Differenze valutando in capacità competitiva sperma in<em&gt; Drosophila</em

Riepilogo

Differenziale capacità competitiva sperma tra Drosophila Maschi con genotipi distinti possono essere accertata attraverso esperimenti a doppio accoppiamento. Ciascuno di questi esperimenti coinvolge uno dei maschi di interesse e un maschio riferimento. Marcatori facilmente identificabili nella prole consentono inferenza della frazione di individui generò da ogni male.

Abstract

La concorrenza tra i maschi conspecifici di concimazione gli ovuli è uno dei meccanismi di selezione sessuale, ovvero la selezione che opera sulla massimizzazione del numero di eventi di accoppiamento di successo piuttosto che sulla sopravvivenza massimizzazione e la vitalità ^1. Competizione spermatica rappresenta la competizione tra i maschi dopo copulare con la stessa femmina ^2, in cui la loro spermatozoi sono coincidenti nel tempo e nello spazio. Questo fenomeno è stato segnalato in molteplici specie di piante e animali ^3. Ad esempio, catturati in natura D. femmine melanogaster solito contengono spermatozoi 2-3 maschi ^4. Gli spermatozoi sono memorizzati in organi specializzati con capacità di archiviazione limitata, che potrebbe portare alla concorrenza diretta degli spermatozoi da diverse maschi ^2,5.

Confrontando la capacità competitiva sperma di diversi maschi di interesse (tipi maschili sperimentali) è stata eseguita attraverso controllato in doppio-accoppiamento sperimentazionets in laboratorio ^6,7. In breve, una singola femmina è esposto a due diversi maschi consecutivamente, un maschio sperimentale e un maschio riferimento di accoppiamento incrociato. Lo stesso schema di accoppiamento è poi seguito utilizzando altri tipi di sesso maschile sperimentali facilitando così il confronto indiretto della capacità competitiva del loro sperma attraverso un riferimento comune. La frazione di individui generò dai maschi sperimentali e di riferimento viene identificato utilizzando marcatori, che permette di stimare la capacità competitiva degli spermatozoi utilizzando espressioni matematiche semplici ^7,8. Inoltre, la capacità competitiva degli spermatozoi può essere stimata in due diversi scenari a seconda che il maschio sperimentale è seconda o prima di accoppiarsi (offesa e difesa dosaggio, rispettivamente) ^9, che si presume essere riflettente di diversi attributi di competenza.

Qui, descriviamo un approccio che consente di interrogare il ruolo dei diversi fattori genetici che sono alla base putatively tegli fenomeno della capacità competitiva sperma in D. melanogaster.

Introduzione

Dal Geoff Parker ha osservato la prevalenza di competizione spermatica negli insetti e le sue implicazioni evolutive ^2, un'ondata di studi in Drosophila e di altre specie hanno cercato di far luce su questo fenomeno a vari livelli. Alcuni esempi di aree di interesse sono stati l'indagine della sua variazione nelle popolazioni naturali ^9,10, la sua architettura genetica e la pertinenza dei sottostanti fattori genetici ^11-14, e il suo ruolo nel guidare la coevoluzione tra i sessi ^15,16. In D. melanogaster femmine, la limitata capacità degli organi di sperma di stoccaggio specializzati, un paio di spermateca e il ricettacolo seminale ^6,17, contribuisce alla concorrenza dello sperma di diversi maschi. Circa 1.500 spermatozoi vengono trasferiti durante l'accoppiamento al femminile, ma solo ~ 500 possono essere ospitati negli organi menzionati ^18,19. In laboratorio, controllato in doppio-accoppiamento espementi comportanti un maschio di riferimento e uno o più maschi di interesse sono stati ampiamente utilizzati per valutare lo sperma capacità competitiva ^7,8.

