Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per la generazione di numeri di grandi dimensioni (migliaia a centinaia di migliaia) di taglia e sferoidi tumorali uniformi di composizione controllata, utilizzando micropiastra disponibili in commercio.

Abstract

Sferoidi tumorali sono sempre più riconosciuti come un importante modello in vitro per il comportamento delle cellule tumorali in tre dimensioni. Più fisiologicamente rilevanti di culture aderente fogli convenzionali, ricapitolano più accuratamente la complessità e interazioni presenti nei tumori reali. Per sfruttare questo modello per valutare meglio la biologia del tumore, o l'efficacia di nuovi agenti terapeutici, è necessario essere in grado di generare sferoidi riproducibile, in modo controllato ed in numero significativo.

Il sistema AggreWell costituito da un array ad alta densità di micropozzetti a forma di piramide, in cui viene centrifugato una sospensione di cellule singole. I numeri di cellule raggrupparsi a fondo di ciascun pozzetto, e il numero e il rapporto di tipi cellulari distinti coinvolti dipendere solo dalle proprietà della sospensione introdotta dallo sperimentatore. Quindi, siamo in grado di generare sferoidi tumorali di dimensione arbitraria e composizione conle necessità di modificare la tecnologia della piattaforma sottostante. Le centinaia di pozzetti per centimetro quadrato di superficie cultura a sua volta assicurare che i livelli di produzione estremamente elevati possono essere raggiunti attraverso un semplice processo ad alta intensità di nonlabor. Ci aspettiamo quindi che questo protocollo sarà ampiamente utile ai ricercatori nel campo sferoide tumore.

Introduzione

Vi è un numero crescente di elementi che le cellule tumorali si comportano in modo diverso in tre culture dimensionali di quanto non facciano quando coltivate su plastica, e che gli agenti terapeutici individuati su piattaforme tessuto-coltura convenzionali possono perdere efficacia quando la transizione a un sistema più fisiologicamente rilevanti ^1. È pertanto auspicabile studiare il comportamento delle cellule tumorali in queste condizioni, sia per acquisire conoscenze in loro biologia sottostante, e anche per aumentare il tasso di successo di transizione nuovi agenti terapeutici dalla struttura di screening alla clinica. Un sistema modello utile con una lunga storia impiega cluster tridimensionali di cellule tumorali conosciute come sferoidi tumorali ^1,2. Idealmente, le tecniche di formazione sferoide consentirebbero produzione di un gran numero di sferoidi uniformi le cui dimensioni e la composizione sono controllati dallo sperimentatore. Mentre si avvicina hanging-drop e ben piastra ^3,4 sono in grado di soddisfare alcune di queste rerequisiti, il throughput è generalmente limitata, e la generazione di un gran numero di sferoidi diventa un'attività ad alta intensità di manodopera.

Abbiamo recentemente sviluppato un sistema per risolvere le sfide simili nel campo della medicina rigenerativa ^5. Impiegando aggregazione forzata all'interno di una serie di pozzi densamente micron scala (vedi Figura 1), questo approccio consente la generazione di sferoidi da un numero arbitrario di cellule, comprese le miscele di diversi tipi di cellule ^6, così come l'integrazione di vari biomateriali ^7. Sferoidi sono formate in gran numero - migliaia a centinaia di migliaia o più - e possono essere estratti immediatamente o mantenuti in micropozzetti in cui è stata formata con cambio medio per almeno un ⁸ a due (osservazioni non pubblicate) settimane. Questo sistema è quindi adatto per la generazione di grandi quantità di uniforme e sferoidi tumorali riproducibili per la valutazione della effectiveness di nuovi agenti antitumorali o indagini biologiche di base.

Protocollo

NOTA: Piastre Elisa sono disponibili in diversi formati, a seconda dei risultati desiderati. Specifiche nonché le linee guida approssimativi per i numeri minimi e massimi di cellule che devono essere utilizzati con ogni formato sono mostrati nella Tabella 1. I pozzetti più piccoli cono di una punta acuminata, e quindi non vi è alcun limite di dimensione inferiore, anche se la variabilità tra sferoidi diventa più significativo a dimensioni più piccole. Produzione di routine di sferoidi da una media di appena 20 celle ciascuno è semplice ^8. La dimensione micropozzetti più grande non è completamente rastremato, tenta quindi di formare sferoidi da un piccolo numero di cellule può causare diversi sferoidi più piccoli in ogni pozzetto. A causa di lievi differenze nelle proprietà di superficie, la preparazione con la soluzione di tensioattivo (punto 1.2) non è un optional quando si utilizza piastre AggreWell 400Ex.

Questo protocollo si basa sull'uso di AggreWell 400 piastre - per altri formati consult Tabella 1. Il numero di celle da caricare in ogni pozzetto viene determinato moltiplicando il numero di micropozzetti contiene dal numero di celle da cluster per ogni sferoide. Ad esempio, per generare sferoidi di 1000 cellule a testa, ogni pozzetto deve essere caricato con (1.200 sferoidi volte 1.000 celle ciascuna =) 1,2 x 10 ⁶ cellule. Densità cellulare deve essere calcolata dal momento che le cellule saranno caricati in un volume di 0,4 ml. Quindi per l'esempio di sferoidi formata da 1000 cellule ciascuno, 1,2 x 10 ⁶ cellule in 0,4 ml traduce in una densità di 3 x 10 ⁶ cellule per ml.

1. Micropozzetti prepararci a ricevere le celle

1. Micropiastra sono sterili come previsto, e devono essere rimossi solo dalla confezione in un ambiente sterile come un armadio a flusso laminare biosicurezza. La sterilità deve essere mantenuta durante il protocollo. Sterilità dovrebbe essere compromessa, i pozzetti vengono risterilizzati utilizzando 70% di etanolo in acqua usando l'seguendo passaggi facoltativi.
   1. Aggiungere 0,5 ml di etanolo al 70% in ciascun pozzetto inutilizzato. Alcuni pozzetti può intrappolare bolle d'aria, anche se questo può essere ridotta aggiungendo liquido su un lato, e permettendo di diffondersi attraverso la superficie, anziché cadere verticalmente sulla superficie. Rimettere il coperchio.
   2. Mentre vapore etanolo dovrebbe permeare rapidamente eventuali bolle, se ci sono grandi numeri può essere desiderabile per rimuoverli. Centrifugare per 2 minuti a 2000 x g. Si noti che è importante assicurare il rotore sia correttamente bilanciata a questa velocità.
   3. Utilizzando un basso ingrandimento microscopio invertito, verificare le bolle sono stati rimossi dai pozzetti.
   4. Incubare per 5 min con il coperchio a temperatura ambiente.
   5. Aspirare etanolo. Piastra può essere lavato con acqua sterile o PBS per l'uso immediato, o aria essiccata per la conservazione.
2. Al fine di garantire che le cellule non interagiscono con la superficie dei pozzetti, può essere preparato usando un tensioattivo. In generale èconsiglia di eseguire questo passaggio inizialmente, e successivamente confrontare sferoidi generati con e senza tensioattivi pozzetti rivestite.
   1. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di risciacquo ad ogni pozzetto. Alcuni pozzetti può intrappolare bolle d'aria, anche se questo può essere ridotta aggiungendo liquido su un lato, e permettendo di diffondersi attraverso la superficie, anziché cadere verticalmente sulla superficie. Rimettere il coperchio.
   2. Centrifugare per 2 min a 2000 xg per rimuovere le bolle. Si noti che è importante assicurare il rotore sia correttamente bilanciata a questa velocità.
   3. Utilizzando un basso ingrandimento microscopio invertito, verificare le bolle sono stati rimossi dai pozzetti.
   4. Incubare per almeno trenta minuti con il coperchio a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C. Piastre possono essere conservate a quattro gradi con la soluzione di tensioattivo nei pozzetti fino a quando necessario se adeguatamente sigillato per prevenire l'essiccazione.
   5. Lavare la piastra con acqua sterile o PBS immediatamente prima dell'uso. Non lasciare le piastread asciugare dopo il rivestimento.

2. Preparazione di cellule

NOTA: I dettagli della preparazione cellulare variano un po 'con il tipo cellulare specifico oggetto di studio. Tuttavia abbiamo osservato queste condizioni per essere efficace con una vasta gamma di cellule, comprese le linee qui discussi, così come le cellule staminali embrionali umane e murine (ESC), le cellule staminali umane pluripotenti indotte (IPSC), fibroblasti, putativo endoderma primitivo, e le cellule stromali. Altri gruppi hanno impiegato con successo questo sistema per una vasta gamma di applicazioni, tra condrogenesi da cellule staminali mesenchimali ^9, generazione standardizzata dei precursori neurali da cellule staminali pluripotenti ^10, analisi tossicologiche in epatociti ¹¹ e valutazione della rigenerazione del midollo spinale in salamandre ^12. Il protocollo specifico per lavorare con le cellule HT29 è mostrato qui.

1. Iniziare con un pallone T75 di cellule HT29, coltivate in DMEM+ 10% FBS
2. Aspirare il terreno di crescita dal pallone, e aggiungere 3 ml di tripsina.
3. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C.
4. Smettere di tripsina digestione con l'aggiunta di 3 ml di terreno di coltura. Prelevare un'aliquota per la conta cellulare e trasferire il resto in una provetta da centrifuga da 15 ml.
5. Centrifugare per 5 min a 200 x g.
6. Mentre la centrifugazione è in corso, contare le celle.
7. Aspirare tripsina / medio impasto e sostituirlo con terreno di coltura fresco, volume determinato dalla densità cellulare richiesto calcolato sopra.
8. (OPTIONAL) Passare la sospensione cellulare attraverso un colino per eliminare eventuali grumi. NOTA: condizioni di raccolta delle cellule variano un po 'tra le righe. Se un protocollo di dissociazione per es passaging le cellule di interesse è disponibile, che deve essere utilizzato come punto di partenza. Con linee cellulari sensibili uso di tripsina può portare alla morte delle cellule eccessivo. In questi casi abbiamo osservato buoni risultati utilizzando TrypLE come dissociati alternativail reagente ^8. Se le cellule diventano clumped durante dissociazione e perdono vitalità, aggiunta di DNAsi alla soluzione enzima può risolvere questo. Ridurre i tempi di dissociazione e impiegando una fase di triturazione per rompere grumi di cellule può anche aumentare la redditività.

3. Formazione Spheroid

NOTA: Spheroids possono essere generati in una varietà di formulazioni medie, studi tuttavia iniziali devono essere effettuate utilizzando il mezzo in cui le cellule sono state coltivate, per distinguere conseguenze di transizione a un sistema di coltura 3-dimensionale dalle conseguenze di vestiario composizione media.

1. Aggiungere 0,4 ml di terreno di coltura in ciascun pozzetto.
2. Centrifugare per 2 min a 2000 xg per rimuovere le bolle. Si noti che è importante assicurare il rotore sia correttamente bilanciata a questa velocità prima della centrifugazione.
3. Utilizzando un basso ingrandimento microscopio invertito, verificare le bolle sono stati rimossi dai pozzetti.
4. Aggiungere 0,4 mlsospensione cellulare alla densità richiesta (calcolata sopra). Mescolare delicatamente pipettando su e giù, senza introdurre bolle d'aria nei pozzetti. È importante garantire che le cellule sono distribuiti uniformemente in tutto il pozzetto, per ottenere sferoidi coerenti.
5. Centrifugare per 5 min a 200 x g. Se la piastra non a livello di sé durante la centrifugazione, correnti di convezione possono sorgere quel risultato in distribuzione irregolare delle cellule di tutti i pozzetti. Pertanto, la piastra deve essere bilanciato internamente che contro l'altra piastra, in modo che il peso sia distribuito uniformemente su entrambi i lati della piastra portante.

