Sintesi, Consegna Cellulare e<em&gt; In vivo</em&gt; Applicazione di sensori di pH basati Dendrimero

Riepilogo

I sensori di fluorescenza sono strumenti potenti nella scienza della vita. Qui si descrive un metodo per sintetizzare ed utilizzare sensori fluorescenti basato dendrimero-per misurare il pH nelle cellule viventi e in vivo. L'impalcatura dendritiche esalta le proprietà dei coloranti fluorescenti coniugati che conducono al miglioramento delle caratteristiche di rilevamento.

Abstract

Lo sviluppo di indicatori fluorescenti ha rappresentato una rivoluzione per le scienze della vita. Geneticamente codificato e fluorofori sintetici con capacità di rilevamento ha permesso la visualizzazione di specie biologicamente rilevanti con alta risoluzione spaziale e temporale. Coloranti sintetici sono di particolare interesse grazie alla loro elevata sintonizzabilità e la vasta gamma di analiti misurabili. Tuttavia, queste molecole soffrono di alcune limitazioni legate alla piccola comportamento della molecola (scarsa solubilità, difficoltà di targeting, spesso senza immagini ratiometric consentito). In questo lavoro si introduce lo sviluppo di sensori basati dendrimero e presentiamo una procedura per la misurazione del pH in vitro, in cellule viventi e in vivo. Abbiamo scelto dendrimeri come piattaforma ideale per i nostri sensori per le loro numerose proprietà desiderabili (monodispersity, proprietà sintonizzabili, multivalenza) che li un'impalcatura ampiamente utilizzato per diversi dispositivi biomedici fatte. La coniugazione di pH fluorescenteIndicatori al patibolo dendrimer portato ad un miglioramento delle loro prestazioni di rilevamento. In particolare dendrimeri mostre ridotto la perdita delle cellule, migliore il targeting intracellulare e permettere misurazioni raziometriche. Questi nuovi sensori sono stati impiegati con successo per misurare il pH nel vivere cellule HeLa e in vivo nel cervello di topo.

Introduzione

L'utilizzo di molecole fluorescenti per etichettare specifiche molecole biologicamente rilevanti ha completamente cambiato il nostro modo di studiare sistemi biologici. Widefield e microscopia confocale consentito in tempo reale ad alta risoluzione visualizzazione dei processi biologici e oggi sono tra le tecniche più popolari per studiare eventi biologici in vitro, in cellule e in vivo. ¹ un miglioramento rilevante era rappresentata dallo sviluppo di indicatori di fluorescenza , cioè coloranti cui fluorescenza dipende dalla concentrazione di una entità molecolare specifico. pH e calcio indicatori, in particolare, hanno avuto un impatto drammatico sullo studio della fisiologia cellulare a causa della enorme rilevanza di ^{2 +} ioni in biologia H ⁺ e Ca. ^2,3

Tuttavia, la maggior parte dei coloranti sensibili presenti diversi limiti intrinseci legati alla loro piccola molecola comportamento quali: i) difficoltà targeti subcellulareng; ii) scarsa solubilità in acqua e conseguente scarsa biocompatibilità;. e iii) perdite cellulare e quindi la mancanza di capacità time-lapse imaging lungo ⁴ Inoltre, il segnale di molte sonde può non essere corretta per la dipendenza dalla concentrazione di colorante (non- l'imaging raziometrico) e quindi, una misura assoluta in cellule o in vivo non è possibile.

Recentemente abbiamo descritto un metodo semplice ed efficace per superare queste limitazioni, basato sulla coniugazione di coloranti sensibili alla pressione su un ponteggio dendrimero. ⁵ dendrimeri sono polimeri hyperbranched monodisperse con proprietà molto interessanti per applicazioni biologiche. ⁶ In particolare diverse architetture dendritiche sono stati sviluppati e utilizzati per la droga ⁷ e la consegna del gene. ⁸ Solo molto recentemente alcuni gruppi hanno cominciato a esplorare le potenzialità di queste molecole come impalcatura per i dispositivi di rilevamento. ^9,10,11