Capacità competitiva degli spermatozoi è stimata come la proporzione di progenie desiderata dal maschio sperimentale in esperimenti a doppio accoppiamento sopra la progenie totale, vale a dire che sia dalla sperimentazione e maschi di riferimento. Capacità competitiva sperma comprende due componenti, ciascuna delle quali valutata in un test separato. Nel saggio reato, la capacità dello sperma maschile sperimentale per spostare lo sperma dal primo maschio, ossia il maschio di riferimento, viene valutato. Viceversa, nel saggio difesa, la capacità dello sperma maschile sperimentale per resistere spostamento o per ridurre la riuscita fecondazione del maschio sperma di riferimento viene valutata. A seconda del tipo di dosaggio, difesa o offesa, abilità competitiva sperma è stimata mediante i punteggi P ₁ o P _2, rispettivamente. P₁ e P ₂ può assumere solo valori tra 0 e 1. I valori intermedi sono di solito interpretate come prova indiretta di sperma di miscelazione, che suggerisce uno scenario fisiologico che coinvolge competizione spermatica diretta. Seguendo la stessa logica, i valori estremi possono essere interpretati come prova di un forte differenziale sperma capacità competitiva. I primi studi hanno dimostrato che la P ₂ in D. melanogaster è di oltre 0,8 aumentando come il tempo trascorso tra i due accoppiamenti allunga ^7. Questo stesso disegno sperimentale è stato utilizzato in altre specie di Drosophila, P ₂ essendo la statistica comunemente usato negli studi per valutare sperma capacità competitiva ^20. Per la maggior parte delle specie, i P ₂ valori dei ceppi testati è superiore a 0,6 ^21. Tuttavia, diversi altri meccanismi non correlati alla concorrenza diretta tra sperma di diversi maschi possono produrre punteggi identici (vedi la discussione).

Dprogenie istinguishing figlia di primo o secondo i maschi è possibile attraverso l'uso di marcatori facilmente identificabili. Nei primi studi, uno dei maschi è stato irradiato a dosi subletali di, per esempio, i raggi X in modo tale che praticamente tutti gli ovuli fecondati da spermatozoi irradiati non è riuscito a covare ^7. Successivamente, le mutazioni che alterano la pigmentazione degli occhi o la forma dell'ala sono stati i marcatori più comunemente utilizzati. Esempi del primo sono le mutazioni bw (marrone) ^9, cn (cinabro) e ²² w (bianco) ^23, mentre la mutazione Cy (ricci) ²⁴ corrisponde al secondo tipo di fenotipi; alcune di queste mutazioni sono stati combinati nella stesso individuo, ad esempio cn bw. In misura minore, allozymes ²⁵ e microsatelliti ^26,27 con modelli di eredità note sono stati utilizzati anche.

Il disegno sperimentale per verificare le differenze dicapacità competitiva sperma qui descritta segue essenzialmente quello di Clark et al. ^9. I risultati ottenuti da questi esperimenti danno informazioni esclusivamente sulla paternità differenziale dei tipi maschili sperimentali sotto esame. I saggi che fanno anche conto delle differenze post-fecondazione in palestra ^14,28 e tecniche di visualizzazione di sperma ²⁴ consentono differenze di P ₁ o P ₍₂₎ realizza da essere interpretate come differenze nella competenza degli spermatozoi.

La figura 1 illustra il razionale sia del reato ed i saggi di difesa. Per illustrare la logistica del processo, un esperimento reato effettuata in D. melanogaster ¹⁴ sarà spiegato in dettaglio. Questo particolare test reato è stato utilizzato per testare un effetto misurabile della famiglia catena intermedia multigene Sperm-specifica dineina (SDIC) sulla capacità competitiva degli spermatozoi. Tutto il membros di questa famiglia multigene risiedono in tandem sul cromosoma X. Maschi Knockout sono stati generati eliminando il cluster SDIC. Poiché il segmento cancellato comprendeva anche il breve ala gene essenziale (sw) e lo scopo dello studio era quello di valutare la rilevanza di SDIC, i maschi che portano la cancellazione SDIC-sw sono stati salvati da una copia transgenico di sw (simboleggiato come P {sw} , che inoltre effettuato un gene reporter mini-bianco) sul cromosoma 2. Colore degli occhi è stato utilizzato come marcatore visibile per l'identificazione di paternità. Tutte le mosche erano in uno sfondo bianco mutante con l'eccezione di quelli dal ceppo Oregon-R, che sono stati utilizzati come riferimento maschi.

