Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Riepilogo

Una tecnica per il trapianto "Extreme anteriore dominio" dei tessuti del viso tra Xenopus laevis embrioni è stato sviluppato. Tessuto può essere spostato da un gene espressione sfondo in un'altra, permettendo lo studio delle esigenze locali di sviluppo craniofacciale e di segnalazione interazioni tra regioni facciali.

Abstract

Malformazioni congenite craniofacciali si verificano in 1 su ogni 700 nati vivi, ma l'eziologia è raramente noto a causa della limitata comprensione dello sviluppo cranio-facciale. Per identificare dove percorsi e tessuti segnalazione agiscono durante patterning del viso sviluppo, una tecnica 'trapianto di faccia' è stato sviluppato in embrioni di rana Xenopus laevis. Una regione di presuntiva tessuto facciale (il "Extreme anteriore Domain" (EAD)) viene rimosso da un embrione donatore in fase tailbud, e trapiantato in un embrione ospite della stessa fase, di cui la regione equivalente è stato rimosso. Questo può essere usato per generare una faccia chimerico in cui il tessuto ospite o donatore ha una perdita o guadagno di funzione in un gene, e / o include un'etichetta lignaggio. Dopo la guarigione, il risultato dello sviluppo è monitorato, e indica ruoli della via di segnalazione all'interno del donatore o circostanti tessuti dell'ospite. Xenopus è un modello valido per lo sviluppo viso, come la regione facciale è grande e facilmente unaccessible per micromanipolazione. Molti embrioni possono essere analizzati, nel corso di un breve periodo di tempo dal momento che lo sviluppo avviene rapidamente. I risultati nella rana sono rilevanti per lo sviluppo umano, dal momento che i processi cranio-facciali appaiono conservati tra Xenopus e mammiferi.

Introduzione

Per comprendere i meccanismi alla base difetti cranio-facciali congenite ^1-2, tessuti importanti e il loro contributo di segnalazione durante lo sviluppo craniofacciale deve essere identificato. Nella rana Xenopus laevis, parte del viso, compresa la bocca e la forma narici dal "Extreme anteriore Domain" (EAD), dove ectoderma e l'endoderma sono direttamente giustapposti ^3-4. L'EAD funge anche da centro di segnalazione di influenzare i tessuti circostanti, tra cui la cresta neurale cranica, che forma le mascelle e altre regioni facciali ^5. Per identificare i geni che contribuiscono alla funzione EAD, una tecnica di 'trapianto di faccia' è stato sviluppato, in cui il tessuto viene trapiantato da un donatore in un embrione di accoglienza, dopo aver rimosso la regione ospitante corrispondente. Seguendo il trapianto, con conseguente sviluppo facciale viene valutata. Pertanto, gli effetti della perdita di funzione (OL) o guadagno di funzione (GOF) per un gene specifico nell'EAD sono analizzati localmente, dove il resto della head e il corpo è composto di tipo selvatico tessuto. Il trapianto di reciprocità può essere effettuato, se di tipo selvatico tessuto viene trapiantato in embrioni con LOF globale o GOF in geni specifici. Il trapianto è stato frequentemente utilizzato in Xenopus e pulcino studi ^6. Ad esempio, Xenopus trapianto ha affrontato induzione homogenetic neurale, obiettivo e competenza neurale, e neural crest migrazione ^7-10. Quaglia-chick innesto chimerico ha analizzato lo sviluppo della piastra anteriore neurale, anteriore cresta neurale, cresta neurale, e le ossa craniche ^11-14. Questa è la prima tecnica di trapianto per lo studio dello sviluppo craniofacciale in Xenopus. Questa tecnica ha dimostrato un nuovo ruolo per gli inibitori di Wnt Frzb1 e della Mezzaluna nella regolazione della formazione di membrana basale in bocca presuntiva ^5. Xenopus laevis è un modello ideale per lo studio dello sviluppo cranio-facciale come embrioni sono grandi, sviluppare esternamente, unnd il volto è facilmente visibile, permettendo micromanipolazione e di imaging di sviluppo. Meccanismi sottostanti lo sviluppo del viso appaiono conservati, indicando che accertamenti effettuati nella rana forniscono informazioni in sviluppo umano ^4,15-16.

Protocollo

1. Reagenti Preparazione

1. 10x MBS: Preparare 1 L di 10x modificata di Barth Saline (MBS) soluzione ^17. Fare riferimento alla Tabella 1, reagenti, gli ingredienti e le istruzioni. Utilizzare acqua distillata per tutte le soluzioni. Mescolare in un bicchiere, con un ancoretta, fino al completo scioglimento. Tutte le soluzioni devono essere effettuate a temperatura ambiente.
2. 1x MBS: Diluire 100 ml di soluzione 10x MBS in 900 ml di acqua distillata per fare 1 l di 1x MBS. Aggiungere 0,7 ml di 1 M CaCl ₂ soluzione.
3. 0.1x MBS: diluire 1x MBS per preparare 1 L di soluzione 0,5 x MBS e 2 L di 0.1x soluzione MBS. Per 1 L di 0.1x soluzione MBS, aggiungere 1 ml di 10 mg / ml soluzione gentamicina. La soluzione MBS 0.1x con gentamicina sarà utilizzato per coltura degli embrioni a lungo termine.
4. Ficoll / MBS: Aggiungi 15 grammi di Ficoll 400-500 ml di soluzione 0,5 x MBS. Mescolare energicamente. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare fino Ficoll è completamente dissolto (diverse ore).
5. 70% di etanolo: Diluire 100% di etanolo al 70% di etanolo utilizzandoacqua distillata.

2. Preparazione Glass strumenti operativi

1. Preparazione Needle: Caricare tubi capillari in un estrattore ago.
   1. Estrarre gli aghi base alle impostazioni indicate nella Tabella 2: Impostazioni estrattore ago. Le impostazioni sono per una micropipetta estrattore Sutter Instrument Co. Modello P-80/PC e tubi capillari, come descritto nella Tabella di reagenti e attrezzature specifiche. Tuttavia, queste impostazioni sono specifiche per l'ago estrattore Sutter, e dovranno essere regolata per altre macchine. Le impostazioni possono essere determinate utilizzando un test di rampa, come specificato dal costruttore della macchina.
   2. Tirare 4-6 aghi in preparazione per la procedura. Gli aghi devono essere ripartiti in modo tale che la porzione a ciglia flessibile della punta di vetro viene completamente rimosso, che è tipicamente 2-3 mm di lunghezza. La punta deve essere relativamente rigido, ma ancora abbastanza stretto da essere usato come uno strumento di taglio. Una foto di un ago ideale nella Figura 1A.
   3. Conservare gli aghi in una capsula di Petri con una striscia di argilla verso il centro. Premere l'albero di ogni ago nella creta, per tenerlo in luogo e per mantenere la punta affilata fragile dal fondo e sui lati.
2. Per strumenti aggiuntivi, ottenere copertura scivola in vetro, un paio di lunghe pinze standard di modello, un becco Bunsen, e 3-4 pipette Pasteur in vetro (Size 5 ¾ in).
3. Strumento pipetta: Per effettuare una pipetta strumento, accendere il bruciatore Bunsen e posizionare la punta di una pipetta Pasteur di vetro nella parte blu della fiamma ruotandolo, in modo che la punta si scioglie e il foro completamente guarnizioni, formando una chiusa, estremità arrotondata . Il arrotondata, punta sigillata viene poi utilizzato per rendere depressioni nel piatto argilla che contiene gli embrioni durante l'operazione. Vedere la Figura 1B.
4. Ponti di vetro: Per effettuare ponti di vetro, utilizzare pinze modello lungo standard per rompere con cura 3 millimetri da 3 millimetri pezzi di vetro vetrino. Tenendo il pezzo di vetrino con tweezers, posizionare il vetro della fiamma fino a quando tutti e quattro i bordi ammorbidiscono e curva verso il basso, formando una piccola cupola di vetro. I bordi non dovrebbero più essere taglienti. Vedere la Figura 1C.
5. Conservare i ponti di slittamento copertura in vetro inserendoli, bordi verso il basso, in plastilina, allineando la parte inferiore di una piastra di Petri. Inserire i ponti tale che la parte superiore del ponte rimane sopra la superficie di argilla. Non spingere troppo tale che le interruzioni ponte, e non inserire completamente il ponte nella creta, perché può essere difficile da rimuovere. Dopo la sterilizzazione con una fiamma o etanolo al 70%, i ponti possono essere riutilizzati da esperimento sperimentare.

3. Preparazione per l'operazione Embryo

1. Foderare una piccola 60 millimetri di plastica piastra di Petri con il pongo. Tra gli usi, la superficie del disco e argilla viene accuratamente lavato con acqua distillata e poi con etanolo al 70%.
   NOTA: Usare rosso, bianco o giallo, Van Aken Plastalina plastilina, che può essere acquistato in un localey o negozio d'arte. Argilla nera non è raccomandato perché rilascia un residuo.
2. Riempire il piatto con il 3% soluzione di Ficoll 0.5x MBS. La concentrazione salina superiore impedisce dissociazione tessuto, e il Ficoll polisaccaride aiuta ad addensare la soluzione, che aiuta a tenere il viso in posizione.
3. Utilizzare lo strumento pipetta Pasteur fiammato (vedi Figura 1) per rendere poco profonde, 2-3 mm depressioni nella creta, sulla profondità di un corpo stadio embrionale 20. Rendere 20-30 depressioni, 1-2 mm di distanza, su ciascun lato del piatto, per cui vi è un totale di 40-60 depressioni. Etichettare un lato LOF / GOF, e l'altro lato wild type, incidendo le iniziali nella creta con una pinza.

4. Preoperatorio Embryo Preparazione

1. Ottenere e cultura Xenopus laevis embrioni utilizzando metodi standard ^17. Per una descrizione dettagliata della rana allevamento, consultare Sive et al ^17.
   1. Quarantotto ore prima della obta esperimentonelle uova di rana femminili ed effettuare la fecondazione in vitro.
   2. Iniettare 0,5-1 ng di membrana ricoperto GFP mRNA, più eventuali mRNA desiderato o anti-senso oligonucleotidi antisenso morpholino modificati ("Morpholinos") allo stadio di una cellula o in 2 cellule nella fase 2 cellule. La fase di una cellula dura circa 70-90 min. Iniettare un volume totale di 1-3 nl. Al posto di RNA codificanti per una proteina fluorescente (come GFP o RFP RNA), si può iniettare FITC morfolino etichettati o destrano fluorescente. La fluorescenza è importante per determinare se il tessuto guarisce trapiantato e rimane nella testa.
   3. Capped mRNA può essere preparato da un plasmide linearizzato utilizzando un SP6 mMessage mMachine o kit T7. Morpholinos possono essere progettati e ordinati attraverso Gene Strumenti LLC. La quantità di morfolino necessaria per un effetto desiderato deve essere determinato per ciascun gene ^18.
   4. Memorizzare gli embrioni iniettati a 15 ° C per 48 ore, fino a raggiungere 19-20 stadio. (Fin tutto o in fasi successive, embrioni stadio secondo la tabella Normale di Xenopus laevis da Nieuwkoop e Faber ^19.)
      NOTA: Il giorno della chirurgia, sia embrioni beneficiari e donatori devono essere all'interno di uno stadio di ogni altro per i trapianti di lavorare in modo ottimale. Tuttavia, gli embrioni iniettati con Morpholinos ("morphants") a volte si sviluppano più lentamente di tipo selvaggio o controllare embrioni morphant, rendendo necessario coordinare gli esperimenti in modo che entrambi morphant e tipo embrioni selvatici sono allo stesso stadio. Morphants potrebbero dover essere mantenuta ad una temperatura superiore per 12-24 h prima della procedura. Per aumentare la probabilità che gli embrioni possono essere trovati in fasi corrispondenti, embrioni possono essere mantenuti a temperature diverse. Ventiquattro ore prima dell'esperimento, si dovrebbe dividere gli embrioni in un diversi piatti, e posto morphants a 18-20 ° C e il tipo di embrioni selvatici a 15-18 ° C.
2. Il giorno dell'esperimento trapianto, remOve gli embrioni da the15 ° C incubatore e lo stadio li secondo Nieuwkoop e Faber ^19. Se sono più giovani di ritardo neurula (fase 19), lasciarli a temperatura ambiente per 1-2 ore, fino a raggiungere la fase 19.
3. Schermo gli embrioni iniettati sotto un microscopio a fluorescenza. Selezionare embrioni che mostrano uniforme, fluorescenza per l'esperimento.
4. Rimuovere il disordine e possibili contaminanti vicino alla zona operativa. Pulire la superficie operativa, stereomicroscopio e tutti gli strumenti con il 70% di etanolo.
5. Una volta che gli embrioni sono in fase di 19, rimuovere la membrana vitellina usando # 5/45 pinza Dumont sotto uno stereomicroscopio.
   1. Rimuovere la membrana vitellina di 20-30 di ciascuna di donatore e embrioni ospitante.
   2. Per i primi esperimenti di trapianto di faccia, si dovrebbe praticare con pochi embrioni per ogni condizione. Il metodo è impegnativo e richiede una attenta pratica prima di poter essere usato su larga scala, rapidamente e con successo. Si può lavorare up a fare 20 trapianti / esperimento.
6. Spostare embrioni ospitanti nel piatto operativo utilizzando una plastica graduato pipetta con la punta tagliata in modo tale che l'apertura è molto più ampio di un embrione (almeno alcuni millimetri). Fare attenzione a non toccare gli embrioni di bolle o la superficie dell'acqua, come embrioni esploderà nella tensione superficiale.
7. Utilizzare # 5/45 pinze per inserire gli embrioni nelle depressioni argilla, con il posteriore dell'embrione in argilla. Chiudere delicatamente l'argilla intorno alle basi dell'embrione utilizzando le pinze, lasciando il quarto superiore dell'embrione, la testa, sporgente dalla depressione.
8. Una volta che tutti gli embrioni host vengono fissati nelle loro depressioni, muoversi verso l'altro lato della piastra e cominciare a inserire gli embrioni donatori nelle loro depressioni. Ripetere il processo di protezione degli embrioni nei loro pozzi.

5. Esecuzione del viso Chirurgia dei trapianti

1. Lama di taglio: Come una lama di taglio per la rimozionedi EAD tessuto del donatore, utilizzare un ago capillare di vetro opportunamente rotto (vedi punto 2.3 e Figura 1).
   NOTA: Si può detenere direttamente il capillare tra le dita (questo funziona bene per le persone con mani piccole) o si può montare l'ago in un supporto del perno insetto. Electrosharpened aghi di tungsteno ¹⁷ caricati in un supporto del perno possono essere utilizzati al posto di un ago capillare. Si prega di consultare i titolari pin proposte e gli aghi di tungsteno nella tabella dei reagenti specifici e attrezzature.
2. Allo stereomicroscopio, inserire l'ago nella testa dell'embrione a fianco della ghiandola cemento. L'ago deve essere inserito in profondità, in modo che passi dall'esterno l'embrione, attraverso la testa, e nel foregut. Trapiantare tutta EAD, tagli dovrebbero estendersi dall'esterno dell'embrione al foregut. Per i trapianti solo ectoderma-, tagli dovrebbero essere meno profondo ed estendere solo attraverso l'ectoderma.
   1. Flick l'ago dalla sinistra alla destra deltesta, per tutta la larghezza della ghiandola cemento. Il rapido passaggio è importante come il moto dà un taglio netto. Fare riferimento alla Figura 2A per una sintesi della tecnica e la Figura 2B per una dimostrazione dei tagli. La ghiandola del cemento e gli occhi sono punti di riferimento importanti per i tagli. L'ordine dei tagli non influenza il risultato e può variare a seconda della preferenza dell'utente o manualità.
3. Posizionare l'ago all'inizio del taglio precedente, al bordo sinistro della ghiandola cemento, e aspirare l'ago verso l'alto fino a raggiungere il fondo dell'occhio sinistro. Questo creerà un taglio verticale dal bordo sinistro della ghiandola cemento al fondo dell'occhio sinistro.
4. Posizionare l'ago sul bordo destro della ghiandola cemento, e sfogliare l'ago verso l'alto fino a raggiungere la parte inferiore dell'occhio destro. Questo creerà un taglio verticale dal bordo destro della ghiandola cemento sul fondo dell'occhio destro.
5. Per asportare completamente il tessuto, flick l'ago dal fondo dell'occhio sinistro sul fondo dell'occhio destro, creando un taglio orizzontale che libererà il tessuto. Tagli possono estendersi dall'esterno dell'embrione al foregut, comprendente sia ectoderma e endoderma nel espianto EAD. In alternativa, i tagli superficiali possono essere utilizzati per ectoderm sola trapianti EAD. Una volta che il tessuto EAD viene rimosso, ci dovrebbe essere un foro rettangolare da fuori dell'embrione al foregut, che si estende dalla ghiandola cemento appena sotto gli occhi (dall'alto in basso). Il foro dovrebbe estendersi dal confine interno dell'occhio sinistro al bordo interno dell'occhio destro (lato a lato). Vedere la Figura 2Bb.
6. Spingere delicatamente il tessuto asportato sulla punta dell'ago, e sollevarla attraverso il buffer per la parte del piatto contenente embrioni ospitante. Non esporre il tessuto all'aria superficie o diventerà danneggiato.
7. Asportare lo stesso tessuto dall'embrione ospitante, come per il donatore. Eliminare l'espianto EAD host o salvarlo inserit in faccia donatore, per il trapianto reciproci.
8. Inserire l'espianto del donatore nel foro ospitante risultante utilizzando # 5/45 pinze.
9. Una volta che il tessuto donatore sia posizionato correttamente e completamente inserito, posizionare accuratamente un ponte di vetro (vedi Figura 1 e Figura 2BC) sulla faccia dell'embrione di tenere il trapianto in posto. Le estremità del ponte devono inserire nella creta, tenendolo in posizione. Il ponte dovrebbe comprimendo leggermente il tessuto trapiantato, tale che il trapianto si trova a filo con la testa ospitante, senza che sporge dalla testa o sdraiata profondità all'interno della testa. La testa può essere leggermente appiattita dalla polizza di copertura, ma fate attenzione a non danneggiare l'embrione con troppa pressione. Trapianti devono essere effettuate entro 5 minuti.
   NOTA: Un investigatore esperto può eseguire una ventina di trapianti per esperimento, oltre 2-3 ore. Durante questo periodo gli embrioni saranno progredire dalla fase 20-22. Completamento del trapianto di faccias allo stadio 21 o 22 non influisce risultati. Trapianti più tardi (fasi 22-26) può essere fatto, ma sono più difficili come EAD regione mediana priva di cresta si restringe come cranici cresta neurale si porta in faccia. La coerenza di tutti i trapianti è critica.

6. Trapianto di faccia Post-Operazione di recupero

1. La guarigione richiede in genere 2-3 ore. Lasciare gli embrioni a temperatura ambiente indisturbati nelle loro depressioni argilla con i ponti di vetro tenendo il tessuto del donatore a posto.
2. Una volta che i trapianti sono guarite, rimuovere con attenzione i ponti di vetro, rimuovere l'argilla intorno alla base degli embrioni usando pinze, e utilizzare una plastica laureato pipetta per aspirare delicatamente gli embrioni di loro depressioni.
3. Mettere gli embrioni in una capsula di Petri adeguatamente etichettati, a metà pieno di MBS 0.1x pulite con gentamicina.
4. Far crescere gli embrioni a 15 ° C o 18 ° C per diversi giorni fino a quando non raggiungono l'alimentazione stadio di girino in fase 40, wgallina fenotipi facciali possono essere segnati.
   1. La soluzione MBS 0.1x con gentamicina deve essere cambiata ogni giorno, e gli embrioni morti deve essere rimossa prontamente per evitare contaminazione e morte di altri embrioni.
   2. La bocca si apre allo stadio 40. Nella fase 40-41, si deve verificare che il tessuto trapiantato rimane guarito in luogo visualizzando sua fluorescenza. Trapianti di tanto in tanto cadono, per cui bisogna garantire che tutti gli embrioni ottenuti sono il tessuto del donatore a posto.

Risultati

Tessuto trapiantato deve essere completamente inserita nella testa ospitante dopo il trapianto, come mostrato nella Figura 3A, e hanno un ponte di vetro opportunamente posizionato sulla faccia dell'embrione, come mostrato nella Figura 2BC. Il tessuto donatore trapiantato deve essere dimensionato correttamente per l'apertura ospitante, per il trapianto abbia successo. Il tessuto EAD non deve sporgere dalla testa, in qualsiasi modo, come si vede nelle figure 3B e ...

Discussione

Fasi critiche e limitazioni: La procedura di trapianto di faccia EAD è il tempo e il lavoro intenso. Si richiede pratica, mano ferma, e la destrezza di perfezionare. Il protocollo di trapianto di faccia si basa sulla capacità del ricercatore di rimuovere in modo efficiente e il tessuto di trapianto. Se si prende troppo tempo per inserire il trapianto nel volto del padrone di casa, il volto ospite inizierà a contrarsi e guarire. Pinze possono essere utilizzati per espandere delicatamente la regione facciale. Tu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340