Contemporaneamente Catturare immagini in tempo reale in due canali di emissione Utilizzando un Splitting sistema Dual Camera Emissione: Applications to Cell Adhesion

Riepilogo

Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera per due colori microscopia a fluorescenza generano in tempo reale sequenze di immagini con risoluzione ottica e temporale eccezionale, un requisito di alcuni saggi cellulari in tempo reale tra cui saggi di adesione cella di flusso piastra paralleli. Quando il software viene utilizzato per unire le immagini provenienti dai canali di emissione acquistati contemporaneamente, sequenze di immagini pseudocolored sono prodotti.

Abstract

Multicolore immunofluorescenza microscopia per rilevare specifiche molecole nella membrana cellulare può essere accoppiato con saggi camera di flusso piastra paralleli a studiare i meccanismi che regolano l'adesione cellulare in condizioni di flusso dinamico. Per esempio, le cellule tumorali marcate con fluorofori multipli possono essere perfusi sopra un substrato potenzialmente reattivi per modellare meccanismi di metastasi del cancro. Tuttavia, i sistemi un'unica telecamera multi-canale e videocamere a colori presentano carenze in acquisizione delle immagini per analisi in tempo reale delle cellule vive. Per superare queste limitazioni, abbiamo utilizzato un sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera per catturare simultaneamente in tempo reale sequenze di immagini di cellule fluorescente nella camera di flusso. Lunghezza d'onda del filtro sistemi di scissione delle emissioni doppia fotocamera definito spazia in due fotocamere CCD monocromatiche, così contemporaneamente catturare due immagini identiche ma spazialmente specifico fluoroforo. Successivamente, psuedocolored immagini una canali sono combinati in un unicoin tempo reale fusa sequenza che può rivelare più molecole bersaglio sulle cellule muoversi rapidamente in una regione di interesse.

Introduzione

Metodi per l'analisi di molecole sulla superficie cellulare, come immunostaining, impiegano sonde coniugate chimicamente per fluorofori, permettendo la rilevazione di molecole bersaglio. Cellule vive e saggi di adesione cellulare basati sul flusso idrodinamico sono tipicamente registrate con telecamere CCD monocromatico per catturare processi fisiologici a livello cellulare e / o molecolare ^{1, 2.} Queste telecamere sono estremamente sensibili, consegnare frame rate veloci (superiori a 30 fotogrammi al secondo), e di fornire risoluzione temporale eccezionale (a causa di frame rate veloci e tempi di esposizione brevi). Tuttavia, le telecamere monocromatiche possono catturare solo un singolo canale di emissione (rilevare un singolo fluoroforo) per raccogliere immagini. Sistemi splitting emissione fotocamera singoli possono essere incorporati per catturare canali multipli emissione ma spesso riducono il campo visivo e richiedono lo stesso tempo di esposizione per l'imaging tutti i canali. Per catturare lo spettro di colori da cellule marcate con multipLe fluorofori, una telecamera a colori può essere utilizzata come alternativa. Tuttavia, telecamere a colori non sono generalmente in grado di fornire la risoluzione temporale desiderato per l'imaging cellulare dal vivo in alcune applicazioni. Un altro dispositivo di imaging è necessaria per applicazioni in cui è vantaggioso immagine cellule scena a più lunghezze d'onda, pur mantenendo un'elevata risoluzione temporale. Un'applicazione sperimentale principale è la camera di flusso piastra di saggio adesione parallelo, in cui le cellule sono perfusi in condizioni fisiologicamente rilevanti sopra un substrato potenzialmente reattivi ^{1, 3.} Le cellule in flusso che esprimono specifiche molecole della superficie cellulare possono aderire e rotolano sul substrato, come un monostrato di cellule che esprimono molecole di adesione o proteine ​​della matrice extracellulare-superficie adsorbito ^{4, 5.} Celle di laminazione possono subire movimento di rotazione e traslazione in frazioni di secondo. Caratteristiche molecolari di rotolamento e cellule aderenti, ad esempio gruppi di molecole di superficie cellulare, hanno anche il potenziometroal di sottoporsi riorganizzazione attiva sulla superficie cellulare. Così, sistemi di imaging devono fornire una risoluzione temporale eccezionale (30 fotogrammi al secondo o superiore e "vicino allo zero" tempi di esposizione) per generare una sequenza di immagini che illustra la progressione passo-passo di cellula rotolamento ^{6, 7.} Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera sono in grado di soddisfare queste esigenze di imaging di cellule marcate con più fluorofori.

Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera divisi e canali del filtro di fluorescenza in due fotocamere simili per catturare simultaneamente due immagini identiche ma spazialmente specifico fluoroforo, pur mantenendo l'intero campo visivo. Questa tecnologia consente il confronto diretto delle immagini catturate in tempo reale in ciascun canale e permette all'utente di passare rapidamente tra i modelli di fotocamere con differenti capacità di imaging. Questa funzione è utile per effettuare regolazioni alle impostazioni di cattura immagine in una macchina fotografica che meglio consentono al sistema di catturarefluorofori con diverse intensità, durata e coefficienti di estinzione ^8. Accoppiato con software di imaging, sistemi splitting emissione telecamere doppi permettono la registrazione in tempo reale di saggi imaging delle cellule vive a lunghezze d'onda multiple e possono aumentare saggi in vitro che utilizzano fluorescenza per studiare il comportamento cellulare.

Protocollo

1. Installazione del software

1. Acquistare StreamPix 5 software Multi-Camera con modulo SimulPix o altri software di imaging in grado di raccogliere e combinare immagini catturate dalle telecamere in bianco e nero CCD.
2. Requisiti minimi per StreamPix 5 includono: Un PC dotato di processore Core 2 Duo a 2,4 GHz o superiore con 2 GB di RAM o superiore. Una fotocamera supportata IEEE digitale o analogico e frame grabber compatibile. XP/7/Vista di Windows a 32 o 64 bit. Un monitor con risoluzione 1.024 x 768 o superiore. Una scheda grafica con buone prestazioni in 2D (OCU espresso 16x o superiore è consigliato) e 7.200 RPM disco rigido per la registrazione con configurazione RAID-O.

2. L'installazione del sistema Dual Camera Capace di due colori simultanea in tempo reale Imaging

1. Collegare lo splitter DC2 fotometrici delle emissioni, o simile dispositivo frazionamento delle emissioni doppia fotocamera, al microscopio facendo scorrere l'adattatore DC2 C-mount nella porta video del microscope tale che l'alloggiamento della dicroico sul dispositivo è accessibile.
2. Inserire due telecamere in bianco e nero CCD in femmine di C-mount 1 e femmina C-mount 2. Telecamere identiche sono preferibili. Telecamere simili possono essere utilizzati, ma la compatibilità dipende hardware interno, soprattutto il sensore d'immagine CCD.
3. Utilizzare software di imaging per visualizzare immagini da entrambe le fotocamere. I passi seguenti (2.3.1 - 2.3.4) si applicano a StreamPix 5 con modulo SimulPix e devono essere adattati per altri software di imaging multi-camera.
   1. Aprire StreamPix 5 e selezionare "workspace" nella barra multifunzione compito.
   2. Apri "gestore di lavoro" che si trova all'estrema destra dello schermo e selezionare "nuova area di lavoro".
   3. Dopo aver nominato una macchina fotografica, seguire il software richiede di selezionare un grabber da un elenco pre-popolato. Selezionare il grabber corrispondente al modello di fotocamera e ripetere per il secondo lavoro della fotocamera. Per l'area di lavoro risultante dalla fusione, ripetere ancora una volta, ma "tutte le telecamere sono in uso" errore messaggio apparirà. Questo messaggio è normale.
   4. Una volta caricato il lavoro risultante dalla fusione, assegnare le telecamere dal lavoro 1 e 2 di lavoro per l'area di lavoro risultante dalla fusione nel pannello di aggancio che si trova sul lato destro dello schermo di visualizzazione.
4. Allineare le telecamere del sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera.
   1. Allineare telecamere in campo chiaro o contrasto di fase con la griglia di calibrazione fornito dal produttore con obiettivo Planapo 40X (o superiore).
   2. Invia luce per gli oculari del microscopio, posizionare la griglia di calibrazione rivestito metallico che è stato fornito dal produttore sul palco microscopio, e piazza la griglia sul palco microscopio.
   3. Portare la griglia a fuoco.
   4. Spostare, ma non rimuovere, l'alloggiamento dicroici per allineare la telecamera 1 (fotocamera bypass). Visualizzare la griglia senza binning e senza autoscaling. Mettere a fuoco l'immagine utilizzando la ghiera di messa a fuoco sulla porta C-mount 1.
   5. Spingere l'alloggiamento dicroico in dual channel dispositivo di acquisizione completamente, in modo che l'immagine è divisa dal dicroico per entrambe le telecamere.
   6. Allentare le tre 5/64 "set viti e ruotare la seconda fotocamera sulla femmina C-mount 2 fino l'orientamento della griglia è identica in entrambe le immagini. Usando la manopola di regolazione della messa a fuoco su C-mount porta 2, portare l'immagine dalla telecamera 2 a fuoco.
   7. Finalizzare l'allineamento con l'immagine combinata nell'area di lavoro risultante dalla fusione del software di imaging. Questo permette di vedere un pseudocolore overlay tempo reale delle due immagini della griglia di calibrazione. Regolare le posizioni dell'immagine combinati utilizzando solo la manopola R / L sul lato destro del DC2. Regolare la manopola finché confine verticale destro / sinistro delle immagini è allineato con precisione.
   8. Usare la manopola U / D per regolare l'allineamento su / giù della seconda immagine fino a quando le barre orizzontali della griglia siano allineati correttamente.
   9. Se durante l'allineamento su / giù una leggera rotazione della telecamera si verifica, correggere questo problema svitando le tre 5/64 "sch polliciws per la fotocamera da 2 e ruotare fino a quando l'immagine visualizzata è allineato correttamente.

3. Preparazione delle cellule tumorali per piastra Parallel flusso Sezione Adesione saggio

1. Culture BT-20 cellule di carcinoma mammario in mezzo minimo essenziale (MEM) addizionato a mezzo completo con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C e 5,0% di CO _2, come precedentemente descritto ^2.
2. Cellule tumorali raccolta con un trattamento diluito tripsina e contare le cellule con un emocitometro.
3. Lavare e sospendere le cellule a 10 ⁷ cellule / ml in 0,1% di albumina di siero bovino (BSA) in DPBS con calcio e magnesio (DPBS +).
4. Diluire anticorpi primari, topo purificato anti-CD24 umano e di ratto purificato HECA-452 (antigeni anti-sialofucosylated), a una concentrazione ottimale predeterminata in 0,1% BSA DPBS +. Incubare le cellule per 30 min ^{9, 10.}
5. Centrifugare le cellule a 1.200 giri per ottenere un pellet di cellule. Aspivotare un anticorpo primario, e lavare le cellule due volte con 0,1% BSA DBPS +.
6. Diluire anticorpi secondari, di capra anti-topo IgG AlexaFluor 568 (emissione di max, 603 nm), e di capra anti-topo IgM AlexaFluor 488 (emissione di max, 519 nm), a una concentrazione ottimale predeterminata in 0.1% BSA DPBS +. Incubare le cellule per 30 min.
7. Lavare le cellule due volte e sospendere in 0,1% BSA DPBS + a 10 ⁶ cellule / ml a 0,1% BSA DPBS +.

4. Preparazione del reattivo substrato per la piastra Parallel flusso Sezione Adesione saggio

1. Collegare due tratti separati di tubi per condotti di aspirazione e di mandata della camera di flusso a piatti paralleli che si inserisce all'interno di un piatto di coltura tissutale da 35 mm. Un tubo si collega al serbatoio di cellule marcate sospese in 0,1% BSA DPBS + e l'altro alla pompa siringa, che si ritirerà fluido ad una portata specificata.
2. Collegare una linea di vuoto nella camera di flusso ^1.
3. Posizionare la camera di flusso sopra da 35 mm di coltura tissutalesh contenente un monostrato di cellule ovariche di criceto cinese che esprimono E-selectina (CHO-E). Cellule CHO-E sono state coltivate in terreno MEM completo a 37 ° C e 5,0% di CO ₂ ^2.
4. Regolare la camera di flusso e / o guarnizione camera di flusso per garantire un'adeguata tenuta di vuoto ^1.
5. Ritirare liquido dal serbatoio, il monitoraggio del gruppo di camera di flusso per la corretta tenuta e nessuna prova visiva di formazione di bolle d'aria ^1.
6. Mettere assieme camera di flusso su microscopio (Leica DMI 6000B) ^1.