NOTA: Se la prova della distribuzione delle cellule irregolare è visto, può essere necessario applicare una piccola quantità di lubrificante ai punti di articolazione sul carrier plate - consultarsi con il produttore centrifuga per le istruzioni.

NOTA: Una volta che le cellule sono state centrifugate nei pozzetti, sono ragionevolmente resistenzatante di dilavamento da movimenti minori della piastra. Movimenti bruschi che provocano sbattimento del mezzo dovrebbero essere evitati, ma il trasferimento della targa dal centrifuga al microscopio o incubatore non dovrebbero comportare lo spostamento delle cellule significativo.

6. Utilizzando un microscopio invertito, verificare che le cellule hanno cluster all'interno dei pozzetti, e che sono distribuiti uniformemente in tutto il bene.
7. Incubare una notte a 37 ° C.
8. Utilizzando un microscopio invertito, osservare il processo di formazione sferoide. Alcune linee di cellule formeranno sferoidi compatti entro 24 ore, altri possono richiedere più tempo. La progressione da cluster per aggregare in cellule HT29 è mostrato in Figura 2.
9. Recuperare sferoidi dai pozzetti e trasferire alla cultura sospensione da parte loro getto delicatamente con una pipetta. In alternativa, mantenere sferoidi in situ con medio sostituzione ⁸ - la durata dipende dalla loro dimensione iniziale e il tasso di crescita, che define il tempo fino a quando non diventano troppo i pozzetti in cui sono stati formati.
   1. Per sostituire medio senza perdere sferoidi, medio aspirare al bordo del pozzetto con una pipetta Pasteur. Lentamente portare la punta verso il basso fino a quando non comincia a disegnare liquido dal menisco, e seguire il menisco giù come il prezzo scende. Poi aggiungere mezzo fresco contro il muro ben nello stesso luogo. Qualche sferoidi possono essere persi, se medium è sempre aspirato e sostituito nella stessa posizione, questo numero rimarrà piccolo in confronto ai grandi numeri nel pozzo.

Risultati

Sferoidi da più linee tumorali di origine anatomiche differenti possono essere facilmente generati e estratti in coltura in sospensione. Figura 3 illustra il controllo di dimensione coerente ottenibile mediante questo metodo, con popolazioni sferoidali altamente uniformi in ciascuna condizione. Evidenti differenze tra linea nel comportamento sono anche visibili, con le cellule tumorali del colon HT29 e le cellule di cancro esofageo TE6 formano sferoidi densamente con confini ben definiti, mentre le cellule tumorali della prostata LNCaP hanno dato luogo a sferoidi meno coerenti con confini irregolari (vedi la discussione per motivi possibili ). Le forze interne più forti degli aggregati più coerenti anche comportato il collasso ad una forma più simmetrica, anche mentre ancora nei pozzetti in cui sono stati formati, mentre gli aggregati LNCaP, in particolare nella dimensione più grande, visibilmente mantengono la geometria quadrato-piramidale della micropozzetti. Il rapporto tra il numero di cellule di ingresso e dei Phys dimensione ical dello sferoide risultante dipenderà da un numero di variabili. Volumi teorici basati sul prodotto del volume per cella e il numero di cellule impiegate possono essere ridotti perdita di cellule, che a sua volta può includere perdita di cellule durante la fase di cella singola sospensione, così come la perdita da eccessivamente piccoli aggregati causa numero insufficiente di vicini di casa, e da troppo grandi aggregati dovuti al trasporto limitazioni e necrosi nel nucleo. Dimensione sarà anche influenzato da qualsiasi proliferazione che possono verificarsi durante il processo di aggregazione. Poiché questi parametri variano da linea cellulare di linea cellulare, se si desiderano sferoidi di specifiche dimensioni fisiche del numero corretto di cellule per introdurre deve essere determinato sperimentalmente. In prima approssimazione, diametro sferoide dovrebbe aumentare con la radice cubo del numero di cellule incorporati - ad esempio un aumento di 8 volte in numero di celle deve comportare un raddoppio del diametro sferoide.

_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figura 1. Schema di produzione sferoide. Micropozzetti Il sistema è costituito da una matrice di micropozzetti quadrati-piramidale, serrato (625 per cm ² per il 400 μ m dimensione), in cui le cellule possono essere centrifugati. Le cellule sono riuniti da pareti laterali inclinate, e le dimensioni dello sferoide risultante è controllata variando la densità della sospensione cellulare impiegata.

50665fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg "/>
Figura 2. Assemblaggio di celle raggruppate in sferoidi. Spheroids sono formate da settecento HT29 cellule ciascuno. Subito dopo centrifugazione (A), le cellule sono liberamente raggruppati nel fondo di ciascun pozzetto. Si noti che i cluster sono uniformemente assorbiti verso il basso a destra in questo caso. Questo è accettabile a condizione dimensioni dei cluster rimangono coerenti attraverso l'array. Se differenze di dimensioni di cluster significativi sono visti da un lato della matrice all'altro, vedi nota nel passaggio 3.5. Dopo incubazione per 24 ore (B), le forze adesive intercellulari hanno causato i cluster di aggregare e formare sferoidi coerenti, che possono poi essere estratti (C).

r /> Figura 3. Sferoidi generati in micropiastra. Spheroids sono formate da settecento (A, C, E) o millecinquecento (B, D, F), le cellule tumorali del colon HT29 (A, B), le cellule tumorali della prostata LNCaP (C, D) o cellule di cancro esofageo TE6 (E, F). Notare la coerenza di sferoidi entro un preparato, e anche la variazione tra linee cellulari - in particolare gli aggregati LNCaP sciolti, rispetto al HT29 più densamente e cellule TE6. Barra della scala rappresenta 200 micron.

	Formato Microwell
	AggreWell 400	AggreWell 40EX	AggreWell 800
Larghezza Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm )	400	400	800
Micropozzetti per cm 2	625	625	156.25
Micropozzetti per bene	1.200	4.700	300
Cellule minimi per micropozzetti *	N / A	N / A	2000
Cellule massime per micropozzetti *	2000	2000	10.000
Cellule minimi per bene *	N / A	N / A	6 x 10 5
Cellule massime per bene *	2,4 x 10 6	9.4 x 10 6	3 x 10 6
1.1.1 - il 70% del volume di etanolo (ml)	0.5	2.0	0.5
1.2.1 - Risciacquo volume della soluzione (ml)	0.5	2.0	0.5
3.2 - Volume medio precarico (ml)	0.4	1.6	0.4
3.5 - volume di cella di carico (ml)	0.4	1.6	0.4
* Numero di cellule per micropozzetti sono solo una approssimazione in quanto questo valore varia a seconda della dimensione delle cellule specifiche utilizzate, e deve essere determinata empiricamente

Tabella 1. AggreWell opzioni e modifiche del protocollo.

Discussione

Abbiamo stabilito un sistema in cui un gran numero di sferoidi uniformi possono essere generati da molteplici linee cellulari provenienti da fonti diverse. Dobbiamo ancora incontrare una linea di cellule aderenti, che non costituisce sferoidi in queste condizioni. Abbiamo già osservato perdita di cellule in popolazioni soggette a anoikis ^5,8, ma ad oggi il problema non è sorto con le linee tumorali. Il sistema è arbitrariamente scalabile con la superficie, con un comportamento coerente in tutti i pozzetti a 24 pozzetti e il formato 6-bene, così come bioreattori prototipi contenenti 50.000 pozzetti ciascuna attualmente in fase di sviluppo.

Dovrebbe sferoide asimmetria essere una preoccupazione, il tempo di incubazione nella fase 4.8 può essere aumentata a due o tre giorni. Sferoidi possono essere incubate per un periodo dopo l'estrazione dai micropozzetti per aumentare simmetria, tuttavia in questo caso deve essere presa cura di mantenere sufficientemente bassa densità di coltura, come sferoidi in contatto tra loro will spesso fondersi in strutture più grandi. Per questo motivo, abbiamo precedentemente mantenuto culture dei pozzetti in cui sono formati gli aggregati, con la limitazione principale è la dimensione dello sferoide. Questo a sua volta è funzione sia del tasso di crescita e dimensione iniziale ^8, e se è prevista cultura estesa all'interno della micropiastra, questo dovrebbe essere considerato in anticipo. Opzioni per prevenire la crescita eccessiva, se dovesse verificarsi, comprendono o che iniziano con sferoidi più piccoli, o che utilizzano le più grandi pozzetti della piastra AggreWell 800.

In caso di sferoidi riuscire ad aumentare in modo coerente nel corso del tempo, una possibile causa potrebbe essere la morte delle cellule. Soprattutto in grandi aggregati di cellule altamente metabolicamente attive, limitazioni di trasporto di massa sulla fornitura di ossigeno e nutrienti essenziali può produrre un core necrotico ² - quindi uno sferoide non coesivo può semplicemente essere una conseguenza di morte cellulare eccessivo. In alternativa, le misurazioni della coesione meccanicasione di sferoidi sono stati utilizzati per valutare forze di legame intercellulari, in rapporto al potenziale metastatico di una determinata linea cellulare ^13. Sarebbe interessante indagare il rapporto tra forma sferoidale e il potenziale metastatico, magari utilizzando parametri morfometrici come la rotondità e il perimetro di rapporto tra le aree.

Oltre a istruire le proprietà meccaniche e morfometrici di sferoidi, il montaggio del sistema micropozzetti permette produzione su larga scala di sferoidi mista composizione, costituito da combinazioni di tipi di cellule e / o biomateriali ^6,7. Le interazioni delle cellule tumorali con altri tipi di cellule sono importanti per modellare più da vicino il comportamento dei tumori in vivo ^14, in tal modo può essere di interesse per generare sferoidi da cellule tumorali in combinazione con fibroblasti e cellule endoteliali, per esempio. Microparticelle di vari biomateriali possono anche essere incorporati, e possono influenzare SPHproprietà eroid sia direttamente attraverso la loro interazione con le cellule ^7,15, e anche come serbatoi per il rilascio controllato di fattori di crescita e citochine nell'interno dello sferoide ^16.

Se non vi è alcuna preoccupazione per sterilità, ad esempio quando si lavora con una micropiastra in cui sono stati precedentemente utilizzati alcuni pozzi, che possono aver trascorso qualche tempo in un incubatore come parte di un precedente esperimento, i pozzetti possono essere risterilizzati con etanolo al 70% in acqua.

Una volta che sono state formate sferoidi, possono anche essere separato dalle cellule non costituite residue passando il sospeso su un colino cellula. Le singole celle passeranno attraverso, mentre verranno mantenuti i sferoidi. Se lo sferoide è sospettato di spargimento cellule metastatiche potenzialmente nel corso della coltura, può essere desiderabile eseguire questa operazione più volte - inizialmente per rimuovere le cellule non registrate, e successivamente per isolare purified popolazioni delle cellule ceduto dai sferoidi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AggreWell 400 plate	StemCell Technologies Inc.	27845/27945
Rinsing Solution	StemCell Technologies Inc.	07010
Cell strainer (37 µm)	StemCell Technologies Inc.	27215
PBS	VWR / LONZA	CA12001-676
Trypsin-Versene (EDTA)	VWR / LONZA	CA12001-660
DMEM	VWR / LONZA	CA12002-212
FBS	VWR / LONZA	CA-95042-112
TrypLE	Invitrogen / Life Technologies	12605010
Inverted microscope	VWR / Motic	CA19000-610
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates	VWR / Beckman	CABKA99465, CABK369704, CABK392806
Laminar flow biosafety cabinet	ESBE / Baker	BKR-SG603AHEUVSP