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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Viene introdotto un biosensore ottico privo di etichetta per il rilevamento di batteri rapidi. Il biosensore è basato su poroso nanostrutturato Si, che è stato progettato per catturare direttamente le cellule dei batteri bersaglio sulla sua superficie. Usiamo anticorpi monoclonali, immobilizzati sul trasduttore poroso, come le sonde di cattura. I nostri studi dimostrano l'applicabilità di questi biosensori per il rilevamento di concentrazioni batteriche basse in pochi minuti, senza trasformazione campione prima (come lisi cellulare).

Abstract

Un biosensore ottico privo di etichetta basato su un poroso nanostrutturato Si è progettato per acquisizione rapida e rilevamento di batteri Escherichia coli K12, come modello microrganismo. Il biosensore deduce legame diretto delle cellule dei batteri bersaglio sulla sua superficie, mentre non è necessario alcun pretrattamento (ad esempio mediante lisi cellulare) del campione studiato. Un film sottile mesoporosi Si è utilizzato come elemento trasduttore ottico del biosensore. Sotto illuminazione a luce bianca, lo strato poroso mostra ben risolti, i modelli frange Fabry-Perot nel suo spettro di riflessione. L'applicazione di una trasformata veloce di Fourier (FFT) per i risultati dei dati di riflettività in un unico picco. Variazioni dell'intensità del picco FFT sono monitorati. Così, batteri bersaglio catturare sulla superficie biosensore, attraverso interazioni anticorpo-antigene, induce cambiamenti misurabili nell'intensità dei picchi FFT, consentendo un osservazione 'tempo reale' di attaccamento batteri. nt "> Il film di Si mesoporosi, fabbricato da un processo di anodizzazione elettrochimica, è coniugato con anticorpi monoclonali, specifici per i batteri bersaglio. L'immobilizzazione, immunoactivity e specificità degli anticorpi sono confermati da esperimenti di marcatura fluorescente. Dopo il biosensore è esposto al batteri bersaglio, le cellule sono direttamente catturati sulla superficie porosa Si anticorpi modificati. Questi eventi di cattura specifici producono variazioni di intensità del film sottile spettro interferenza ottico del biosensore. Abbiamo dimostrato che questi biosensori possono rilevare relativamente basse concentrazioni batteriche (rilevamento limite di 10 4 cellule / ml) in meno di un'ora.

Introduzione

Precoce ed accurata identificazione di batteri patogeni è estremamente importante per la sicurezza degli alimenti e l'acqua, il monitoraggio ambientale e diagnostica 1 point-of-care. Come le tecniche di microbiologia tradizionali sono molto tempo, laborioso, e non hanno la capacità di rilevare i microrganismi in "real-time" o al di fuori dell'ambiente di laboratorio, biosensori stanno evolvendo per rispondere a queste sfide 2-5.

Negli ultimi anni, poroso Si (PSI) è emerso come una piattaforma promettente per la progettazione di sensori e biosensori 6-20. Negli ultimi dieci anni sono stati pubblicati numerosi studi in materia di sensori e biosensori ottici basati psi 21,22. Lo strato nanostrutturati PSi è tipicamente fabbricata elettrochimica anodica incisione da un singolo cristallo di wafer di silicio. I nanomateriali PSi risultanti presentano molte caratteristiche vantaggiose, come la grande superficie e volume libero, poro misure che possono essere controllati e sintonizzabile optiproprietà cal 10,16. Le proprietà ottiche dello strato Psi, quali fotoluminescenza 8,11 e luce bianca a base di riflettanza-interferometria 7,19, sono fortemente influenzati dalle condizioni ambientali. Cattura di giudizi analiti molecole / destinazione entro i risultati strato poroso in una variazione dell'indice di rifrazione medio del film, osservato come una modulazione nello spettro di fotoluminescenza o come uno spostamento della lunghezza d'onda nello spettro di riflettività 10.

Anche se la grande innovazione nella tecnologia PSi biosensore ottico, ci sono solo pochi rapporti sulle piattaforme basate PSI-per i batteri rilevamento 6,8,20,23-29. Inoltre, la maggior parte di questi studi proof-of-concept hanno dimostrato di rilevamento "indiretta" dei batteri. Così, generalmente prima lisi delle cellule è necessario per estrarre i frammenti di proteine ​​/ DNA mirati, caratteristici per i batteri studiati 29. Il nostro approccio è quello di acquisire direttamente i batteri bersagliocellule su il biosensore psi. Pertanto, gli anticorpi monoclonali, che sono specifici per i batteri bersaglio, sono immobilizzati sulla superficie porosa. Il legame di cellule di batteri, tramite interazioni anticorpo-antigene, sulla superficie del biosensore indurre variazioni di ampiezza (intensità) dello spettro di riflettività 24-26.

In questo lavoro, si segnala la costruzione di un biosensore basato PSI-ottica e dimostrare la sua applicazione come una piattaforma di biosensori privo di etichetta per la ricerca di Escherichia coli (E. coli), batteri K12 (utilizzati come modello microrganismo). L'monitorato segnale ottico è la luce riflessa dalla nanostruttura PSi causa di Fabry-Perot interferenze film sottile (Figura 1A). Cambiamenti nella luce ampiezza / intensità sono correlati alla specifica immobilizzazione delle cellule dei batteri bersaglio sulla superficie biosensore, consente il rilevamento rapido e quantificazione dei batteri.

Protocollo

1. Preparazione di Oxidized poroso SiO 2

  1. Etch wafer di silicio (singolo lato lucido in <100> viso e pesantemente drogato, di tipo p, 0.0008 Ω · cm) in una soluzione 03:01 (v / v) di HF acquosa ed etanolo assoluto per 30 secondi a una corrente costante densità di 385 mA / cm 2. Si prega di notare che la HF è un liquido altamente corrosivo e deve essere maneggiato con estrema cura.
  2. Risciacquare la superficie del risultante Si (PSI) pellicola porosa con etanolo assoluto più volte; asciugare i film sotto un gas di azoto secco.
  3. Ossidare i campioni PSi appena incise in un forno tubolare a 800 ° C per 1 ora in aria ambiente (posizionare il campione nel forno a temperatura ambiente, riscaldare il forno a 800 ° C, lasciare in forno per 1 ora, spegnere il forno e togliere i campioni dal forno solo a temperatura ambiente).

2. Biofunzionalizzazione di PSIO 2 Ponteggi

  1. Incubare un PSi ossidato (PSiO 2) campione per 1 ora in mercaptopropil (95% (MPTS) soluzione trimetossisilano-3) (108 mM in toluene).
  2. Risciacquare il PSIO 2 campione silano-trattato con toluene, metanolo e acetone; secco sotto un gas di azoto secco.
  3. Incubare la PSIO 2 campione silano modificato per 30 min in 1 ml di 100 mM di soluzione biotina PEO-iodoacetyl.
  4. Sciacquare il PSIO 2 campione di biotina-trattati con 0,1 M tampone fosfato soluzione (PBS) diverse volte.
  5. Incubare la PSIO 2 campione biotina-modificato per 30 min in 1 ml di soluzione di streptavidina ml 100 pg / (SA).
  6. Sciacquare il PSIO 2 del campione SA-trattato con soluzione 0,1 M PBS diverse volte.
  7. Incubare la SA-modificato PSIO 2 campione risultante per 30 minuti in 1 ml di 100 pg / ml biotinilato E. soluzione di anticorpo monoclonale coli (Immunoglobulina G, IgG) o con IgG 100 pg / ml biotinilato-coniglio (come modello per un anticorpo monoclonale).

3. Etichettatura fluorescente e microscopia a fluorescenza

  1. Incubare le superfici IgG modificati con 15 ug / ml di fluoresceina (FITC) codificata anti IgG di coniglio per 40 min e con 15 ug / ml di fluoresceina (FITC) codificata IgG anti-topo come controllo.
  2. Sciacquare i campioni modificati con 0,1 M PBS soluzione più volte.
  3. Esaminare i campioni al microscopio a fluorescenza.

4. Cultura Batteri

  1. Coltivare E. batteri coli K12 in una provetta da 10 ml con 5 ml di Luria Bertani (LB) medio (tessitura media in 1 L di acqua deionizzata: 5 g di NaCl, 5 g di estratto di lievito, e 10 g di triptone). Incubare i batteri durante la notte agitazione a 37 ° C.
  2. Controllare la concentrazione di batteri dalla lettura della densità ottica (DO) a una lunghezza d'onda di 600 nm. Dopo la crescita durante la notte in mezzo LB, leggere la OD 600 utilizzando uno spettrofotometro per determinare la concentrazione batterica. Il numero di cellule è terribilectly proporzionale ai OD 600 misure (1 OD 600 = 10 8 cellule / ml).

5. Batteri Sensing

  1. Posizionare il PSIO IgG modificato 2 e ordinata PSIO 2 (come controllo) campioni in una cella di flusso plexiglas su misura. Fissare la cella di flusso per garantire che la riflettività campione viene misurato nella stessa posizione durante tutte le misurazioni.
  2. Incubare i campioni con E. sospensione coli K12 (10 4 cellule / ml) per 30 min a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la sospensione batteri svuotando la cella con 0,85% w / v soluzione salina per 30 minuti.
  3. Monitorare i cambiamenti nei dati di riflettività in tutto l'esperimento. Tutte le misurazioni ottiche devono essere effettuate in un acquoso circostante. Spettri debbono essere raccolti utilizzando uno spettrometro CCD e analizzato applicando trasformata veloce di Fourier (FFT), come precedentemente descritto 25,26.
  4. Confermare la presenza dei batteri sullasuperficie biosensore, dall'osservazione dei campioni sotto un microscopio ottico verticale subito dopo l'esperimento biosensori.

Risultati

PSi ossidato (2) PSIO film sono preparati come descritto nella sezione Text protocollo. Figura 1B mostra una ad alta risoluzione al microscopio elettronico a scansione della pellicola PSi risultante dopo ossidazione termica. Lo strato PSIO 2 è caratterizzata da pori cilindrici ben definiti con un diametro nell'intervallo di 30-80 nm.

L'anticorpo monoclonale (IgG) molecole si innestano sulle PSIO 2 superfici utilizzando una tecnologia...

Discussione

Un immunosensor ottico privo di etichetta, basato su un PSIO 2 nanostruttura (un film sottile Fabry-Perot) è fabbricato, e il suo potenziale applicabilità come un biosensore per la rilevazione batteri è confermato.

Modifiche e risoluzione dei problemi

Uno dei principali problemi durante la progettazione di immunosensor è la suscettibilità di anticorpi a subire cambiamenti di conformazione indesiderati durante la deposizione e patterning sul substrato...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Science Foundation Israele (concessione n ° 1118-1108 e concessione n ° 1146/12) e il Minna Kroll Memorial Fund Research. ES riconosce con gratitudine il sostegno finanziario del Russell Berrie Nanotechnology Institute.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Si waferSiltronix Corp.Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%)Merck101513
Ethanol absoluteMerck818760
PBS buffer solution (pH 7.4)prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/vprepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS)Sigma Aldrich Chemicals175617
PEO-iodoacetyl biotinSigma Aldrich ChemicalsB2059
Streptavidin (SA)Jackson ImmunoResearch Labs Inc.016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidinJackson ImmunoResearch Labs Inc.016-010-084
Biotinylated-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Labs Inc.115-095-003
Biotinylated E. coli antibodyJackson ImmunoResearch Labs Inc.1007
E. coli (K-12)was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion

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