5. Due colori Acquisizione Immagine

1. Potenza di una sorgente di luce compatta Leica EL-6000, o un dispositivo simile, per generare luce ad alta intensità e di coppia in una guida di luce. Utilizzare un microscopio invertito a passare questa luce attraverso un filtro combinazione cubo, vale a dire G / R (verde / rosso) Filtro cubo, per eccitare fluorofori di colore desiderata / intensità.
2. Assicurarsi abitazioni dicroico è in posizione di lavoro corretta (depresso) enon è in modalità bypass.
3. Operare microscopio in modalità fluorescenza e seleziona il corretto cubo filtro a fluorescenza (verde / rosso).
4. Determinare il tempo di esposizione e guadagno in camera 1 (rossa; 620 ± 60 nm) e fotocamera da 2 (verde, 535 ± 40 nm).
   1. Premere il dicroici per ottenere immagini in entrambi i canali di emissione di rosso e verde. Utilizzare un saggio camera di flusso con cellule marcate con solo il fluoroforo rosso, e ottenere un'immagine nel canale rosso regolando il tempo di esposizione della telecamera 1 in "live" impostazioni del software di imaging.
   2. Far corrispondere il tempo di esposizione della fotocamera da 2 per il tempo di esposizione della fotocamera 1. Se un'immagine è osservata nel canale verde, artefatti sanguinare-through sono presenti e tempo di esposizione in entrambe le telecamere deve essere ridotto.
   3. Mantenere il tempo di esposizione equivalente a macchina 1 e 2 telecamera, ridurre il tempo di esposizione fino al manufatto sanguinare-through non è più visibile nel canale verde. Regolare il guadagno della telecamera 1 per migliorare l'immagine visibility nel canale rosso se necessario.
   4. Ripetere i punti 5.4.1 - 5.4.3 con cellule marcate solo con il fluorocromo verde, ma definire il tempo di esposizione con fotocamera da 2 a celle di immagine nel canale verde senza artefatti sanguinare-through nel canale rosso raccolti dalla macchina fotografica 1.
   5. Anticorpi Retitrate se artefatti sanguinare-through non possono essere eliminati ^11, o se i tempi di esposizione della fotocamera 1 e fotocamera da 2 sono sostanzialmente diverse tali che fuse le immagini possono essere temporalmente disallineati.
5. Utilizzare software di imaging per visualizzare le immagini contemporaneamente catturate da due telecamere in bianco e nero CCD nell'esperimento camera di flusso.
6. Unisci immagini raccolte da entrambe le telecamere utilizzando il modulo SimulPix di Streampix 5 o un pacchetto software alternativo.
7. Utilizzare adeguamenti correzione digitale in SimulPix o software alternativo per allineare spazialmente le immagini fuse, se necessario. Le immagini possono essere corretti con il modulo SimulPix per orizzontale, verticale, e gli adeguamenti rotazione.

Risultati

Una camera di flusso piatto saggi di adesione parallelo è stato utilizzato per dimostrare un sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera che, contemporaneamente catturato sequenze di immagini in tempo reale in due canali di emissione (Figura 1). Il sistema di splittaggio emissione fotocamera dual rilevato BT-20 cellule che sono state fluorescente con anti-CD24 umano e HECA-452 (rilevamento di antigeni sialofucosylated) anticorpi monoclonali e anticorpi secondari appropriati (Figura 2...

Discussione

Il sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera ha la risoluzione spaziale, temporale e ottica necessarie a catturare immagini di alta qualità in applicazioni dove cella o movimento molecolare è rapido. Nel generare i risultati rappresentativi, parametri del sistema duale splitting emissione telecamera, incluse le impostazioni software e le impostazioni della fotocamera, sono stati ottimizzati per ottenere una sequenza immagine fusa in cui rotolamento e cellule aderenti sono spazialmente e temporalmente alli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E cells	Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoclonal antibody	BD Biosciences	555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
[header]
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter	Photometrics	DC2
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix