Gli<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-saggio come Xenograftmodel per Sarcoma

Riepilogo

Gli In ovo Corioallantoidea membrana (CAM) si innesta con tessuti freschi sarcoma di derivazione tumorale, le sospensioni di cellule singole, e stabilite le linee cellulari del sarcoma fluorescente permanenti e transitori. Il modello è utilizzato per lo studio del trapianto (viabilità, indice di proliferazione Ki67, necrosi, infiltrazione) e host (fibroblasti infiltrazione, crescita interna vascolare) comportamento.

Abstract

Sarcoma è una malattia molto rara, che è di natura eterogenea, tutte ostacolando lo sviluppo di nuove terapie. Pazienti sarcoma sono candidati ideali per la medicina personalizzata dopo stratificazione, che spiega l'attuale interesse per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto riproducibile e di basso costo per questa malattia. Il corioallantoidea membrana pulcino è un ospite immunodeficienti naturale in grado di sostenere i tessuti e le cellule innestate senza restrizioni specie-specifici. Inoltre, esso è facilmente accessibile, manipolato e ripreso con stereomicroscopia ottica e fluorescenza. Istologia permette ulteriori analisi dettagliata delle interazioni cellulari eterotipiche.

Questo protocollo descrive in dettaglio l'in ovo innesto della membrana corioallantoidea con sarcoma dei tessuti derivati ​​freschi del tumore, le loro sospensioni di cellule singole, e stabilite le linee cellulari del sarcoma permanenti e transitori fluorescente (Saos-2 e SW1353). La sopravvivenza ratto pulcinoes sono fino al 75%. Il modello è utilizzato per lo studio del trapianto (viabilità, indice di proliferazione Ki67, necrosi, infiltrazione) e host (fibroblasti infiltrazione, crescita interna vascolare) comportamento. Per localizzata innesto di sospensioni di cellule singole, ECM gel offre vantaggi significativi rispetto ai materiali di contenimento inerti. L'indice di proliferazione Ki67 è legato alla distanza delle cellule dalla superficie della CAM e la durata della applicazione sul CAM, quest'ultimo determina un intervallo di tempo per l'aggiunta di prodotti terapeutici.

Introduzione

Sarcoma è un tumore raro del tessuto connettivo con un alto tasso di mortalità a causa di terapia resistenza ^1,2. I progressi nella sopravvivenza del paziente è ostacolato dalla loro bassa incidenza annuale, la loro grande diversità, e il fatto che le cellule del sarcoma sono segnalati per essere difficile da coltura in vitro ^3,4.

L'uso di cellule in coltura per la valutazione preclinica terapia ha rivelato che le nuove molecole, apparentemente attivi in vitro non sempre riflettono i risultati in ambito clinico. Inoltre, aberrazioni genomiche rivelati da array di espressione genica non sono sempre correlati alle caratteristiche di comportamento tumorali nel singolo paziente ^5-7. Per cercare di risolvere questi problemi, la medicina personalizzata ha acquistato importanza, che si riflette in una maggiore ricerca di modelli di xenotrapianto ^8-12.

I test in vivo ha il vantaggio di riflettere la complessa interazione tra ccellule Ancer e dell'ambiente tessuto ospite in tumori solidi, necessari per la proliferazione del cancro e l'invasione ^13. Attualmente si studia l'uso del dosaggio a membrana Chorio-allantoideo (CAM-assay) come un modello di xenotrapianto riproducibile per sarcoma ^14,15. Questo saggio è ampiamente usato per lo studio di angiogenesi tumorale ^16,17. In letteratura, tuttavia, abbiamo trovato protocolli diversi per questo test, mentre altri studi hanno osservato una marcata differenza nella crescita o angiogenesi secondo diversi protocolli ^18,19.

In questo articolo analizziamo l'effetto delle condizioni del CAM-dosaggio variabile sul comportamento delle cellule tumorali utilizzando innesti, sospensioni di cellule singole derivate da tumore e colture cellulari sarcoma affermati.

Protocollo

Vedere la Figura 1 per una panoramica

Materiale tumorale

1. Raccogliere ed elaborare campioni tumorali

Per l'uso del materiale del paziente, l'approvazione del comitato etico è necessario, e il consenso informato deve essere ottenuto dal paziente.

1. Raccolto materiale rappresentativo (minimo 1 cm ³⁾ al momento dell'intervento, sia una biopsia o una resezione di un sarcoma. Il corretto sito di biopsia è definita utilizzando dinamico contrasto per risonanza magnetica.
2. Posizionare immediatamente il materiale in un flacone sterile contenente DMEM supplementato con 1.000 U penicillina e 1 mg / ml di streptomicina.
3. Trasportare il flacone immediatamente (30 - 90 min) al laboratorio.

Tutte le seguenti procedure sono eseguite sotto flusso laminare.

4. Versare il contenuto della fiala in una piastra di Petri sterile.
5. Mettere il campione di tumore in piccole parti di al massimo 1 mm ³ utilizzando un bisturi sterile. Rimuovere tutte le parti calcificate in quanto tendono a mettere in pericolo l'ulteriore elaborazione del tessuto.
6. Casualmente prendere 10 innesti tumorali per la domanda da CAM.

2. Preparazione delle derivate dal tumore sospensioni singola cella

Durata approssimativa: 3 ore

1. Pesare il tessuto rimanente del campione.
2. Mettere 2 - 4 g di tessuto in un tubo dissociatore, più di una valvola può essere richiesto per digerire tutto il tessuto tumorale residuo.
3. Per la digestione di 2 - 4 g di tessuto, aggiungere 2,5 ml di soluzione di collagenasi 2 (500 U / ml RPMI 1640) e 2,5 ml di soluzione di DNasi (22 KU / ml RPMI 1640).
4. Elaborare il tessuto secondo il protocollo h_tumor dissociatore. Questo comporta due cicli di incubazione a 37 ° C in incubatore CO ₂ mentre il tubo viene agitato delicatamente per 30 min.
5. Filtrare la sospensione rimanente attraverso un colino cellula 150 pm.
6. Centrifugare il lisato a 1.000 rpm per 5 min.
7. Rimuovere il surnatante.
8. Risospendere il pellet in 10 ml di tampone di lisi degli eritrociti (ELB), consentendo 10 minuti di incubazione con sospensione regolare.

Nota: tampone di lisi degli eritrociti è prodotto come segue: Aggiungere 0,037 g di EDTA, 0,99 g K ₂ HPO _4, 8,29 g di NH ₄ Cl a 1,000 ml di acqua, usare NaOH 10 N per regolare il pH a 7,3, filtro sotto pressione attraverso una 0,22 micron filtrare. Conservare a 4 ° C.

9. Aggiungere 25 ml di terreno di coltura (DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, e 100 pg / ml streptomicina) per arrestare la reazione.
10. Centrifugare la sospensione a 1000 rpm per 5 min. Il colore del pellet dovrebbe essere bianco ora.
11. Rimuovere il surnatante.
12. Aggiungere 5 ml di terreno al pellet. Filtrare la sospensione attraverso un colino cella 70 micron.
13. Contare il numero di cellule vive / ml mediante un contatore automatico cella.

3. CAncer Linee Cellulari

SAOS2 cellule di osteosarcoma (numero ATCC: HTB-85) che esprimono maggiore proteina fluorescente verde sono state elettroporate da pEGFP-C1 vettoriale utilizzando la linea cellulare Nucleofector Kit V secondo il protocollo del produttore. Stabilire linee cellulari stabili, le cellule transfettate sono state selezionate in G418 (1 mg / ml) per 4 settimane in linea con le precedenti stabilita protocollo ^20. Inoltre ordinamento è stato eseguito da fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) secondo le istruzioni del produttore.

Cellule dalla linea cellulare SW1353 condrosarcoma (numero ATCC: HTB-94) o sospensioni di cellule singole tumorali appena preparati sono etichettati utilizzando una membrana lipofilo fluorescente rossa macchia.

1. Rimuovere le cellule dal pallone di coltura in modo classico utilizzando tripsina (0,5% peso / vol) di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; 0,2% peso / vol) di soluzione.
2. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 1000 rpm.
3. Rimuovere il supernatant.
4. Aggiungere 1 ml di mezzo privo di siero e 5 microlitri DII (Vybrant Rosso) / 10 ⁶ cellule.
5. Avvolgere la fiala in un foglio di alluminio e metterlo nel incubatore CO ₂ per 10 min a 37 ° C.
6. Centrifugare nuovamente per 5 min a 1000 rpm e rimuovere il surnatante.

Saggio membrana corioallantoidea

1. Uovo di incubazione

1. Sono tenuti uova fecondate da un vivaio commerciale locale garantendo il 95% la fecondazione delle uova.
2. Uova fecondate possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 10 giorni.

Nota: prima di iniziare l'incubazione, sporcizia, piume ed escrementi vengono accuratamente rimossi dai gusci d'uovo meccanicamente da eliminare a secco con i tovaglioli di carta, che hanno una ruvida piuttosto che una struttura di superficie morbida. Pulendo le uova con il 70% di etanolo denaturato o altro reagente di pulizia riduce significativamente il tasso di sopravvivenza degli embrioni di pollo.

3. Mettere le uova in incubator su un lato, che segna la superficie superiore. Il giorno in cui le uova sono messe in incubatrice è designato 0 giorno di sviluppo embrionale.
4. Impostare la temperatura di incubazione a 37,8 ° C, e l'umidità al 47%. Assicurarsi che l'opzione di rotazione automatica è disattivata.

2. Schiusa delle uova

Durata: ± 60 min per 25 uova

Il giorno di sviluppo 3, le uova sono aperti in flusso d'aria laminare. Aprire le uova in ulteriori risultati inerenti allo sviluppo sui palchi dei danni al CAM, come la membrana tende ad attaccarsi al guscio. Una lampada a infrarossi viene utilizzata per mantenere le uova caldo durante la procedura. Per migliorare la sterilità, si consiglia l'uso di guanti.

1. Mettere l'uovo nel portauovo, con il lato contrassegnato rivolto verso l'alto.
2. Abbassare il livello della CAM rimuovendo due ml di albumina attraverso un ago 18 G inserita sulla punta dell'uovo. Se l'ago è spuntato dopo perforazione diversigusci d'uovo, sostituire l'ago. Se no, troppa forza deve essere esercitata, con conseguente danno per il tuorlo d'uovo o frattura del guscio. A volte, l'ago è bloccato dal chalazae, una delle due bande a spirale sospendono il tuorlo in albume. Questo può essere risolto spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso fino a quando il blocco è stato risolto. Se tuorlo viene aspirato nella siringa, sostituire l'ago e la siringa. A volte l'embrione muore dopo questo evento. Se una quantità insufficiente di albume viene rimosso, il CAM sarà danneggiato quando il guscio viene rimosso.
3. Applicare una pellicola semipermeabile adesivo sul lato marcato superiore della calotta, per evitare la fuoriuscita di particelle shell sulla CAM durante il taglio la finestra.
4. Fare un foro di introduzione con un piccolo punteruolo alla superficie dell'uovo.
5. Tagliare una finestra di 1 cm ² nella shell, con un paio di forbici chirurgiche sterili appuntiti.
6. Cuore pulsante dell'embrione e dei vasi comunicanti possono essere osservati al secolosuperficie e del tuorlo d'uovo. Togliere le uova non fecondate o embrioni morti. Un aspetto interrotto dei vasi sanguigni che caratterizza gli embrioni morti.
7. Sigillare la finestra con un film adesivo semipermeabile. Non è necessario coprire il sito di puntura, salvo che il serbatoio ha incrinato durante l'inserimento dell'ago.

3. Procedura di inoculo

Durata: ± 1 h ogni linea cellulare

Il pulcino di sviluppo embrionale giorno 9, le uova vengono inoculati sotto flusso d'aria laminare.

Valutazione della cellula tumorale diffondendo la CAM richiede contenimento delle cellule ad una superficie limitata durante l'inoculo. Matrigel è una matrice (ECM) gel extracellulare dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm frequentemente utilizzata in condizioni di coltura delle cellule sperimentali. Si tratta di un fluido quando raffreddato, ma a polimerizzazione attivato termicamente quando portato a 20 - 40 ° C, formando così un gel stabile. Durantegli esperimenti, Matrigel è conservato in una scatola contenente ghiaccio fondente.

