Modifica multi-scala di impianti metallici con gradienti poro, polielettroliti e il loro monitoraggio indiretto<em&gt; In vivo</em

Riepilogo

In questo video, dimostreremo tecniche di modificazione per porosi impianti metallici per migliorare la loro funzionalità e per controllare la migrazione delle cellule. Le tecniche includono lo sviluppo di gradienti pori per controllare il movimento delle cellule in 3D e produzione di membrana basale imita per controllare il movimento delle cellule in 2-D. Inoltre un metodo HPLC-based per il monitoraggio integrazione dell'impianto in vivo mediante analisi delle proteine ​​del sangue è descritto.

Abstract

Impianti metallici, in particolare impianti di titanio, sono ampiamente utilizzati in applicazioni cliniche. Tessuto in crescita e l'integrazione di questi impianti nei tessuti sono parametri importanti per i risultati clinici di successo. Al fine di migliorare l'integrazione del tessuto, sono state sviluppate impianti metallici porosi. Porosità aperta di schiume metalliche è molto vantaggiosa, in quanto le aree del poro possono essere funzionalizzata senza compromettere le proprietà meccaniche di tutta la struttura. Qui si descrivono le modifiche che utilizzano impianti in titanio poroso a base di microsfere in titanio. Utilizzando le proprietà fisiche intrinseche quali idrofobicità di titanio, è possibile avere gradienti pori idrofobi entro microperla impianti metallici based e allo stesso tempo di avere una membrana basale mimo basa su idrofili, polimeri naturali. Gradienti poro 3D sono formate da polimeri sintetici come acido poli-L-lattico (PLLA) mediante metodo freeze-estrazione. 2D nanofibrillar surfacce sono formati utilizzando collagene / alginato seguita da una fase di reticolazione con un reticolante naturale (genipin). Questo film nanofibrillar è stato costruito da strati con il metodo di deposizione delle due molecole di carica opposta, collagene e alginato strato (LBL). Infine, un impianto dove diverse aree possono ospitare diversi tipi di cellule, in quanto ciò sia necessario per molti tessuti multicellulari, può essere ottenuto. Da, in questo modo il movimento cellulare in direzioni diverse da diversi tipi di cellule può essere controllato. Tale sistema è descritto per il caso specifico di trachea rigenerazione, ma può essere modificata per altri organi bersaglio. Analisi della migrazione cellulare e le possibili metodi per la creazione di diversi gradienti pori vengono elaborati. Il passo successivo nella analisi di tali impianti è la loro caratterizzazione dopo l'impianto. Tuttavia, l'analisi istologica di impianti metallici è un processo lungo e ingombrante, quindi per il monitoraggio reazione host per impianti metallici in vivo di unlternative metodo basato sul monitoraggio proteine ​​del sangue CGA e diverso è anche descritto. Questi metodi possono essere utilizzati per lo sviluppo in vitro la migrazione su misura e test di colonizzazione e di essere utilizzato anche per l'analisi di funzionalizzati impianti metallici in vivo senza istologia.

Introduzione

Attualmente sono disponibili impianti metallici sono adatti per applicazioni portanti, ma la loro non degradabilità richiede disegni che garantiscono una forte interfaccia con il tessuto circostante li ^1. Prevedendo strutture che facilitano la crescita cellulare in-e la colonizzazione in vivo, la vita di impianti metallici può essere prolungato ^2. Apertamente porosi impianti metallici sono materiali per l'ingegneria dei tessuti interfaccia promettenti e anche per garantire una buona colonizzazione degli impianti. Essi sono stati utilizzati attivamente, come impianti ortopedici e anche come protesi tracheali ^3-5. Tuttavia, vi sono ancora problemi che devono essere risolti come il controllo preciso movimento delle cellule nelle zone dei pori. Incapacità di controllare questo processo potrebbe portare alla colonizzazione incompleta in una estremità e restenosi nell'altra. Inoltre un'ulteriore funzionalizzazione di questi impianti è necessario per raggiungere funzioni superiori come, consegna di fattori di crescita,vascolarizzazione diretto e movimento simultaneo di diversi tipi di cellule ^6-8. Per impianti tracheali, questo è cruciale come la colonizzazione dell'impianto da un tessuto vascolarizzato è auspicabile. Tuttavia, il tessuto incontrollata crescita interna al lume della trachea è indesiderabile perché diminuisce implantare pervietà.

Una possibilità di controllare il movimento delle cellule è la dimensione di esclusione. Conoscendo la dimensione delle cellule bersaglio e la loro capacità di interagire con un dato polimero sintetico è possibile sviluppare gradienti di pori che possono determinare efficacemente la profondità di movimento cellulare. Ad esempio creando un'architettura poro che è abbastanza grande per l'ingresso di cellule del tessuto connettivo, quali fibroblasti extraluminally, ma abbastanza piccoli (meno di 10 micron) per impedire il loro movimento intraluminale un efficace controllo colonizzazione di una protesi tubolare può essere raggiunto.

Dal metodi di creazione dei pori disponibili come freeze-essiccazione ding, la lisciviazione di particelle, gas schiumogeno ^9,10, il più facile da adattare il metodo per la rapida formazione di gradienti pori con quantità minima di attrezzature necessarie è freeze-estrazione ^11. In questo metodo, una soluzione polimerica è congelato in una miscela binaria di un solvente organico ed acqua. Successivamente, il solvente viene scambiato tramite estrazione con un liquido miscibile pre-raffreddata come etanolo. Congelamento e condizioni di estrazione determinano la forma e la dimensione dei pori e se l'estrazione avviene in un modo in cui può essere controllato il movimento della soluzione di estrazione, forma e dimensione dei pori può essere modulata direzionalmente.

Secondo passo per tessuti multicellulari è la formazione di barriere porose tra diversi tipi cellulari per controllare il loro interazione. Ciò è necessario anche per la disponibilità di diversi microambienti per diversi tipi di cellule a seconda delle loro esigenze ^12,13. Trachea è un organo tubolare che collega laringe con BRONCHi. Ha un rivestimento interno pseudostratificato epitelio ciliare con interdispersed cellule caliciformi che producono muco. La struttura 3D della trachea e la stabilità è mantenuta da cartilagine a forma di C-ring. Così, in una trachea artificiale ci dovrebbe essere una giunzione definita tra il tessuto connettivo e lo strato epiteliale ciliare. Mentre una struttura 3D è necessario del tessuto connettivo, la migrazione delle cellule epiteliali richiede una membrana-come seminterrato superficie per ottenere movimento direzionale e la chiusura della ferita. Polielettrolita film multistrato (PEM) sono una possibile opzione per ottenere seminterrato imita membrana. Metodo layer-by-layer (LBL) è un processo versatile per ottenere rivestimenti superficiali sottili e funzionale. Essa si basa su interazioni elettrostatiche di due polielettroliti di carica opposta e il loro accumulo nei maniera sequenziale per ottenere rivestimenti di superficie su scala nanometrica le cui proprietà può essere variato cambiando semplicemente variabili come specie polielettrolita, pH,numero strati, aggiunta di uno strato di tappatura, reticolazione ecc Uno dei principali vantaggi del metodo LBL è la sua capacità di conformarsi alla topografia del substrato sottostante. Così, in condizioni controllate questo metodo può essere utilizzato anche per ottenere la copertura superficiale di strutture porose. Se collagene viene utilizzato come uno dei polielettroliti è possibile ottenere strutture nanofibrillar che possono mimare la superficie della membrana basale. L'idrofobicità del titanio consente lo sviluppo di tali strutture e fibrillarity può essere conservato in strati spessi ^14. Questo modo attaccamento e movimento di cellula sulla superficie può anche essere controllato. Utilizzando freeze-estrazione e pellicole di rivestimento Lbl sequenzialmente, una struttura in cui il movimento delle cellule può essere controllato lateralmente e longitudinalmente circonferenzialmente può essere ottenuto ^15.

Qui si descrive due metodi di modifica per i nuovi impianti in titanio, utilizzando il loro comportamento idrofobico che può essereesteso a modifica di vari impianti porosi: i) formazione di gradienti di micropori entro i macroporosi con impianti di titanio idrofobe, polimeri sintetici ii) formazione di uno spesso strato di film polimerico sulla superficie dell'impianto che supporta la crescita cellulare e la formazione di rivestimento multistrati polielettrolita. Questi metodi possono essere usati in sequenza o separatamente. Essi forniscono strutture che garantiscono la migrazione controllata e organizzazione spaziale dei diversi tipi di cellule nei tessuti multicellulari ^16,17. Per il caso specifico della trachea, il risultato desiderato per l'impianto sarebbe la colonizzazione da tessuto fibrovascolare entro i gradienti micropori senza restenosi e la formazione del rivestimento interno di cellule epiteliali ciliate sui multistrati polielettrolita.

