato: celle con un numero più elevato di adesioni focali dovrebbero rilasciare meno tensione. Misurando il rilascio di tensione in termini di piconewtons fornisce una grandezza fisica da cui calcolare la assonale adesione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated	Bangs laboratories	PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit	Polyscience	19539
EQUIPMENT
IR laser	IPG Laser GmbH	YLM-5-SC-LP	ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator	Hamamatsu	LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software	Optics group, University of Glasgow	Free downloadable software	http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ	Hamamatsu	Free downloadable software	http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD	Thorlabs	S5980 with C5460SPL 6041 board	Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD	Teem Photonics	PDA100A-EC	Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser	AA-optoelctronics	PNV-001525-040	Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator	Olympus	MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope	Andor	BX51	Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD	Warner Instruments	V887ECSUVB EMCCD
Peltier device	Physic Instruments	QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage	National Instruments	Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq		NI PCI-6229	Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine			Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop