Durata del pasto come misura delle risposte nocicettive orofacciali nei roditori

Riepilogo

Un allungamento della durata del pasto rappresenta il comportamento nocicettivo orofacciale nei roditori simile al comportamento di guardia degli esseri umani con dolore orofacciale. Mangiare è un comportamento che non richiede alcun allenamento o manipolazione animale, richiede partecipazione corticale e non è in competizione con altri comportamenti indotti sperimentalmente, distinguendo questo saggio da misurazioni alternative riflesse o operanti.

Abstract

Un allungamento della durata del pasto può essere utilizzato per misurare un aumento dell'iperalgesia meccanica orofacciale con somiglianze con il comportamento di guardia degli esseri umani con dolore orofacciale. Per misurare la durata dei pasti, i ratti sfrenati vengono continuamente tenuti in moduli di alimentazione computerizzati attenuati dal suono per giorni o settimane per registrare il comportamento di alimentazione. Queste camere attenuanti dal suono sono dotate di distributori di pellet di chow. Il distributore ha un trogolo a pellet con un fotobombe posto nella parte inferiore del trogolo e quando un roditore rimuove un pellet dall'alimentatore attraverso questo fascio non è più bloccato, segnalando al computer di far cadere un altro pellet. Il computer registra la data e l'ora in cui i pellet sono stati prelevati dal trogolo e da questi dati lo sperimentatore può calcolare i parametri del pasto. Nel calcolo dei parametri delle farine è stato definito un pasto in base al lavoro precedente ed è stato fissato a 10 minuti (in altre parole quando l'animale non mangia per 10 minuti che sarebbe la fine del pasto dell'animale) anche la dimensione minima del pasto è stata fissata a 3 pellet. La durata del pasto, il numero di pasti, l'assunzione di cibo, le dimensioni del pasto e l'intervallo tra i pasti possono quindi essere calcolati dal software per qualsiasi periodo di tempo che l'operatore desidera. Tra i parametri di alimentazione che possono essere calcolati, la durata del pasto si è dimostrata un marcatore biologico continuo non invasivo della nocicezione orofacciale nei ratti maschi, nei topi e nei ratti femmine. Le misurazioni della durata dei pasti sono quantitative, non richiedono formazione o manipolazione animale, richiedono partecipazione corticale e non competono con altri comportamenti indotti sperimentalmente. Questi fattori distinguono questo saggio da altri metodi operanti o riflessi per la registrazione della nocicezione orofacciale.

Introduzione

I modelli animali sono stati utilizzati per studiare il dolore e la nocicezione associati a danni orofacciale e^{o infiammazione 1,2}, ma la mancanza di modelli animali appropriati si traduce in una comprensione incompleta dei meccanismi. Sebbene i modelli attuali ci aiutino a comprendere vari meccanismi coinvolti nel dolore orofacciale acuto e cronico, ci sono punti di forza e di debolezza in questi modelli animali.

Molti modelli misurano le risposte nocicettive comportamentali per brevi durate. La toelettatura del viso è una risposta comportamentale nota dopo la costrizione dei nervi^{facciali 3}. Altri studi hanno misurato lo sfregamento facciale con la fronte ipsilaterale o la parte posteriore, nonché, il flinching della testa dopo aver somministrato iniezioni di formalina nell'articolazione temporomandibolare (TMJ) o^{nel labbro 4-7}. Le latenze di astinenza della testa sono un altro modello per misurare il comportamento nocicettivo in cui un misuratore di analgesia del colpo di coda modificato viene utilizzato per quantificare la risposta nocicettiva (cioè il ritiro della testa) dopo aver applicato calore al tampone di vibrisse rasato di un^{ratto 8}. L'attività muscolare digastrica e masseter è stata anche registrata come correlata del dolore dopo le iniezioni di glutammato nel TMJ⁹. Un altro studio ha misurato i cambiamenti nei parametri del sonno per valutare le risposte nocicettive nei ratti maschi e femmine con un TMJ infiammato, questi parametri includevano latenza del sonno, movimento rapido degli occhi (REM), percentuale di sonno non REM e percentuale di sonno REM¹⁰. La maggior parte dei modelli animali che misurano le risposte nocicettive comportamentali utilizzano un breve lasso di tempo, cioè da minuti a ore al giorno^11-14. Inoltre, la maggior parte dei test sui modelli animali avviene durante la fase di luce e in un animale notturno, come un topo, questo può causare stress che può confondere i risultati nocicettivi^15-18. I suddetti saggi misurano la risposta nocicettiva in diverse condizioni orofacciali, ma per brevi periodi e quindi possono essere utilizzati solo per studiare disturbi acuti. Un saggio alternativo ha usato l'espressione facciale come misura della nocicezione di durata moderata, ma questa metodologia può essere soggettiva¹⁹.

Per valutare la nocicezione orofacciale persistente o cronica alcuni hanno utilizzato l'applicazione di un filamento di von Frey sulla superficie della pelle per valutare la sensibilità meccanica degli animali sottoposti a costrizione nervosa o infiammazione TMJ^3,20. 2009 ha misurato le risposte di astinenza utilizzando monofilamenti graduati a seguito di iniezioni di CFA nel muscolo masseter dei ratti ^21,22. Yamazaki et al. Sfortunatamente, questi saggi comportamentali nocicettivi coinvolgono la moderazione animale, che produce ormoni dello stress, apprendimento o comportamenti alternativi che possono interferire con i risultati misurati.

I modelli per misurare la nocicezione nei denti utilizzano il riflesso di apertura della mascella, ma questo metodo può essere inaffidabile²³ o impreciso²⁴. L'attività elettromiografica è stata utilizzata per misurare la^{nocicezione dentale 25}, ma questo metodo richiede tipicamente che l'animale sia incosciente, anche se in uno studio il nocice dentale è stato studiato nei ratti che si^{muovono liberamente 26}. Nel 2008, Khan ha studiato la relazione tra nocicezione dentale e funzione masticatoria usando un misuratore di^{deformazione sensibile 27,} ma questo modello di durata del morso richiede di trattenere l'animale dalla normale ^{attività 28}. La forza del morso è una misura affidabile del dolore ai denti nell'uomo, ma poiché i ratti richiedono allenamento e / o moderazione per misurare la forza del morso viene introdotta una fonte di stress che può produrre risultati con discutibile significato fisiologico^29-31

Alcune limitazioni di moderazione e stress possono essere superate utilizzando un progetto operante per valutare i comportamenti nocicettivi. Un modello operistico utilizza l'evitamento di una temperatura scomoda per valutare e caratterizzare la nocicezione orofacciale^32-35. Questo modello di conflitto di ricompensa si basa su una ricompensa di latte zuccherato per indurre il roditore a posizionare volontariamente il viso contro una sonda termica riscaldata^{o raffreddata 34,36}. Tuttavia, il test richiede l'addestramento degli animali, ma una forza del saggio è che i dati vengono raccolti in modo automatizzato.

Ancora un altro modello animale ha usato la disfunzione rosicchiata indotta da nocicezione come indice di nocicezione orofacciale³⁷. Tuttavia, il roditore è confinato in un tubo e la sua unica fuga è rosicchiare attraverso un tassello per uscire. Un vantaggio di questo modello è che misura la funzione mascellare dopo lesioni acute o croniche alla mascella nei topi. Tuttavia, il roditore è confinato, il che aggiunge un comportamento concorrente alternativo confondente, cioè la fuga, che sarebbe stressante e quindi potrebbe influenzare i risultati del saggio di nocicezione.

La durata del pasto è stata utilizzata per misurare la nocicezione negli animali con artrite TMJ^38-41,esposizione alla polpa^{dentale 42}e^{danni muscolari 43}. Un roditore che ha sperimentato la nocicezione orofacciale ha mangiato più lentamente dopo che l'animale ha iniziato un pasto. I pazienti che soffrono di dolore TMJ hanno anche bisogno di più tempo per masticare il loro cibo e la lunghezza del ciclo si accorcia quando il dolore TMJ^{è diminuito di 44-46}. L'allungamento della durata del pasto quando è presente dolore TMJ dovrebbe essere un "comportamento di guardia", definito operativamente come comportamento nocicettivo⁴⁷.

La durata del pasto misura la nocicezione TMJ utilizzando un metodo non invasivo per un massimo di 19 giorni nei ratti maschi e femmine e 6 giorni (periodo più lungo testato) nei topi maschi e potrebbe essere descritto come un marcatore biologico di^{nocicezione 38-41}. A sostegno del fatto che la durata del pasto misura le risposte nocicettive, la nocicezione può essere ridotta mediante intervento farmacologico che fa sì che la durata del pasto dell'animale ritorni^{alla normalità di 38,40,41}. Ciò è stato confermato anche quando i neuroni nocicettivi sono stati distrutti usando la capsaicina; dopo la distruzione nervosa la durata della farina animale non è stata aumentata in seguito all'iniezione di CFA nel TMJ 40.

Di seguito è riportato il protocollo su come ottenere e analizzare statisticamente i dati sulla durata dei pasti.

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Protocollo

In questo modello ai ratti o ai topi è stato dato cibo e acqua ad libitum. Il Texas A&M University Baylor College of Dentistry Institutional Animal Care and Use Committee ha approvato tutti i protocolli sperimentali. Di seguito le impostazioni specifiche sono mostrate in corsivo e vengono utilizzate specificamente per il modello di artrite TMJ del ratto. I topi possono anche essere utilizzati in questo modello e possono essere utilizzati anche il dolore alternativo ai denti e i modelli animali del dolore orofacciale miogenico^42,43.

1. Impostazioni software

1. Caricare il software Animal Monitor per le unità di alimentazione sul computer.
2. Il software Animals Monitor viene ora aperto facendo clic sull'icona e sotto la selezione del menu del file scegli l'opzione pull-down "configurazione".
3. Nella finestra "Configurazione monitoraggio animali" deselezionare la casella intitolata "Input pellet consegnato" (Figura 1A).
   Nota: questa casella viene solitamente selezionata in fabbrica per impostazione predefinita. Deselezionare questa opzione. Una volta che lo sperimentatore deseleziona questa opzione, i risultati vengono registrati mediante rimozione di un pellet dal trogolo piuttosto che quando viene erogato un pellet.
   Nota: quando la casella "Denominazione automatica file" è selezionata, il software denomina automaticamente i file (Figura 1A). Questa casella viene in genere selezionata in fabbrica per impostazione predefinita.
4. Impostare le luci del timer per accendersi alle 06:00 (6:00) e spegnersi alle 20:00 (20:00).
   Nota: l'hardware per le unità di alimentazione è stato modificato in modo che le luci all'interno delle scatole non siano controllate dal software ma siano cablate invece a un timer isolato di 24 ore. Pertanto, la "House Light" indicata sul software di configurazione non era funzionale in questi esempi.
5. Selezionate il menu a discesa Modifica (Edit) e scegliete Esperimento (Experiment). Viene visualizzata una finestra con il titolo "Box 01 -" (Figura 1B).
6. Immettere il nome del file con cui i dati verranno salvati all'interno di questa finestra.
   Nota: se non viene immesso alcun nome di file, i file di dati verranno nominati automaticamente dal software. I dettagli dell'esperimento possono essere aggiunti in questa finestra e salvati con i file di dati. Le informazioni sulla finestra possono anche essere salvate e utilizzate per esperimenti successivi.
7. Immettere un numero maggiore del tempo totale dell'esperimento nella casella di ingresso intitolata "Durata esperimento (giorni):".
   Nota: questo garantirà che il software salvi i dati fino al completamento dell'esperimento, un errore può essere nell'impostare questo valore troppo breve, il che impedirrà al software di registrare i dati anche se gli animali sono ancora nei moduli di alimentazione.
8. Inserisci 24 nella casella di iscrizione intitolata "Numero di ore in un giorno".
   Nota: la lunghezza può essere modificata in base alle specifiche dello sperimentatore.
9. Inserisci 10 nella casella intitolata "Criteri di fine periodo pasto (min):"
   Nota: per i ratti è stato definito un pasto utilizzando un criterio di fine pasto di 10 minuti basato su studi^{precedenti 48} (cioè un pasto è stato bracketed prima e dopo per un periodo di 10 minuti di non assunto pellet) e la dimensione minima del pasto è stata fissata a tre pellet per pasto in questo pacchetto software.
10. Immettere 45 nella confezione intitolata "Dimensioni pellet (mg)". Se un individuo voleva usare l'input dei mouse 20 all'interno di questa finestra.
11. Per i ratti aggiungere pellet di chow roditore da 45 mg alla tramoggia del distributore dell'alimentatore.
    Nota: per i topi aggiungere pellet di chow roditore da 20 mg alla tramoggia.
12. Nella sezione "Fase" della finestra Esperimento immettere il termine Giorno nel campo "Nome" e nel campo "# ore" digitare 24 (Figura 1B).
    Nota: sotto la sezione "Fase" ci sono due grandi campi aperti. Il primo campo aperto di grandi dimensioni verrà popolato dal testo immesso nei campi "Fase" e "Nome" precedenti.
13. Il successivo campo aperto di grandi dimensioni avrà l'intestazione "Fase giorno" Invio nel campo intitolato "Nome" della parola Luce e immettere nel campo intitolato "Percentuale" il numero 60.
    Nota: questo testo immesso popolerà il campo grande di seguito.
14. Immettere quindi nel campo "Nome" la parola Scuro e immettere nel campo "Percentuale" il numero 40. Nota: con queste voci il 60% della giornata sarà attribuito alla fase di luce e il 40% sarà attribuito alla fase oscura. Quando il software calcola i modelli di pasto, verranno utilizzate queste informazioni. Queste impostazioni tipiche delle femmine in bicicletta che vengono tenute su un ciclo chiaro / scuro 14:10.
15. Selezionare il pulsante "Imposta tutte le caselle in questo modo". Salvare queste informazioni e quindi premere OK.
16. Viene visualizzata la schermata "Start Boxes", selezionare gli alimentatori da attivare e premere OK (Figura 1C).
17. Successivamente verranno visualizzate le finestre di run-time di Animal Monitor con i dati del modello di pasto (Figura 1D).
    Nota: monitorare e registrare il "# di Pellets Dispensato" da questa finestra per determinare lo stato attuale del topo. Un topo maschio sano del peso di circa 300 g mangia in genere tra 300-800 45 mg di pellet al giorno.
18. I file vengono generati giornalmente e salvati automaticamente con un oggetto . CSV. Apri questi file per recuperare i dati del modello di pasto come l'assunzione di cibo, il numero di pasti, la durata del pasto, le dimensioni del pasto o l'intervallo intermeale. Gli intervalli per questi modelli di pasto possono essere calcolati per l'intera giornata o per una fase del giorno come la fase Buio e Luce. Come notato sopra, le impostazioni sono per un ciclo chiaro /scuro 14:10. Anche i dati grezzi di quando ogni pellet è stato rimosso dal trogolo vengono registrati come grezzi. CSV.
    Nota: nelle versioni precedenti del software non viene utilizzata una dimensione minima del pasto di 3 pellet nei calcoli per la generazione di . CSV.  Inoltre, per ottenere la durata media del pasto utilizzando il software precedente è necessario sottrarre 10 minuti dai valori nella colonna Durata media pasto di . CSV.
    Quando il software è in funzione, l'operatore può selezionare manualmente l'opzione del menu a discesa del file e selezionare quotidianamente "salva dati grezzi". In questo modo i dati grezzi verranno risparmiati per un periodo di 24 ore anziché per l'intero esperimento. Questi dati grezzi possono essere elaborati da software alternativi a discrezione dell'utente.
    Nota: nei risultati mostrati abbiamo utilizzato un software alternativo per includere una dimensione minima del pasto di 3 pellet.

2. Saggio sulla durata del pasto

1. Posizionare i singoli ratti nelle camere attenuanti dal suono dotate di alimentatori a pellet attivati dal computer photobeam.
   Nota: in queste unità di alimentazione ci sono bottiglie d'acqua graduate e padelle di scarto in cui è posto un foglio di carta assorbente spessa. Nella tramoggia dell'alimentatore è possibile aggiungere pellet di chow roditore da 45 mg per ratti o 20 mg di pellet di chow roditore per topi. I pellet di Chow vengono erogati in una mangiatoia a forma di V e nella parte inferiore di questo trogolo c'è un photobeam. Un pellet erogato nel trogolo verrà rilevato rompendo questo photobeam. Una volta che un topo rimuove questo pellet dall'alimentatore attraverso il photobeam viene ripristinato e questo segnala al computer di far cadere un altro pellet. Il ripristino del photobeam attiva anche il computer per registrare la data e l'ora e mantiene un conteggio in esecuzione dei pellet erogati. Questo conteggio di pellet viene quindi analizzato per determinare l'assunzione di cibo, il numero di pasti, la durata del pasto, le dimensioni del pasto o l'intervallo intermeale durante qualsiasi parte della giornata utilizzando il software Med Assoc. Ancora una volta il grezzo . Il file di dati CSV può essere analizzato da software^{esterno 39,40,49-51}.
2. Registrare il numero totale di pellet consumati, la quantità di acqua consumata e il peso degli animali per discernere la salute generale dei ratti durante la sperimentazione.
3. Risciacquare le bottiglie d'acqua e riempire con acqua fresca ogni giorno e aggiungere chow alla tramoggia dell'alimentatore quando necessario.
4. Scaricare quotidianamente la padella dei rifiuti e la carta assorbente spessa sotto la gabbia e soffiare quotidianamente la polvere dalla parte mobile dell'alimentatore utilizzando aria ad alta pressione.
   Nota: sono necessarieattrezzature di protezione individuale (ad esempio camici, guanti, maschere e maschere).
5. Rimuovere pavimenti, padelle di scarto e bottiglie d'acqua dopo il completamento dell'esperimento e lavare questi componenti. Inoltre, rimuovere l'elettronica di alimentazione dal lavaggio della crema a mano o in lavastoviglie.

3. Induzione dell'artrite TMJ

1. Posizionare gli animali negli alimentatori almeno 4 giorni prima della sperimentazione.
   Nota: questi dati verranno segnalati come preeti per ottenere un comportamento di alimentazione di base. Quindi gli animali vengono rimossi dall'alimentatore per il trattamento. Un tipo di trattamento era quello di indurre un TMJ artritico. Per questo modello i ratti vengono iniettati con coadiuvante completo di Freund (CFA) alle 08:00(cioè all'inizio della fase di luce) dopo che i ratti sono stati anestetizzati con isoflurane (flusso del 5%).
2. Iniettare 250 mg di CFA in 50 L bilateralmente nello spazio periarticolare di ogni TMJ.
   Nota: nell'esempio(figura 2) 250 mg di CFA in 50 L sono stati iniettati in ogni TMJ, ma dosi fino a 10 mg in volumi di soli 15 μl sono efficaci per periodi di tempo più brevi⁵².
3. Ratti di controllo iniettati TMJ con 50 L dello 0,9% di soluzione salina. Nota: tutti gli animali erano mobili entro 5 minuti o meno dopo l'induzione dell'anestesia. Nel caso in cui una dose minore di CFA sia somministrata in un volume minore, i ratti di controllo riceverebbero lo stesso volume di soluzione salina.

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Risultati

La durata del pasto è una correlanza comportamentale del dolore orofacciale e le misurazioni della durata dei pasti sono state applicate agli animali con artrite TMJ (Figura 2) e carie(Figura 3). In un esperimento, i ratti hanno avuto artrite TMJ dopo aver somministrato un'elevata dose di CFA di 250 mg e questo trattamento ha indotto un aumento significativo della durata del pasto per 19 giorni(figura 2). Una dose inferiore di CFA (10 mg) iniettata in ciascun giunto TMJ...

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Discussione

I pazienti TMJ con dolore orofacciale riportano un aumento del dolore con un aumento del tempo di masticazione, in modo tale che il ciclo di masticazione si allunga più a lungo l'individuo ha^{masticato 45,53-56}. Il nostro saggio comportamentale consente test simili su ratti e topi quando si misura la durata del pasto³⁹. Un recente studio inedito ha suggerito che il test del filamento von Frey aveva una maggiore sensibilità rispetto alle misurazioni della durata dei pasti, mostrando un cambiamento s...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Monitor software	Med Assoc. Inc	SOF-710	East Fairfield, VT
Dustless Precision Pellets, Rodent, Grain-Based	Bio-Serv	F0165	45 mg pellets, 50,000/box
Dustless Precision Pellets, Rodent, Grain-Based	Bio-Serv	FO163	20 mg pellets
Complete Freund's Adjuvant	Chondrex, Inc.	7001	No loger provides the 5 mg/ml concentration.  Can use CFA from other sources as long as the investigator consistently uses this source