Protocollo

Esperimenti su piccola scala devono essere eseguiti per acquisire familiarità con l'intera procedura.

1. Raccolta di femmine vergini e maschi Naïve

La versione più semplice di questo esperimento descritto è costituito da quattro tipi di croci iniziali, che coinvolgono la seguente combinazione di adulti: a) W ^1.118 individui, al fine di raccogliere femmine vergini, b) individui Oregon-R, al fine di raccogliere i maschi di riferimento naïve, c ) P {sw} maschi omozigoti e femmine vergini provenienti da una linea di controllo che porta l'organizzazione di SDIC wild-type in modo da raccogliere i maschi sperimentali naïve (tipo I) e d) P {sw} maschi omozigoti e SDIC-sw-delezione -realizzazione femmine vergini al fine di raccogliere i maschi sperimentali naïve che portano il deficit SDIC-sw (tipo II).

1. Impostare più fiale contenenti 8-10 femmine e 5 maschi ciascuno. Lasciare le femmine a deporreuova e trasferire gli adulti a nuove fiale ogni 3-5 giorni. Utilizzare bottiglie piuttosto che fiale, se necessario, e utilizzare sempre alimenti freschi. Il numero di fiale necessarie dipenderà dal numero di tipi maschi sperimentali in studio e il numero di individui ritenuti necessari per rilevare differenze (Tabella 1). Più di 10 femmine per fiala potrebbero causare sovraffollamento durante la crescita delle larve, che possono causare variazioni nella fertilità della progenie. Conservare le fiale a 25 ° C in una camera a temperatura controllata.
2. Iniziare a raccogliere femmine vergini e maschi naïve nei giorni 11 ^e 12 ^° dopo aver impostato le croci iniziali. Il periodo di attesa varia in funzione della temperatura; minore risultato temperature nel tempo maggiore sviluppo ritardando l'insieme di individui. Un altro fattore che influenza la temporizzazione per eclosion è il tipo di supporto. Cibo nutriente, come la farina di mais, lievito di medie ^29, assicura un corretto sviluppo dell'adultosistema riproduttivo, che facilita l'accoppiamento. Raccogliere unmated mosche ogni 4-6 ore. Quando si raccolgono, anestetizzare le mosche con l'introduzione di CO ₂ nel flaconcino, toccare le mosche verso il basso, e li sotto stereomicroscopio (Figura 2) sesso. Posizionare le mosche desiderati in diverse fiale per sesso e fenotipo e l'etichetta delle fiale appropriato.

Nota 1. Raccolta di routine si vede dal mattino, scartando gli adulti che emerse durante la notte precedente. Raccogliere femmine vergini e maschi ingenui una o due volte durante la giornata. Tipicamente, D. melanogaster maschi diventano sessualmente maturi 8 ore dopo eclosion a 25 ° C ^30. Se le mosche sono mantenuti sotto 12:12 cicli giorno / notte ora, due picchi di eclosion sono attesi: durante la prima 1-2 ore dopo la luce è accesa, e durante la 2 ore prima che la luce si spegne. Eclosion si verifica entro 24 ore dopo l'oscura pupa.

Nota 2. Non più di 10 femmine shbbe essere messo nella stessa fiala per evitare sovraffollamento. Ciò limita anche la perdita di femmine nel caso esse devono essere scartati perché almeno uno di loro non è vergine.

Nota 3. Al fine di raccogliere un numero adeguato di femmine vergini e maschi naïve in un breve periodo di tempo, possono essere adottate le seguenti misure. Impostare 15-20 fiale di w ¹¹¹⁸ per gli esperimenti che coinvolgono due tipi di maschi sperimentali (Tabella 1). Leggermente cospargere la superficie dei mezzi di comunicazione e di aggiungere un paio di palline di lieviti secchi attivi per facilitare la deposizione delle uova. Trasferire i genitori almeno 4 volte in giorni consecutivi. Per aumentare la superficie disponibile per pupation in ciascun flacone, inserire la carta multi-piegata (7 x 5 cm) durante il 4 ^° o 5 ^° giorno dopo i genitori vengono trasferiti in un altro flacone (Figura 3). Se il numero di adulti emerse dalla croci iniziale non è sufficiente, attendere ancora qualche giorno e raccogliere singolarmenteals da fiale istituiti in date diverse. Piano per eseguire gli esperimenti su più giorni consecutivi, per uniformare il carico di lavoro.

