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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo sviluppato una coltura cellulare automatizzata e piattaforma di interrogatorio per esperimenti di stimolazione cellulare micro-scala. La piattaforma offre un controllo semplice, versatile e preciso nel coltivare e stimolare le piccole popolazioni di cellule, e recuperando lisati per le analisi molecolari. La piattaforma è adatto a studi che impiegano cellule preziosi e / o reagenti.

Abstract

Studio delle cellule in coltura (analisi in vitro) ha fornito indicazioni importanti in sistemi biologici complessi. I metodi convenzionali e attrezzature per analisi in vitro sono adatti per lo studio di un gran numero di cellule (≥ 10 5) in volumi millilitro scala (≥ 0,1 ml). Tuttavia, ci sono molti casi in cui è necessario o auspicabile ridimensionare dimensione coltura per ridurre il consumo delle cellule di interesse e / o reagenti richiesti per la loro cultura, la stimolazione, o la trasformazione. Purtroppo, gli approcci tradizionali non supportano la manipolazione precisa e riproducibile di culture micro-scala, e dei sistemi automatizzati microfluidica a base attualmente disponibili sono troppo complesse e specializzate per l'uso di routine dalla maggior parte dei laboratori. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una piattaforma tecnologica semplice e versatile per la cultura automatizzata, la stimolazione, e il recupero di piccole popolazioni di cellule (100 - 2.000 cellule) nel volume di micro-scalas (1 - 20 l). La piattaforma è costituita da un insieme di microcapillari fibronectina-rivestito ("camere di perfusione delle cellule"), all'interno del quale sono stabilite le culture micro-scala, mantenuti e stimolati; un dispositivo digitale di microfluidica (DMF) equipaggiati con "trasferimento" microcapillari ("hub centrale "), quali cellule rotte e reagenti da e verso le camere di perfusione; una pompa a siringa ad alta precisione, che trasportano i poteri di materiali tra le camere di perfusione e il mozzo centrale, e un'interfaccia elettronico che consente di controllare il trasporto di materiali, che è coordinato e automatizzato tramite script pre-determinati. Come esempio, abbiamo utilizzato la piattaforma per facilitare lo studio di risposte trascrizionali indotte in cellule immunitarie upon sfida con i batteri. Utilizzo della piattaforma ci ha permesso di ridurre il consumo di cellule e reagenti, minimizzare la variabilità esperimento a esperimento, e ri-diretti hands-on del lavoro. Considerati i vantaggi che essa conferisce, così come la sua accessibilità e versatilità, opiattaforma ur dovrebbe trovare uso in un'ampia varietà di laboratori e applicazioni, e rivelarsi particolarmente utile nel facilitare l'analisi di cellule e stimoli che sono disponibili solo in quantità limitate.

Introduzione

Lo studio delle cellule mantenute in coltura (analisi in vitro) ha fornito preziose informazioni sui principi fondamentali e dei meccanismi molecolari che regolano i complessi sistemi biologici e la salute umana. I metodi convenzionali per la cultura, la stimolazione, e la raccolta di cellule per l'analisi, che utilizzano capsule di Petri e micropiastre, sono stati progettati per lo studio di grandi popolazioni di cellule (≥ 10 5) in volumi di coltura millilitro scala (≥ 0,1 ml). Tuttavia, ci sono molti casi in cui sono disponibili soltanto quantità limitate di cellule (per esempio cellule primarie), o piccole popolazioni di cellule sono desiderabili (es. ridurre cellula-cellula variabilità nella popolazione), o reagenti necessari sono difficili da ottenere o costi proibitivi (ad es purificati fattori cellula-secrete). Tali problemi possono essere affrontati con successo dal ridimensionamento dimensione culturale, che ha il vantaggio di ridurre il consumo di tutti ireagenti necessari per l'analisi in vitro 1,2. Purtroppo, attrezzature e metodi convenzionali non supportano la manipolazione precisa e riproducibile di culture micro-scala ed i sistemi automatizzati di microfluidica a base attualmente disponibili 3-11 sono troppo complesse e specializzate per l'uso di routine dalla maggior parte dei laboratori.

In questo rapporto, descriviamo il montaggio e l'uso di una piattaforma tecnologica semplice e versatile per la cultura automatizzata, la stimolazione, e il recupero di piccole popolazioni di cellule (100 - 2.000 cellule) in volumi di micro-scala (1-20 ml). L'architettura della piattaforma (Figura 1) ha un design modulare: una serie di fibronectina rivestito microcapillari ("camere di perfusione delle cellule" modulo) serve come sito per la creazione, la manutenzione e la stimolazione delle colture micro-scala, e una microfluidica digitale (DMF ) 12,13 dispositivo equipaggiato con il "trasferimento" microcapillari (modulo "centrale hub") 14,15 celle rottee reagenti da e per le camere di perfusione. DMF consente all'utente di affrontare individualmente multiple goccioline simultaneamente e per modificare o ri-ordinare le manipolazioni (cioè riconfigurare i treni di trattamento del campione) senza modificare l'hardware del dispositivo. La sua grande flessibilità è evidente nella sua recente comparsa come una tecnologia chiave in una vasta gamma di applicazioni, tra cui la coltura cellulare 16,17, saggi enzimatici 18,19, 20,21 immunologici, analisi del DNA 22,23, trasformazione delle proteine, 24,25 clinica e trattamento dei campioni. 26,27 nostro mozzo centrale sfrutta la flessibilità inerente ai dispositivi DMF, e migliora ulteriormente attraverso l'aggiunta di interfacce microcapillari, che fornisce opportunità di realizzare un sottoinsieme di manipolazioni (es. coltura cellulare) in periferico specializzato moduli, piuttosto che sul dispositivo DMF stesso. Compartimentazione dei treni di elaborazione in questo modo semplifica anche la progettazione del plaarchitettura TForm (nessun bisogno di costruire un dispositivo di DMF in grado di eseguire tutte le fasi di lavorazione) e facilita la sua evoluzione come nuove funzioni sono necessarie (semplicemente integrare nuovi moduli periferici, se necessario). Trasporto delle cellule e reagenti all'interno del mozzo centrale è guidato da elettrowetting forze generate mediante attivazione sequenziale di elettrodi all'interno del dispositivo di DMF 13,28, trasporti verso, da e all'interno delle camere di perfusione è alimentato da variazioni di pressione generate da una siringa ad alta precisione pompa. Tutti questi movimenti fluidi sono controllati tramite una semplice interfaccia elettronica e automatizzata mediante l'utilizzo di script pre-determinati.

Come esempio rappresentativo, dimostriamo l'utilizzo della piattaforma per lo studio delle risposte trascrizionali suscitato in cellule del sistema immunitario su sfida con i batteri (Figura 2). Svolgimento di tali esperimenti sulla piattaforma ci ha permesso di lavorare con un piccolo numero di cellule (~ 1.000 per sperimentazionecondizione Tal), ridurre al minimo la variabilità esperimento a esperimento, i reagenti conservare, e ri-diretto hands-on del lavoro. Considerati i vantaggi che essa conferisce, così come la sua accessibilità e versatilità, questa piattaforma dovrebbe trovare uso in un'ampia varietà di laboratori e applicazioni e rivelarsi particolarmente utile nel facilitare l'analisi di cellule e stimoli che sono disponibili solo in quantità limitate.

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Protocollo

Questo protocollo generale è progettata per supportare l'applicazione della piattaforma per un'ampia varietà di studi; aspetti specifici allo studio rappresentativo descritta nella presente relazione vengono separati tra parentesi Figura 2 illustra uno studio rappresentativo effettuato utilizzando il protocollo.. Si noti che nel protocollo, tutte le "istruire" i comandi sono automatizzati attraverso l'uso di script pre-determinati. Si noti anche che la Fase 2 può essere effettuata in parallelo con la fase 1 (ad esempio durante le fasi 1.7 e 1.8), e che la Fase 2.1 è spesso bypassato (perché modellata / piastre rivestite dispositivo DMF possono essere lavati e riutilizzati; vedi passo 5.2) .

1. Assemblare e popolare le camere di perfusione delle cellule

  1. Ricoprire le superfici interne di sterilizzato (autoclave) microcapillari (silice fusa; 679 micron od, id 534 micron; lunghezza 15 cm) con fibronectina, istruendo la pompa a siringa per disegnare una soluzione sterile di fibronectina (30 pl di 50 ug / ml) in ciascunmicrocapillari, incubando (37 ° C per 2 h), istruendo la pompa a siringa per aspirare la soluzione, e lasciando che il microcapillari secco (temperatura ambiente (RT) per 6 ore).
  2. Collegare ogni fibronectina rivestito microcapillare (camera di perfusione) per tubi in policarbonato (500 micron od, id 100 micron) e il tubo alla pompa siringa multi-porta, utilizzando raccordi CapTite (6 camere di perfusione, 8 porte pompa siringa).
  3. Con del nastro, fissare il corpo di ogni camera di perfusione ad un blocco di calore impostato temperatura desiderata (37 ° C).
  4. Immergere le estremità aperte delle camere di perfusione in un serbatoio (tubo microcentifuge o micropiastra bene) le celle che contengono (P388D.1 macrofagi murini) sospese in terreno di crescita fresca (RPMI-1640, 10% FBS, 500 unità / ml di penicillina, 500 mg / ml di streptomicina) alla concentrazione desiderata (10 6 cellule / ml).
  5. Istruire la pompa a siringa per disegnare le celle (10 ml, 10 4 cellule) in ogni camera di perfusione seguita da sufficiente air per spostare il tappo di liquido (~ 4,5 cm) alla sezione fissata al blocco di calore.
  6. Permettono alle cellule di aderire alle superfici interne rivestite di fibronectina delle camere di perfusione (37 ° C per 1 - 2 ore). Nel frattempo, trasferire le estremità aperte delle camere di perfusione dal serbatoio cellule per un nuovo serbatoio contenente terreno di coltura fresco.
  7. Dopo il periodo di adesione, istruire la pompa a siringa per inviare i tappi di liquidi (mezzi condizionati e cellule non collegata) da perdere, ritirarsi mezzo fresco (10 ml), e seguire con aria sufficiente per posizionare i nuovi tappi di liquido (mezzo fresco) sulla aderito cellule.
  8. Continuare a svolgere scambi medi (cioè ripetere il punto 1.7) a intervalli regolari (ogni 2 ore) fino a quando le popolazioni cellulari sono sufficientemente equilibrato ed espansa (16 - 24 ore di coltura di micro-scala generate popolazioni di ~ 1.000 cellule / camera).

2. Realizzare il dispositivo DMF e montare il mozzo Architettura

  1. Come descritto in precedenza 14,29, modello la piastra inferiore del dispositivo DMF con quarantasei ossido di indio e stagno (ITO) elettrodi (conducenti di goccia erogazione) di fotolitografia e incisione, e cappotto con 5 micron di parylene-C e 50 nm di Teflon AF. Formare la piastra superiore del dispositivo DMF mediante rivestimento di un substrato di vetro ITO nanostrutturata con Teflon-AF, come sopra.
  2. Utilizzando telai metallici di compressione, fissare le piastre DMF in un cast polimero 14,30 con rientranze che mantengono una spaziatura 400 micron tra le piastre, questa spaziatura, unitamente al volume elettrodo azionamento (2,5 mm 2), definisce il volume delle gocce (2,5 microlitri per ogni elettrodo). Notare che DMF assemblaggio può essere realizzato con mezzi più semplici 24.
  3. Inserto teflonato trasferimento microcapillari (360 micron od, id 100 micron; 3,5 - lunghezza 4,0 cm) nello spazio tra le piastre DMF, posizionando ciascuno di estendere al bordo del suo affine elettrodo di azionamento.
  4. Al contrario end di ogni trasferimento apporre microcapillare un raccordo CapTite.
  5. Innestare i connettori elettrici per fornire tensione agli elettrodi ITO. Sequenze di attivazione degli elettrodi sono automatizzate con l'uso di una interfaccia elettronica controllato dal computer che esegue gli script di pre-determinati.
  6. Opzionale: Spostare il mozzo DMF montato sul palco traslazionale di un microscopio (SZ-6145TR (Olympus, Giappone)) dotato di un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) fotocamera (DCR-HC96 (Sony, Giappone)) per facilitare il monitoraggio delle goccioline 31.

3. Collegare le camere di perfusione al Hub DMF e stimolare le popolazioni di cellule

  1. Rimuovere le estremità aperte delle camere di perfusione dal serbatoio mezzo (vedere il punto 1.6) e inserirli nei raccordi CapTite fissate alle estremità del trasferimento microcapillari del mozzo DMF (vedere il punto 2.4).
  2. Istruire la pompa a siringa per inviare i tappi di liquidi (mezzi condizionati) nelle camere di perfusione da perdere.
  3. Instruct il mozzo DMF per disegnare stimolo (E. coli bioparticelle a 100 pg / ml in terreno fresco contenente 0.1% Pluronic F127 w / v) da un serbatoio di bordo e fornire una gocciolina di dimensione appropriata (10 microlitri) per ogni trasferimento microcapillari . Le bordo serbatoi sono costituiti da scomparti di forma cilindrica (1,5 x 1,5 cm ciascuno) e collegato all'hub DMF tramite un tubo.
  4. Istruire la pompa a siringa per disegnare lo stimolo collega al trasferimento microcapillari, e seguire con aria sufficiente per posizionare i tappi sulle popolazioni cellulari nelle camere di perfusione.
  5. Incubare le cellule con stimolo (37 ° C per 1 - 4 ore). Optional: Cambio di stimolo fresco (cioè ripetere i passaggi 3,2-3,4) ad intervalli regolari.

4. Terminate stimolazione e recuperare lisati cellulari per l'analisi

  1. Opzionale: Se è richiesto un periodo di post-stimolazione, scambiarsi gli stimoli che contengono spine liquidi per mezzo fresco (cioè ripetere i passi 3,2-30,4, sostituendo mezzo fresco di stimolo), e continuare a incubare e scambiare, se necessario.
  2. Scambio i tappi liquido nelle camere di perfusione per la soluzione di lavaggio (Prelude diretto Lysis Buffer Modulo B) (cioè ripetere i passaggi 3,2-3,4, in sostituzione del tampone di lavaggio per stimolo), e incubare come necessario (5 min).
  3. Scambio i tappi liquidi (tampone di lavaggio) per la soluzione di lisi (Preludio diretto Lysis Buffer Modulo A con 0,1% Pluronic F127 w / v) (cioè ripetere i passaggi 3,2-3,4, sostituendo la soluzione di lisi per stimolo), e incubare come necessario (5 min) .
  4. Istruire la pompa a siringa per inviare i tappi liquidi (lisato cellulare) al mozzo DMF.
  5. Smontare il mozzo DMF, rimuovere la piastra superiore del dispositivo DMF (facendo attenzione a non inclinare il piatto di lato, in quanto questo può portare a delle gocce di miscelazione), e raccogliere i lisati utilizzando una Pipetman o siringa per l'analisi off-piattaforma (profili di espressione genica tramite qPCR).

5. Clean piattaforma hardware perRiutilizzare

  1. Immergere il trasferimento microcapillari e raccordi CapTite in candeggina al 10% (v / v in acqua) per 10 min a RT, sciacquare bene con acqua deionizzata e asciugare con gas azoto.
  2. Immergere le piastre dispositivo DMF nel 10% di candeggina per 10 min a RT, sciacquare bene con isopropanolo e poi con acqua deionizzata e asciugare con azoto seguita da cottura a 160 ° C per 10 min.
  3. Tubi in policarbonato della pompa siringa, e polimero fuso del dispositivo DMF e telaio di compressione, può essere riutilizzato senza pulizia. La camera di perfusione microcapillari vengono scartati dopo ogni esperimento.

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Risultati

A dimostrazione della piattaforma automatizzata, lo abbiamo utilizzato per realizzare uno studio in cui piccole popolazioni di cellule immunitarie sono state fatte crescere in colture di micro-scala, provocati con i batteri, e lisate per l'analisi off-piattaforma di risposte pro-infiammatorie (Figura 2 ).

Ognuno dei sei camere di perfusione delle cellule è stato seminato con 10 4 cellule immunitarie (P388D.1 macrofagi murini) risospeso in 10 ml di terreno di ...

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Discussione

Abbiamo sviluppato una piattaforma automatizzata semplice e versatile per la coltura cellulare micro-scala e di esperimenti di stimolazione. La piattaforma consente di lavorare con piccoli volumi di coltura e le popolazioni di cellule (1-20 ml e 100 - 2.000 cellule, per camera); dimensioni cultura potrebbe essere ulteriormente ridotto mediante l'utilizzo di microcapillari di diametro inferiore. Lavorare in queste scale riduce il costo degli studi di routine e rende realizzabili gli studi che richiedono l...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Ronald F. Renzi e Michael S. Bartsch per i loro contributi alla progettazione e sviluppo di dispositivi di DMF e l'hub DMF. Questa ricerca è stata interamente sostenuta dal Laboratorio di Regia Programma di ricerca e sviluppo presso i Sandia National Laboratories. Sandia è un laboratorio multi-programma gestito e gestito da Sandia Corporation, una consociata interamente controllata di Lockheed Martin Corporation, per il Dipartimento della National Nuclear Security Administration di Energia degli Stati Uniti sotto contratto DE-AC04-94AL85000.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Prelude Direct Lysis ModuleNuGEN1400-24
Trypan Blue (0.4% w/v)GIBCO15250-061
Cell StripperCellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesInvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR assayApplied BiosystemsMm99999915_g1
Pluronic F127Sigma Chemical2594628
Fluorinert FC-40Sigma Chemical51142-49-5
Parylene C dimerSpecialty Coating Systems28804-46-8
Teflon-AFDuPontAF1600
Polyimide tapeULINES-11928
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates Delta TechnologiesCB-40IN-1107
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillariesPolymicro TechnologiesTSU100375
Perfusion chamber microcapillariesPolymicro TechnologiesTSP530700
Tubing and microcapillary fittingsSandia National Laboratories
Polycarbonate tubingParadigm OpticsCTPC100-500-5
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringesHamilton Company54848-01
Parylene-C vapor deposition instrumentSpecialty Coating SystemsPDS 2010 Labcoter 2
High-voltage function generatorTrek615A-1 615-3
MVX10 microscopeOlympusOptional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)
QIClick digital CCD cameraQImagingQIClick-F-CLR-12Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)

Riferimenti

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