Abbiamo precedentementedescritto una via sintetica semplice verso la funzionalizzazione di diversa polyamidoamine (PAMAM) scaffold a base di esteri NHS-attivati. Coniugati ¹² possono essere ottenuti in un unico passaggio mediante dialisi come soltanto la purificazione. È interessante notare che questo approccio può essere facilmente applicata ad una varietà di scaffold dendritiche o polimerici. ^13,14

Per raggiungere dendrimeri di imaging raziometrici erano doppio marcato con due serie di coloranti: i) un indicatore di pH (cioè fluoresceina) e ii) una porzione fluorescente pH-indipendente (cioè rodamina). Questo ha permesso di effettuare l'imaging pH accurate come rapporto tra fluoresceina e rodamina dipende solo dal pH e non più sulla concentrazione della sonda. Un altro approccio interessante per questo problema è rappresentata dall'utilizzo di sonde a vita basata. ¹⁵ Come la vita non dipende concentrazione sonda queste misurazioni non necessitano di correzione raziometrico. Tuttavia, LIFmisure Etime richiedono una più complessa configurazione strumentale e la loro risoluzione temporale è sub-ottimale per i processi fisiologici veloci, limitando così le loro potenziali applicazioni.

Al fine di effettuare l'imaging intracellulare, la sonda deve essere consegnato attraverso la membrana plasmatica nel citosol. Poiché i dendrimeri non vengono membrana permeabile causa delle loro dimensioni e idrofilia, consegna intracellulare potrebbe avvenire tramite elettroporazione. Mediante questa tecnica, ampiamente utilizzata in biologia per la trasfezione, macromolecole etichettati possono essere efficacemente consegnati in cellule effettuare immagini di alta qualità. Inoltre, con elettroporazione le complicazioni legate al dendrimero endocitosi possono essere evitate le macromolecole sono direttamente consegnati al citoplasma. È interessante notare che dopo l'elettroporazione diversi dendrimeri mostra localizzazioni distinte all'interno delle cellule anche in assenza di qualsiasi sequenza di targeting specifico. ⁵ Questo passivoe rivolti, solo a causa delle proprietà fisico-chimiche del dendrimero, può essere sfruttata per realizzare specifici organello pH imaging.

Immagini Raziometrico può essere effettuata utilizzando la microscopia confocale. Fluoresceina e rodamina, covalentemente coniugato con l'impalcatura dendritica, sono stati ripresi separatamente e un pixel per pixel rapporto mappa è stata creata. Sono stati segnalati diversi procedure di controllo di pH intracellulare in cellule viventi mediante ionofori. Ionofori sono piccole molecole idrofobiche in grado di trasportare ioni attraverso la membrana plasmatica; Ionofori per ione H ^+, come nigericin, sono disponibili e possono essere usati per calibrare sensori basati ^{dendrimero-16} Queste misurazioni hanno rivelato una risposta lineare a pH analogamente a quanto osservato. in vitro. Sulla base del pH intracellulare calibrazione potrebbe essere misurata con precisione. Queste misure hanno dimostrato che il sensore basato dendrimer, può essere uno strumento prezioso per lo studio H ⁺ homeostAsis nelle cellule viventi e dei processi patologici che coinvolgono pH regolazione malfunzionamenti.

Abbiamo recentemente dimostrato che i sensori di pH basato dendrimero possono essere applicate anche in vivo, eseguendo l'imaging pH nel cervello di topi anestetizzati. ¹⁷ causa dell'ambiente complesso di tessuti viventi una qualità elevata rilevamento vivo è tecnicamente difficile. Qui vi mostriamo una descrizione dettagliata della procedura sperimentale in vivo pH di imaging con enfasi delle questioni cruciali da affrontare per eseguire un accurato immagini pH nel cervello. Microscopia a due fotoni è stato impiegato per due motivi principali: i) l'uso di luce infrarossa permette di superare la mancanza di penetrazione nei tessuti della microscopia confocale norma; ii) l'ampio assorbimento a due fotoni di fluoresceina e rodamina consentire la loro eccitazione simultanea evitando l' complicanze legate all'uso di due lunghezze d'onda di eccitazione. misure di pH nel cervello di topo sono statieffettuate con successo; sensori prontamente rispondono all'ipossia provocare cambiamenti di pH nello spazio extracellulare cervello. Queste misurazioni mostrano che gli indicatori basato dendrimero possono essere usati con successo per evidenziare cambiamenti fisiologici e patologici del pH in vivo in un modello animale.