2. Esperimenti doppio accoppiamento

La Figura 4 mostra le fasi principali in esperimenti doppio accoppiamento eseguiti in ^14.

1. La mattina del 1 ° giorno, ha istituito il primo accoppiamento. I maschi Oregon-R sono i primi ad accoppiarsi nel saggio reato.
   1. Utilizzando l'aspiratore, istituito fiale da 10 4-5-giorni di età dagli occhi bianchi w femmine vergini ¹¹¹⁸ e 10 dagli occhi rossi Oregon-R maschi naïve ciascuno. Due o tre fiale sono impostati al giorno per 5 giorni consecutivi. Il numero di flaconcini da impostare potrebbe variare a seconda del numero di individui disponibili. Lasciare le mosche di accoppiarsi per 2 ore.
   2. Scartare i maschi Oregon-R e posizionare ogni femmina in un nuovo flacone utilizzando un aspiratore (Figura 5). Identificazione sesso può essere ottenuto mediante ispezione visiva di pochidifferenze morfologiche (Figura 2). Etichettare ogni flacone in modo appropriato e lasciare la femmina nel flacone per 2 giorni (di seguito "v1").
2. Il giorno 3, configurare il secondo accoppiamento. Selezione dei maschi e trasversali costituite deve essere eseguita in modo casuale al fine di minimizzare ogni potenziale tendenza verso uno qualsiasi dei tipi maschili sperimentali.
   1. Due ore prima che la luce si spegne, trasferire di nuovo la femmina in un nuovo flacone con un aspiratore. Etichettare il nuovo flacone in modo appropriato (di seguito "v2").
   2. Introdurre tre 5-6-giorni di età maschi sperimentali dello stesso genotipo in v2.
   3. Ripetere 2.2.1 e 2.2.2 per ogni femmina.
   4. Il giorno 4, a due ore a destra prima la luce sia accesa (ossia non più di 12 ore dopo la 2.2.1), scartare i maschi utilizzando l'aspiratore.
3. Il giorno 6, trasferire di nuovo ogni femmina in un altro nuovo flacone. Etichettare le nuove fiale opportunamente (di seguito "v3").
4. Il giorno 10, scartare il w ¹¹¹⁸ femmine.
5. Esaminare le progenie in v2 e v3. La prima ispezione è eseguita dopo 13-15 giorni dopo che la femmina è introdotto nella v2 (o v3), ad esempio, il 17 giorno dopo la femmina prima ovipositing iniziato a v2. La seconda ispezione è eseguita esattamente dopo 17 giorni. Questo lasso di tempo pone un limite temporale superiore di sicurezza che garantisce una seconda generazione nella stessa fiala. Due ispezioni impediscono sovraffollamento, facilitando il conteggio progenie.
   1. Il 17 Giorno, ispezionare v1 e garantire che non vi siano discendenti dagli occhi rossi presente, se non segnare la fiala di conseguenza. Presenza di progenie occhi bianchi indica che la femmina non era vergine al momento dell'accoppiamento iniziale mentre nessuna progenie indica che l'accoppiamento con il riferimento oppure i maschi sperimentali non si è verificato.
   2. Il 17 Giorno, eseguire la prima ispezione di v2. Anesthetize emerso progenie in v2 con CO ₂ e di ordinarli in base al colore degli occhi e il sesso. Numeri progenie record generò dal primo e secondomaschi ond. figura 6 mostra i fenotipi attesi nella prole di ogni schema di accoppiamento. In questo particolare esperimento ^14, solo la progenie femminile può essere univocamente assegnato come generata dal riferimento o i maschi sperimentali e quindi solo le informazioni da figlie può essere usato per calcolare P _2. Se con altri marcatori la paternità prole maschio può essere univocamente assegnato, progenie conteggi di entrambi i sessi possono essere utilizzate nei calcoli a valle. Gettare la progenie, ma mantenere v2 per la seconda ispezione.
   3. Il giorno 20, procedere come in 2.5.2 con la progenie di recente è emerso in v2 e poi gettare il flaconcino.
   4. Il giorno 20, ispezionare la progenie emerse nel v3 per la prima volta e seguire passo 2.5.2.
   5. Il giorno 23, procedere come in 2.5.3 con la progenie di recente è emerso in v3.