Nota: Noi insistiamo a non utilizzare lamelle forate. Abbiamo osservato l'attaccamento e la crescita delle cellule tumorali innestate sul disco di plastica di polarizzazione in tal modo il potenziale di crescita delle cellule della membrana stessa.

1. Risospendere il pellet cellulare in gel ECM raffreddato ad una concentrazione di 10 ⁶ cellule/100 gel ECM microlitri. Conservare questa soluzione sulla fusione del ghiaccio.
2. Parte delle accise della membrana semipermeabile con un paio di sterile chirurgica sotto flusso d'aria laminare. Se il film adesivo viene rimosso completamente, questo si tradurrà in una proporzione maggiore di morte embrionale causa della contaminazione.
3. Toccare destra CAM sotto la finestra guscio leggermente con una bacchetta di vetro sterile, al fine di rimuovere lo strato di cellule epiteliali. Toccando la CAM con una bacchetta di vetro sterile dimostra meno traumatico rispetto all'utilizzo di un bisturi n ° 11, che richiede più praticità ed esperienza. Possono verificarsi piccole emorragie.
4. Adding materiale tumorale.
5. Per innesti tumorali: abbassare delicatamente un pezzo di tessuto sulla CAM con un paio di pinze sterili, senza schiacciarla.
6. Per la procedura di gel ECM: 4x Aggiungere 25 microlitri della cellula-ECM sospensione gel alla CAM, uno sopra l'altro, permettendo al gel ECM per polimerizzare tra le applicazioni. In questo modo viene creata una placca aderente contenente le cellule tumorali.
7. Sigillare di nuovo la finestra di shell con un film adesivo semipermeabile.

4. Imaging e raccolta del CAM

Durata: 2 ore per 25 uova

Il pulcino di sviluppo embrionale giorno 16, le camme sono raccolti. Lavorare sotto flusso d'aria laminare non è necessario.

1. Ingrandire la finestra con un paio di forbici chirurgiche. Assicuratevi di non tagliare troppo basso, altrimenti la CAM sarà danneggiato, con conseguente sanguinamento dei vasi feriti.
2. Aggiungere 300 - 500 ml di PBS ^D con una pipetta sulla setta CAMione contenente il materiale inoculato. Se non si utilizzano sonde fluorescenti, formaldeide tamponato può essere utilizzato come tale rende la membrana rigida per facilitare il taglio della membrana.
3. Fare una fotografia della CAM nell'uovo attraverso un microscopio a fluorescenza stereo, dotato di una fotocamera digitale a colori, utilizzando sia la GFP o il filtro DSR, e senza filtro. Per gli innesti tumorali, tutte le fotografie sono fatte senza filtri. L'illuminazione dall'alto da luci a LED è fortemente raccomandato durante fotografare (Figura 2).
4. Record di migrazione delle cellule tumorali per le cellule marcate. I confini dei tumori possono essere irregolari e sfilacciati. Cellule sparse possono essere presenti vicino ai confini del tumore. In alcuni esemplari, possono essere osservate file di cellule tumorali (Figura 3).
5. Tagliare la membrana con un paio di forbici sterili al confine sdraiato contro il guscio.
6. Posizionare il CAM raccolte in una capsula di Petri sterile pieno di PBS ^D o tamponata performaldeide.
7. Fare una fotografia sia del lato superiore e il lato inferiore della CAM, con e senza filtro.
8. Mettere la membrana in un contenitore etichettato con formaldeide tamponata per almeno 72 ore.
9. Incorpora la Cam in paraffina e li prepara per l'esame istologico. Aver cura di tagliare gli innesti tumorali al centro del nodulo, assicurandosi che la superficie di taglio è parallelo al fondo della cassetta. Se non, l'interazione tra la camma e l'innesto del tumore non sarà visibile. La stessa strategia vale per le placche gel ECM: la superficie rivolta verso la lama di taglio deve essere perpendicolare alla placca.

5. Valutazione istologica

Ematossilina-eosina e Ki-67 immunoistochimica sono state eseguite per ulteriori chiarimenti, se necessario. L'immunoistochimica è stata eseguita su sezioni di tessuto incluse in paraffina fissati in formalina di 3,5 micron di spessore, utilizzando un Stainer presentazione automatica secondoalle istruzioni del produttore. È stato usato un anticorpo monoclonale di topo primario Ki-67 (clone MIB-1, diluizione 1/100). Indotta dal calore epitopo recupero è stata effettuata utilizzando cellule condizionata 1, e la visualizzazione è stato raggiunto con l'universale DAB Detection Kit, secondo le istruzioni del produttore. Disidratazione delle sezioni di tessuto è stata effettuata utilizzando un Montavetrini automatizzato.

Per il linee cellulari SW1353 SAOS2 e, il numero di Ki67-positive e negative Ki67-cellula nuclei/100 micron ² sono stati contati in tre zone: una vicino al confine della CAM, uno vicino la superficie e una al centro di il gel placca ECM. Questa procedura è stata ripetuta per ogni slitta 6x Ki-67 tinto. L'indice di proliferazione è stata determinata per ciascun vetrino dividendo il numero di cellule Ki67-positive per il numero totale di cellule contate.

Necrosi è definito da una perdita di dispersione fine della cromatina nel nucleo della cellula, accompagnato da fading dei margini delle celle distinte. Per xenotrapianti, necrosi è segnato come completo, parziale (spesso in superficie), o assenti. Infiltrazione di cellule tumorali nella camma è definita dalla osservazione di cellule tumorali nel mesoderma della CAM, ed è segnato come presente o assente.

Tre elementi sono segnati per comportamento host. Fibroblasto infiltrazione è definito come cellule allungate lasciando la CAM e invadendo l'innesto del tumore / targa, ed è segnato come presente o assente. Vascolare ricrescita può osservare come la crescita interna di vasi proliferanti pulcino, caratterizzati dalla presenza di eritrociti nucleati pulcino.

Risultati

Valutazione della CAM

Innesti tumorali diventano aderente al CAM (Figura 2A). Sospensioni di cellule singole a partire da materiali paziente spesso mostrano una, la placca leggermente rialzato secca (Figura 2D). Dopo l'asportazione della CAM, contrassegnato raggrinzimento della membrana avviene (figure 2E e 2F).

Per le linee cellulari commerciali la placca diventa più opaco nel tempo, indicando...

Discussione

Tempo di inoculazione e raccolto

Temporizzare il giorno di inoculazione è stata effettuata utilizzando SAOS2 in ECM gel (36 CAM) e variava tra lo sviluppo embrionale giorno 5 e 10.

Prima giornata di incubazione 9, il CAM non è stato sempre abbastanza grande per sostenere il gel ECM abbiamo applicato. Alla raccolta, le cellule tumorali a volte hanno dovuto essere recuperato dal CAM più profondo, e alcuni campioni di gel ECM giacevano sciolto nel albume o in CAM. N...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line Nucleofector Kit V	Amaxa	VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)	Sigma Aldrich	C6885
DMEM	Invitrogen	41965-039
DMSO	Sigma	D8418
Dnase solution	Sigma Aldrich	DN25
G418	Invitrogen	11811031
Matrigel	Sigma-Aldrich	E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67	Dako Denmark	MIB-1
Paraformaldehyde	Fluka	D76240
PBS	Invitrogen	20012019
PBSD	Invitrogen	14040083
peGFP-C1 vector	Clontech	632470
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15140163
RPMI	Invitrogen	22409-015
Trypsin-EDTA solution	Invitrogen	25300054
Vybrant cell-labeling DiI	Lifetechnologies	22885
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
digital color camera	Leica	DFC 340 FX
Digital Egg Incubator	Auto Elex Co	R-COM 50
FACS	BD Biosciences	FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube	Miltenyi Biotech	130-093-237
Gentlemacs Dissociator	Miltenyi Biotech	130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol	Miltenyi Biotech
[header]
semipermeable adhesive film (Suprasorb F)	Lohmann&Rauscher	20468
stereo fluorescence microscope	Leica	M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper	Sakura	6400
ultraView Universal DAB Detection Kit	Ventana Medical Systems Inc	760-500
Ventana Automated Slide Stainer	Ventana Medical Systems	Benchmark XT