Un modo per controllare l'integrazione della protesi è di fare piccoli interventi chirurgici nel periodo della loro integrazione con l'host in situ. Al fine di essere in grado tØ decidere la tempistica degli interventi, è importante disporre di informazioni sugli effetti sistemici della protesi. Proteina C-reattiva (CRP) è stato utilizzato per il monitoraggio di infezione e risposta infiammatoria in ambito clinico. Cromogranina A (CGA) può anche essere usato in modo simile e potrebbe fornire risultati più accurati per osservare il livello di infiammazione ^18. Come un possibile modo di osservare l'integrazione impianto metallico in vivo, vi presentiamo una procedura di monitoraggio continuo di effetti sistemici degli impianti da parte caratterizzazione di campioni di sangue di animali con cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e il successivo sequenziamento di proteine. Elaborazione di questo metodo può essere utilizzato per eludere analisi istologica end-point regolare. Taglio istologica di impianti metallici è un processo lungo, complicato e costoso e può essere effettuata solo in momenti specifici. Per questo motivo, ben progettato analisi del sangue forniscono informazioni circa la salute robusta impianto sarebbeessere possibili vie per diminuire la sperimentazione animale come richiesto dalle recenti norme UE in materia di sperimentazione animale.

I metodi qui presentati possono essere usati per migliorare le prestazioni di impianti metallici mediante funzionalizzazione o di avere un modo alternativo di monitoraggio degli impianti esistenti.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Preparazione di gradienti micropori in macroporose impianti metallici

1. Pulire gli impianti (ad esempio impianti in grado perle di titanio medico con una gamma di dimensioni di 400-500 micron, Neyco SAS, Francia) con etanolo e poi ultrasuoni in acetone per 15 min.
2. Progettazione e produzione stampi in teflon a seconda delle dimensioni dell'impianto e la forma (per esperimenti standard sono utilizzati stampi cilindrici di 1,5 cm di diametro, con una altezza di 2 cm). Stampi devono essere modulari, in modo che le alcune parti possono essere rimossi durante l'estrazione. Tale disegno stampo assicura il controllo sul processo di estrazione forzando il movimento del liquido di estrazione in modo diretto.
3. Per impianti tubolare destinato a sostituire trachea, la struttura dovrebbe essere composto da tre parti: i) una parte inferiore per determinare le dimensioni dell'impianto, ii) un mandrino e iii) un nucleo esterno che è rimovibile. In questo modo, il gradiente dimensione dei pori può essere formata dall'esterno verso l'interno.
4. Preparare la soluzione di polimero sintetico (PLLA): Per la soluzione PLLA freeze / estrazione deve essere preparato in una miscela binaria di diossano e acqua (87:13%, v: v).
5. Scaldare la miscela a 60 ° C per ottenere una soluzione omogenea. 60 ° C scelto in quanto è il limite superiore della resistenza delle temperature per le siringhe di vetro di precisione che deve essere utilizzato per l'introduzione della soluzione in impianti.
6. Se vengono usati ad alta concentrazione (≥ 6%), soluzioni di PLLA ad elevato peso molecolare, introdurre la soluzione nel implantare immediatamente dopo il riscaldamento. Altrimenti gelificazione della soluzione avviene senza immersione completa.
7. Calcolare il volume della soluzione di polimero necessaria rispetto alla porosità della protesi, per il cambiamento precisione nel volume della soluzione congelata può essere preso in considerazione.
8. Introdurre la soluzione in impianti con le siringhe di vetro di precisione con precisione di 0,1 microlitri. Il limite inferiore per la concentrazione del polimero è3% per la formazione di pendenze riproducibile pori mentre diventa difficile ottenere una distribuzione omogenea nei campioni di spessore superiore al 6%. Tuttavia, per applicazioni specifiche possono essere usate altre concentrazioni.
9. Congelare i campioni direttamente a -80 ° C o con un periodo di incubazione, prima di 30 min a temperatura ambiente. Condizioni di gelo determinano in parte la formazione di pori, quindi le condizioni di congelamento possono essere regolate a seconda della porosità mirato. Conservare i campioni durante la notte a -80 ° C.
10. Estrazione: Immergere gli impianti nel 80% EtOH pre-raffreddata. Eseguire l'estrazione a -20 ° C per una notte. Per ottenere gradienti di porosità, rimuovere tutte le parti dello stampo, tranne il mandrino per gli impianti tubolari e di tutte le parti tranne la parte inferiore per gli impianti a forma di disco. Utilizzare un bisturi pre-raffreddata per facilitare la separazione dello stampo.
11. Dopo l'estrazione a -20 ° C per una notte ^19, rimuovere i restanti parti dello stampo e lasciare asciugare gli impianti. Per la caratterizzazione deila porosità complessiva della struttura mercurio analisi porosimetro è necessario. Mercurio misurazioni porosimetro mostravano picchi distinti che corrispondono ai pori sui due lati dell'impianto e le interdispersed pori più piccoli. Tuttavia i dati più importanti è la differenza tra le porosità superfici intraluminale e extraluminale, che possono essere analizzati da J immagine per distribuzione dimensionale dei pori con un microscopio elettronico a scansione (SEM) ^20. Per la verifica del gradiente dei pori, congelare-frattura dei campioni e osservare la sezione trasversale con SEM.
12. A causa della natura porosa aperta delle protesi utilizzate, e la capacità di riflettere la luce di titanio, è possibile fare z-pile di cellule marcate all'interno dei impianti porosi. Etichettare le cellule con PKH26 o Calcein-AM e visualizzare gli impianti con microscopia laser confocale.

2. Rivestimento superficiale di porosi impianti metallici con collagene / alginato Multilayers

1. Per accumulodi multistrati, più alta riproducibilità è ottenuto con i robot immersione. Tuttavia, se un robot immersione non è disponibile, queste fasi possono essere eseguite manualmente.
2. Utilizzare il grado di collagene tipo I medici e alginato di sodio. Le concentrazioni sono ottimizzati 0,5 g / L per ogni in 150 mM NaCl in tampone citrato a pH 3.8.
3. Sciogliere la soluzione di collagene durante la notte per assicurare l'omogeneità della soluzione. PH acido di 3,8 è necessaria per stabile accumulo degli strati in quanto la struttura è instabile prima della reticolazione a pH neutro.
4. Depositare gli strati da un sistema di robot immersione immergendo gli impianti in soluzioni di collagene e alginato in alternativa. Tempo di deposizione è di 15 minuti per ogni strato successivo. Sciacquare la struttura tra fasi di deposizione con 150 mM di NaCl a pH 3,8 per 5 min.
5. Titolare specifico Design per l'utilizzo degli impianti con robot immersione utilizzati nella produzione di multistrato di polielettrolita. Depositare gli strati sulla superficie sia titanio solo IMPLAnti o impianti modificati come descritto nella sezione 1.
6. Stabilizzazione della membrana basale mimare con genipin: Preparare la soluzione di reticolazione in dimetilsolfossido (DMSO) / tampone citrato (150 mM NaCl, pH 3,8) a 1:4 v: v rapporto. Una vasta gamma di concentrazioni possono essere usate e 100 mM è sufficiente per la reticolazione. Sciogliere genipin prima nella componente DMSO e aggiungere il componente acqua dopo per evitare grumi.
7. Reticolarlo i campioni dalla immersione nella soluzione di reticolazione tra 12-24 hr. Successivamente sciacquare abbondantemente con tampone citrato (pH 3,8).
8. Dopo le fasi di lavaggio, sterilizzare i campioni sia con il trattamento UV (30 min) o un bagno di antibiotico / antimicotico (penicillina / streptomicina, Fungizone).
9. I principali parametri che determinano la qualità della membrana basale mimica sono suo spessore e il diametro delle fibre. Calcolare i diametri delle fibre mediante microscopia a forza (AFM) immagini Atomic ottenuti nella modalità di contatto. Asciugare i campioni conflusso di azoto prima di imaging. Quantificare lo spessore di almeno 10 fibre per immagine per determinare lo spessore medio fibrilla con il software Image J.
10. Lo spessore dei film può essere determinata con test zero utilizzando AFM. Secco (COL / ALG) ₂₄ film multistrato / COL. Utilizzare un ago di siringa a graffiare la pellicola. Dopo la localizzazione del graffio con un microscopio ottico, ottenere immagini AFM su 10 x 10 micron ² superfici al confine del graffio. Calcolare le altezze dei profili ottenuti con il software AFM, che fornisce lo spessore dello strato di pellicola.

3. Monitoraggio indiretto di Implant Integrazione in vivo Analisi del plasma sanguigno

1. Tutte le approvazioni delle commissioni necessarie devono essere prese per la sperimentazione animale in base alle regole che disciplinano per ogni paese ^21. Nel nostro caso la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Consiglio Nazionale delle Ricerche, 2010) è seguito e THapprovazione e dell'Università di comitato etico Strasburgo si ottiene.
2. Eseguire l'impianto presso il sito di destinazione. Il protocollo di monitoraggio sangue dato qui è stato utilizzato per la sostituzione tracheale in conigli bianchi New Zealand di una resezione tracheale 15 mm.
3. Dopo l'impianto di un giorno di follow-up è necessario, come ad esempio montioring il benessere degli animali (la guarigione intorno ai siti chirurgici, il tasso di respirazione) generale e la registrazione del loro peso.
4. Per convalidare l'esame del sangue, utilizzare un metodo ben consolidato come il test ELISA per i livelli di CRP nel sangue. Test CRP per molti animali sono a disposizione ed il test specifico utilizzato per i conigli sono elencati nella Tabella 1. Allo stesso modo, l'uso western blotting per la determinazione dei livelli di CGA. Anticorpi monoclonali anti-CGA (anti-CGA _47-68) sono stati utilizzati in questo protocollo.
5. Per la caratterizzazione di plasma, ottenere campioni di sangue dalla vena auricolare dei conigli. Centrifugare a 5000 rpm per 20 min a 4 °, C. Utilizzare il supernatante ottenuto per l'analisi. Nella nostra procedura, questi test sono fatti su base settimanale, ma i test più frequenti sono inoltre possibili.
6. HPLC in fase inversa purificazione del contenuto proteico: Estrarre il plasma di coniglio con il 0,1% di acido trifluoroacetico (1:1, v: v). Purificare l'estratto utilizzando un sistema di HPLC Dionex (ultima 3000; Sunnyvale, CA USA) su un NUCLEOSIL fase inversa 300-5C18-colonna (4 x 250 mm; particella 5 micron, porosità, 300 Å).
7. Registrare l'assorbanza a 214 e 280 nm. Il sistema solvente usato è i) Solvente A: Acido 0,1% (v / v) trifluoroacetico (TFA) in acqua e ii) Solvente B: 0,09% (v / v) TFA in 70% (v / v) di acetonitrile-acqua.
8. Utilizzare un flusso di 700 ml / min utilizzando gradienti per eluizioni. Raccogliere le frazioni di punta. Concentrare le frazioni per evaporazione dalla applicazione della velocità a vuoto. È importante arrestare la velocità-vuoto prima completa secchezza.
9. Correlare i picchi ottenuti in diversi punti temporali nel coUrse del periodo di impianto. Utilizzare i peptidi purificati che mostrano andamenti coerenti durante il corso di impiantazione per l'identificazione mediante sequenziamento automatico Edman.
10. Automatica Edman sequenziamento dei peptidi: Determinare la sequenza N-terminale dei peptidi purificati mediante degradazione di Edman automatico utilizzando un microsequencer Procise. Caricare il campione di filtri in fibra di vetro polibrene-trattati. Passo successivo è l'identificazione di acidi Phenylthiohydantoin-aminoacidi (PTH-Xaa) mediante cromatografia su una colonna C ₁₈ (PTH C-18, 2.1 x 200 mm) ^22. Dopo la sequenza è ottenuta, può essere identificato da software Blast utilizzando il database Swiss-Prot.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Formazione di gradienti pori

Modificando la concentrazione della soluzione PLLA, è possibile controllare la dimensione dei pori sul lato extraluminale degli impianti. Dimensioni e la forma dei pori è stata significativamente influenzata dalla presenza di impianti in titanio (figure 1a e 1b). Dimensioni dei pori variava 40-100 micron e l'utilizzo di concentrazioni più basse hanno provocato pori più piccoli. Considerando che, nella dimensione dei pori end...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Gradienti pori sono strumenti importanti in ingegneria tissutale di interfaccia e il sistema qui descritto possono essere usati da soli o in combinazione con impianti metallici a formare pori gradiente di studiare la migrazione cellulare. Il sistema non richiede alcuna impostazione supplementare o attrezzatura supplementare tranne sotto cappa per gestire solventi organici, così può essere applicato in laboratori di biologia. Polimeri simili come poli (acido glicolico) (PGA), poli (lattico-co-glicolico) acido (PLGA) e ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Dioxane	Sigma-Aldrich	360481	Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g	Sigma-Aldrich	94829, 81273	The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)	Novamatrix	4200006	Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine)	Symatese	CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone	Promocell	C42020
Genipin	Wako	0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1.	Bruker	MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0%	Sigma-Aldrich	302031	Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9%	Sigma-Aldrich	34998
Calcein-AM	Invitrogen	C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit	Genway Bio	GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650
Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope	Bruker
Procise microsequencer	Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system	Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100	Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510	Zeiss
Table 1. List of Materials and Reagents.