Protocollo

1. Sintesi dei sensori

1. Nella sezione seguente forniamo una procedura per la coniugazione di indicatori di pH a dendrimeri PAMAM. Lo stesso protocollo può essere applicato con modifiche minime al dendrimeri ammina-cuscinetto alternativi. ^5,17,13,14 dendrimeri e coloranti disponibili in commercio possono essere utilizzati senza ulteriori purificazioni.
2. Sciogliere il dendrimer in DMSO anidro (concentrazione finale di 50 micron). Preparare soluzioni 10mM stock di fluoresceina NHS e tetrametil-rodamina-NHS (TMR) in DMSO anidro.
3. Aggiungere alla soluzione dendrimero la quantità desiderata di fluoresceina e TMR. Il rapporto molare nella miscela rifletterà la quantità di coloranti caricati sul dendrimero. Tipicamente 1 ml di soluzione G4 dendrimero PAMAM in una provetta viene fatto reagire con 8 eq (40 microlitri) di fluoresceina e 8 eq (40 microlitri) di TMR. Agitare la soluzione a temperatura ambiente per 12 ore.
4. Diluire 1:10 con acqua deionizzata e caricare la reazionemiscela in un sacchetto di dialisi (MWCO = 10 kDa). Dializzare per 24 ore contro acqua deionizzata sostituire frequentemente l'acqua nel serbatoio.
5. Trasferire la soluzione in un flaconcino e congelare asciugare per 24 ore. Una polvere viola deve essere ottenuta. Peso del solido ottenuto e sciogliere in acqua milliQ ad una concentrazione finale di 10 mM. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C.

2. In vitro Misurazioni del pH

1. Per in vitro calibrazione preparare una soluzione di 500nm dendrimero in PBS (phosphate 2 mM) in una cuvetta di quarzo. Si raccomanda l'uso di un tampone PBS molto diluite (2 mM) per evitare brusche variazioni di pH durante la titolazione.
2. Misurare gli spettri di emissione di fluoresceina (exc 488 nm) e TMR (exc 550 nm) e ottimizzare le impostazioni ottiche del fluorimetro per ottenere un buon rapporto segnale-rumore.
3. Eseguire una titolazione pH con l'aggiunta di piccoli volumi di NaOH 0,1 N e HCl 0,1 N. Dopo ogni aggiunta agitare la provettaper la miscelazione, attendere 1 min per equilibrazione e misurare il pH mediante un pH microelettrodo. Spettri di emissione della fluoresceina e TMR deve essere registrato per ogni passo senza alcun cambiamento nelle impostazioni ottiche.
4. Tracciare l'intensità di fluorescenza vs pH per la titolazione. Il segnale rhodamine dovrebbe essere influenzata dal pH (<10%). Il segnale fluoresceina dovrebbe essere una curva sigmoidale e dovrebbe essere dotata di un modello single-vincolante con pK = 6.4.

3. Cella cultura e elettroporazione

1. Coltivare cellule HeLa in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino e 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (Invitrogen). Mantenere coltura cellulare a 37 ° C in un umidificata al 5% CO ₂ nell'atmosfera.
2. Per dendrimer elettroporazione, quando le cellule sono confluenti, rimuovere il supporto e lavare le cellule con DPBS (Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Rimuovere il DPBS e aggiungere tripsina-EDTA. Neutralizzare Il Tryppeccato con l'aggiunta di siero mezzo contenente ma non antibiotici. Centrifugare a 900-1.200 rpm per 2 minuti a temperatura ambiente. Togliere la carta e sciacquare il pellet con DPBS.
3. Contare le celle e prendere 4 * 10 ⁶ cellule. Centrifugare a 1.200-1.500 rpm per 2 minuti a temperatura ambiente.
4. Risospendere il pellet di cellule in 200 ml di tampone microporation (fornito dal costruttore microporator) e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml.
5. Aggiungere la soluzione acquosa dendrimero in cellule risospese. La quantità di dendrimero necessaria per campione dipende dal tipo PAMAM (tipicamente 250 nM per cationico e 2 mM per dendrimeri neutri).
6. Aggiungere tampone elettroporazione (fornito dal costruttore microporator) in un tubo microporation. Pipettare le cellule ei dendrimeri miscele con elettroporazione punta di 100 volumi di dimensioni microlitri. Inserire la pipetta microporator nella stazione pipetta. Impostare la condizione impulsi per microporation: tensione ad impulsi = 1.005 V; impulso wid° = 35 msec, il numero di impulsi = 2.
7. Dopo che le cellule di trasferimento dell'impulso a 1,5 ml provetta e centrifugare le cellule per 5 min a 1200 rpm per rimuovere l'eccesso di dendrimero nel mezzo. Tavola 10 ml di cellule elettroporate da 35 mm piatti con fondo di vetro (WillCo-dish GWSt-3522), con terreno fresco w / o antibiotici.

4. pH Sensing in cellule viventi HeLa

1. Celle di immagine con un microscopio confocale a 12 ore dopo l'elettroporazione.
2. Set di filtri standard per fluoresceina e rodamina può essere utilizzato. Se i filtri sintonizzabili sono disponibili set di un canale verde 500-550 nm e un canale rosso da 580 nm a 650 nm. Eccitazione a 488 nm è ottimale per la fluoresceina, mentre rodamina potrebbe essere ripreso sia con il 543nm o la linea laser 561.
3. Fuoco il preparato e regolare la potenza laser e rivelatori guadagno per massimizzare il rapporto segnale-rumore. Se l'elettroporazione era cellule successo dovrebbero essere fluorescente brillantemente in entrambi i canali. Illocalizzazione dipende dalla dimensione e carica del dendrimero utilizzato. Spesso alcuni localizzazione lisosomiale (piccole vescicole perinucleari) è presente a causa di endocitosi o compartimentazione. Se la localizzazione lisosomiale è predominante, cioè la maggior parte della fluorescenza è localizzato all'interno di vescicole e segnale debole si osserva nel citosol, ciò significa la tossicità e la misurazione devono essere eliminati. Acquisire sequenzialmente i due canali, se necessario acquisire diverse immagini e media immagini per migliorare la qualità dell'immagine.
4. Per morsetto calibrazione pH cellulare utilizzando tamponi con ionofori a diversi pH e acquisire almeno 20 cellule per pH come descritto sopra. Per una descrizione dettagliata della procedura e la composizione dei buffer consultare Bizzarri e colleghi. ¹⁶ Si consiglia di misurare almeno 5 punti dal pH = 5,5 a pH = 7.5. pH inferiore a 6 sono tossici per le cellule ma tollerata per un breve lasso di tempo, si consiglia di acquisire le immagini più velocemente possibile. Se le celluledimostrare segni di apoptosi, eliminare le cellule e riavviare.
5. Utilizzare ImageJ o software analoghi per l'analisi dei dati. Importare le immagini del canale verde e rosso, sottrarre sfondo e creare un rapporto pixel per pixel delle immagini con lo strumento "Calcolatore di immagine".
6. Prelievo di una regione di interesse (ROI) selezionando la cella desiderata e misurare il rapporto intracellulare verde a rosso. Analizzare tutte le immagini acquisite e quindi tracciare il rapporto rispetto al pH. Nell'intervallo tra 5.5 e 7.5 la tendenza dovrebbe essere lineare. L'adattamento lineare dei punti ottenuti darà la curva di calibrazione che verrà utilizzato per convertire rapporto verde a rosso a pH.
7. Come ulteriore controllo acquisire diverse cellule non trattate (senza Ionofori) e provare a calcolare il pH con la curva di calibrazione ottenuta. Un valore compreso tra 7.2 e 7.4 deve essere ottenuta.

5. In Vivo Preparazione del campione

1. Gli esperimenti sono stati eseguiti su C57BL/6J (maschi e femmine) tra postnatale day 28 e 70. Anestetizzato il mouse con un'iniezione intraperitoneale di uretano (cioè etil carbammato) (20% w / v in soluzione salina fisiologica, 20 mg / Kg uretano). Gli animali sono stati sacrificati dopo esperimento con una overdose di uretano seguita da una iniezione intracardiaca della stessa anestetico.
2. Eseguire una iniezione intramuscolare di desametasone fosfato di sodio (2 mg / kg peso corporeo) per ridurre la risposta allo stress corticale e edema cerebrale durante l'intervento chirurgico.
3. Radersi la testa dell'animale e applicare 2,5% gel lidocaina al cuoio capelluto.
4. Usare le forbici per tagliare il lembo di pelle che ricopre il cranio di entrambi gli emisferi
5. Lavare l'osso esposto con soluzione salina e rimuovere delicatamente il periostio con pinze. Ciò fornirà una base migliore per colla e cemento dentale ad aderire con.
6. Applicare un acciaio palo di testa su misura con una camera di imaging centrale e incollare con cianoacrilato in un piano approssimativamente parallelo con il cranio sulla regione corticale di interest e fissarlo in posizione con cemento dentale bianco (Paladur).
7. Fissare la testa del mouse per eseguire una craniotomia di 2-3 mm di diametro forato sopra la regione di interesse.
8. Cercare di minimizzare il riscaldamento della corteccia durante l'intervento chirurgico, lacerazioni durali, o sanguinamento.
9. Mantenere la corteccia superfuse con ACSF sterile (126 mM NaCl, KCl 3 mM, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1.3 MgSO mm _4, 26 NaHCO mm _3, 2.4 mM CaCl _2, glucosio 15 mM, 1,2 mM HEPES in H ₂ O distillata , pH = 7,4).

6. pH imaging cervello di topo

1. Durante l'animale la respirazione aiuti esperimento fornendo O aria ₂ arricchita. L'ossigeno è arricchito fino al 80%. O ₂ pressione e flusso parziale è spesso regolati per ottenere un aiuto alla respirazione corretta. Mantenere costante la temperatura corporea a 37 ° C con una valutazione riscaldamento centralizzato coperta.
2. Fissare l'animale attraverso il palo di acciaio sotto l'obiettivo di una due-fotoinstallazione n imaging.
3. Per iniettare il sensore nella corteccia cerebrale caricare una pipetta di vetro contenente un elettrodo AgCl (diametro consigliato 4 mm) con la soluzione dendrimero (1 mM). L'elettrodo permetterà di registrare potenziali di campo extracellulari.
4. Con una configurazione microiniezione inserire la pipetta nella corteccia a circa 150 micron di profondità. Iniettare per 1-2 min ad una pressione di 0,5 psi.
5. Ottimizzare la configurazione ottica per l'imaging. Potenza del laser deve essere regolato per minimizzare photobleaching e fotodanneggiamento. Tipicamente potenza del laser impiegato è di circa 20 mW e guadagno PMT è stata mantenuta costante a 667 V in quanto le calibrazioni precedenti hanno dimostrato che questa tensione dà il miglior rapporto S / N.
6. Per l'imaging eccitare il sensore a 820 nm e rilevare simultaneamente fluoresceina e rodamina fluorescenza attraverso filtri FITC e TRITC standard.
7. Per il tempo le misure risolte acquisiscono serie lasso di tempo a 2 Hz.
8. Per la correzione del fondo acquisire cornice scura con il laser otturatore chiuso per misurare il rumore termico medio risultante nei PMT e il piedistallo solitamente aggiunti dall'elettronica.
9. Per l'analisi dei dati seguire la stessa procedura riportata nella sezione 4.

Risultati

La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica della coniugazione di rilevamento coloranti differenti scaffold dendritiche. Gli indicatori risultanti possono essere ottenuti in un solo passo sintetica facile da prodotti commercialmente disponibili. Dendrimeri ammina cuscinetti vengono fatti reagire con coloranti NHS attivati ​​in DMSO e purificati mediante dialisi. Tale procedura generale è già stato utilizzato con successo per l'etichettatura di alcuni dendrimeri: i) generazione PAMAM den...

Discussione

Le fasi critiche per l'imaging pH con sensori basati dendrimero-sono: i) la selezione del ponteggio dendritica corretta e il numero di indicatori coniugati ad esso e ii) l'ottimizzazione di protocollo di recapito sensore in cellule o in vivo.

La procedura di sintesi è abbastanza semplice e può essere applicato praticamente ad ogni polimero hyperbranched ammina-cuscinetto. I sensori possono essere ottenuti da dendrimeri disponibili in commercio e coloranti NHS-attivati ​?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500