Nota 1: A causa del potenziale effetto di gonfiare il P punteggi che l'accoppiamento multiplo potrebbe avere (2.2.2 e 2.2.3), l'accoppiamentopuò essere limitata ad un particolare periodo di tempo. L'arco di tempo dipende dalla frequenza remating associata al genotipo della femmina e maschi utilizzati. La probabilità di accoppiamento multiplo è appositamente ridotta durante la notte ^11.

Nota 2: non aggiungere pellets lievito vivo perché ciò può causare problemi dovuti al potenziale di crescita eccessiva del lievito quando il numero di mosche adulte è basso.

3. Analisi dei dati

1. Progenie conteggi rilevati devono essere organizzati in modo appropriato per una facile ispezione visiva e l'analisi efficiente con un pacchetto statistico adeguato (ad es JMP di SAS Institute) o di strumenti web-based (ad esempio http://vassarstats.net/ ).
2. Capacità competitiva sperma. Aggiungi conta da v2 e v3. Mosche femmine che non hanno dato luogo a nulla o molto limitata progenie (ad esempio <10), è morto durante la procedura, o erano solo successo inseminazioneta da uno dei due maschi sono considerati come non-informativo e sono esclusi da qualsiasi analisi statistica a valle (2.5.1 e Tabella 2). Calcolare il punteggio di ₂ P per ogni femmina informativo.
3. Verificare se ci sono differenze statisticamente significative nei valori di P ₂ tra i maschi sperimentali rispetto. Questo può essere fatto utilizzando parametrico (HSD di Tukey per esempio) o non-parametrici (ad esempio acciaio-Dwass) Test seconda di diversi fattori tra cui l'asimmetria della distribuzione dei valori di P ₂ e la dipendenza tra la varianza e la media. La trasformazione angolare è comunemente applicato a proporzioni come P ₂ prima l'uso di test parametrici ^31.
4. Differenze di accoppiamento (opzionale). Per ogni tipo maschio sperimentale, calcolare il numero di femmine doppiamente accoppiate e quelle che accoppiato solamente con il primo maschio (il maschio di riferimento nel saggio reato e il maschio sperimentale nel dsaggio efense). Utilizzando un test esatto di Fisher a due code (disponibile presso http://www.langsrud.com/fisher.htm ), determinare se vi sono differenze statisticamente significative tra i due tipi di maschi sperimentali.
5. Rapporto tra i sessi (opzionale). Per ogni maschio sperimentale, utilizzare il test del chi-quadrato per determinare se il rapporto tra i sessi nella prole da ogni devia femminili dal rapporto atteso 1:1.

Risultati

La tabella 2 riassume alcune caratteristiche salienti di due esperimenti di reato (saggi 1 e 2), in cui D. melanogaster maschi sperimentali con e senza (tipo I e II, rispettivamente) un cluster SDIC funzionale sono confrontati ^14. Dopo aver preso in considerazione diversi episodi che si sono verificati alcuni replicati, 58-83% delle femmine sono risultati essere informativo e quindi la paternità conti di loro progenie potrebbero essere utilizzati per il calcolo di P _2....

Discussione

Abbiamo descritto il disegno sperimentale per valutare le differenze nel contributo relativo geneticamente distinti D. melanogaster maschi alla progenie in esperimenti a doppio accoppiamento controllati ^7,8. Questo è stato fatto nel contesto di un fattore genetico ipotizzato di influenzare la capacità competitiva sperma, ed è stato illustrato nel saggio reato anche se una procedura simile vale per il saggio difesa (Figura 1). Questo disegno sperimentale può essere modificato a te...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes