MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione per tessuti renali fissati in formalina

Riepilogo

Questo articolo viene descritto un protocollo in situ ottimizzato per il rilevamento colorimetrico di espressione microRNA nelle sezioni di rene fisse formalina.

Abstract

In questo articolo descriviamo un metodo di rilevazione colorimetrico del miRNA nel rene mediante ibridazione in situ con sonde digossigenina taggato microRNA. Questo protocollo, sviluppato originariamente da Kloosterman e colleghi per un uso ampio con sonde Exiqon miRNA ^1, è stato modificato per superare le sfide insite nell'analisi miRNA nei tessuti renali. Si tratta di problemi quali l'identificazione struttura e difficile da rimuovere la sonda residuo e anticorpi. L'uso di relativamente sottile, spessore 5 mm, sezioni di tessuto consentiti per una chiara visualizzazione delle strutture renali, mentre un forte segnale della sonda è stato trattenuto nelle cellule. Inoltre, le condizioni di concentrazione sonda e di incubazione sono stati ottimizzati per facilitare la visualizzazione di espressione microRNA con basso background e segnale aspecifico. Qui, il protocollo ottimizzato è descritto, di captazione tessuto iniziale e preparazione attraverso il montaggio di diapositive alla fine della procedura. La compone di basenti di questo protocollo possono essere modificati per applicazione ad altri tessuti e modelli di coltura cellulare.

Introduzione

MicroRNA sono piccoli (lunghi circa 22 nucleotidi) RNA non codificanti che vengono prodotti in modo endogeno. In genere funzionano per sopprimere l'espressione della proteina attraverso la repressione traslazionale o degradazione mRNA. miRNA si legano agli obiettivi mRNA con la complementarità incompleta, rendendo possibile per un singolo miRNA per sopprimere bersagli multipli.

Capire quali tipi e strutture cellulari esprimono miRNA è una parte importante di comprendere i meccanismi attraverso i quali alterazioni di espressione miRNA influenza delle cellule e dei tessuti fenotipi. Mentre i metodi quali miRNA sequenziamento, qPCR e Northern blotting possono essere usate per il rilevamento dei miRNA nei tessuti interi, questo approccio non permette di determinare il tipo specifico di cellule venivano dall'interno di un dato tessuto. Dissezione di componenti cellulari e strutturali prima dell'analisi con questi metodi può essere molto difficile e le condizioni necessarie per raggiungere isolamenti adeguati può portare ad alterations nell'espressione genica o la degradazione di RNA. microRNA ibridazione in situ è un metodo utilizzato per visualizzare la posizione microRNA e livelli di espressione nei tessuti. Questa tecnica è particolarmente utile in tessuti composti di strutture eterogenee, come il rene.

I microRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo di regolamentazione in ^2,3 sviluppo del rene e la fisiologia ^4. alterazioni di espressione microRNA hanno anche dimostrato di essere coinvolti con patologie renali come la fibrosi ^5-10, nefropatia diabetica ^7, carcinoma renale ^11,12, e danno renale acuto ^13. Nella nostra ricerca, abbiamo scoperto che l'ottimizzazione microRNA ibridazione in situ per i tessuti renali è stata preziosa per determinare le esatte posizioni strutturali di espressione miRNA sia in salute e malattia ^14. Determinazione dell'espressione tubolare e cellulare di diversi microRNA è importante perché la loro regolazione di targets possono dipendere funzioni cellulari. Negli stati malati è importante anche per determinare in che modo le alterazioni dell'espressione dei miRNA possono essere funzione incidono.

L'obiettivo del metodo qui descritto è stato quello di sviluppare metodologie ISH esistenti predisposti da Kloosterman et al. ^15, altri ricercatori ^16,17, e quelle suggerite dalla Exiqon ¹ e ottimizzare il metodo di formalina tessuti renali fissi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per identificare le diverse differenze regionali nella renale espressione di microRNA miR-382 con unilaterale ostruzione ureterale ^18. Questo approccio può essere utilizzato con altri tessuti e, con ulteriore ottimizzazione.

Protocollo

1. Renali tessuto Sezioni

1. Fissato in formalina (10%) sezioni di rene in paraffina sono tagliati su vetrini da microscopio a 5 mm di spessore con un Microm HM 355 S. Le slide possono essere conservati per diversi mesi prima analisi.

2. Soluzione Preparazione

1. Preparare 1 L di 1x PBS in DDH ₂ O in una bottiglia con tappo a vite autoclavabile. Riempire un'altra bottiglia con 1 L di DDH ₂ O. Aggiungere 1 ml di DEPC per ogni bottiglia, coperchio e agitare vigorosamente. Lasciate le soluzioni siedono notte a temperatura ambiente per distruggere RNasi e poi in autoclave. Aggiungere 400 ml di Tween-20-1 L di 1x PBS per rendere PBS-T.
2. Preparare proteinasi K tampone (50 mMTris-HCl, pH 8,0 e 1 mM CaCl ₂ in DEPC acqua trattata).
3. Preparare una soluzione di 0,2% glicina in PBS-T.

3. Tissue Preparazione

1. Preparare un grande volume di tampone di ibridazione (50-100 ml) composta dal 50% formammide, 5x SSC, 0,1% Tween, 9.2acido citrico mM per aggiustamento del pH a 6, 50 ug / ml di eparina, e 500 mg / ml di RNA di lievito in DEPC trattati DDH ₂ O. Dividere in 1 ml aliquote e conservare a -80 ° C.
2. Rimuovere la paraffina dal tessuto mediante lavaggio 3x in xilene fresco per 5 minuti ciascuna.
3. Reidratare le sezioni di tessuto per 5 min incubazioni in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 75%, 50% e 25%) in DDH ₂ O.
4. Trattare i vetrini con DEPC sufficiente a coprire completamente le sezioni di tessuto (circa 0,4-0,5 ml) per 1 min. Rendere sicuri i tessuti non si asciugano.
5. Sciacquare i vetrini in DEPC trattati PBS-T due volte per 5 min, la raccolta dei rifiuti DEPC contenente per il corretto smaltimento. Tutti i reagenti devono essere DEPC trattati per eliminare RNasi da questo punto in poi.
6. Preriscaldare proteinasi K tampone e inserirlo proteinasi K a una concentrazione finale di 10 pg / ml. Coprire sezioni di tessuto con una soluzione di proteinasi K e incubare a 37 ° C per 5 min.
7. Rimuovere rapidamente i proteinassoluzione e K e aggiungere 0,2% glicina in PBS-T per 30 sec.
8. Sciacquare i vetrini in DEPC trattati PBS-T due volte per 30 secondi ciascuna.
9. Fissare sezioni appena fatto paraformaldeide 4% per 10 min.

4. Ibridazione

1. Aggiungere 50 ml di tampone di ibridazione (formammide 50%, 5x SSC, 0,1% Tween, acido citrico 9,2 mm per l'aggiustamento a pH 6, 50 mg / ml di eparina, 500 mg / ml di RNA di lievito) per sezione di tessuto e coprire con RNAsi HybriSlips gratis tagliare appena più grandi delle sezioni di tessuto.
2. Sezioni Prehybridize a umidità controllata ibridazione forno per 2 ore a temperatura di ibridazione determinato per la 3 'della sonda marcata con digossigenina (solitamente Tm DNA della sonda -21 ° C (cioè 54 ° C per miR-382, sonda di DNA Tm = 75 ° C ), utilizzando salviette di laboratorio tessuti imbevuti nel 50% formamide/50% 5x SSC per mantenere la camera umidificata.
3. Diluire la sonda di miRNA, controllo positivo (U6, piccolo RNA nucleare) e il controllo negativo (strapazzatesequenza) a 40 nM in tampone di ibridazione (75 microlitri di tampone è necessaria per sezione).
4. Riscaldare la sonda nel tampone di ibridazione a 65 ° C per 5 min.
5. Togliere i vetrini dalla ibridazione forno e rimuovere coprioggetto e tampone di ibridazione in eccesso da prehybridization.
6. Aggiungere 75 ml di sonda contenente tampone per sezione di tessuto, direttamente al tessuto. Coprire con tessuto HybriSlips appena sufficiente a coprire le sezioni di tessuto.
7. Mantenere il livello di supporto di diapositive, tornare a ibridazione forno per notte di incubazione a temperatura dal punto 4.2 (circa 16 ore).

5. Stringenza Wash

1. Aggiungere 200 microlitri 2x SSC, riscaldato alla temperatura di ibridazione, poco meno di un bordo del coprioggetto per favorire il rilascio coprioggetto dal tessuto. Rimuovere il vetrino inclinando il vetrino.
2. Lavare i vetrini in 200 ml di 50% formammide, 50% 2x SSC a ibridazione 3x temperatura per 30 minuti ciascuno.
3. Sciacquarei vetrini 5x in PBS-T a temperatura ambiente per 5 min ciascuno su agitatore orbitale a bassa velocità.

6. Rivelazione

1. Incubare il vetrino in tampone di bloccaggio (2% capra o siero di cavallo, 2 mg / ml di BSA in PBS-T) per 1 ora a temperatura ambiente su agitatore orbitale a bassa velocità camera.
2. Diluire frammenti anti-DIG-AP Fab in tampone di bloccaggio a 1:100. Aggiungere 100 microlitri per ogni sezione di tessuto e coprire con HybriSlips tagliato appena sufficiente a coprire la sezione.
3. Incubare anticorpo in una camera umidificata a 4 ° C per una notte (circa 16 ore).
4. Lavare i vetrini in PBS-T 7x, per 5 min ciascuno su agitatore orbitale a bassa velocità.
5. Lavare i vetrini in tampone AP (100 mM TrisHCl pH 9,5, 50 mM MgCl _2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, per 5 minuti ciascuno.
6. Aggiungere la soluzione NBT / BCIP al buffer di AP (200 μl/10 tampone ml)
7. Aggiungere 400-500 ml di soluzione diluita di NBT / BCIP per ogni diapositiva a coprire completamente tutte le sezioni di tessuto. Sviluppare in un buio, livello, HumidifCamera IED per 4-5 ore.

7. Slides di montaggio

1. Disidratare sezioni in concentrazioni crescenti di etanolo (25%, 50%, 75%, 100%) per 5 min ciascuno.
2. Incubare a 5x xilene per chiarire sezioni.
3. Monte scorre in mezzo di montaggio Permount e pernottamento a secco.

Risultati

Le aree di una sezione di tessuto che diventano asciugato durante le ibridazioni, incubazioni o lavare gradini generalmente finiscono colorazione più scura durante lo sviluppo NBT / BCIP. Figura 1 mostra una porzione di una sezione in cui il rene HybriSlip scivolato del bordo il tessuto, consentendole di diventare parzialmente disidratato. Nonostante reidratazione e la copertura nei passaggi rimanenti, il segnale nella porzione disidratata è artificialmente elevato.

L'...

Discussione

L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un protocollo per miRNA ibridazione in situ che funziona bene nei tessuti renali fissati in formalina. Mentre si lavora su questo protocollo sono stati identificati alcuni importanti fonti di artefatti di colorazione. Una grande attenzione a questi punti può aiutare a evitare di macchiare artefatto e aumentare la probabilità di una corsa ISH successo.

Una delle cause più evitabili di artefatti di colorazione può verifica...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
PBS	Gibco	70011044
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758
Tween-20	Sigma	P1379
Xylenes	Sigma	534056
Ethanol	Ultra Pure	200CSPTP
Tris-HCl	Life Technologies	15506-017
CaCl2	Sigma	C2536
Glycine	J.T. Baker	4059-00
Citric Acid	Sigma	C2404
Formamide	Sigma	F9037
20x SSC Buffer	Life Technologies	15557-044
Heparin	SAGENT	25021-400-30
Yeast RNA	Life Technologies	AM7118
MgCl2	Sigma	M8266-1004
NaCl	J.T. Baker	4058-01
Proteinase K	Fermentas	EO0491
3’ DIG- miRNA probe	Exiqon	miR dependent-05
3’ DIG- Scrambled miR probe	Exiqon	99004-05
3’ DIG- U6 miR probe	Exiqon	99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab Fab	Roche	11093274910
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Permount	Fisher	SP15-500
Coverslips	Fisher	Fit to tissue size
Microtom HM 355 S	Thermo Scientific	23-900-672
In-slide Out Hybridization Oven	Boekel	241000
Aluminum Tray Assembly	Boekel	C2403973
Stainless Steel Rack Insert	Boekel	C2403754