Gli xenoinnesti glioma ortotopici primari ricapitolano la crescita infiltrativa e la mutazione isocitrato deidrogenasi I

Riepilogo

I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici.

Abstract

I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici. Per modellare i gliomi maligni di grado III e IV dell'OMS nei test di trapianto, le cellule tumorali umane vengono xenografate in un sito ortotopico, il cervello, di topi immunocompromessi. A differenza degli xenoinnesti secondari che utilizzano cellule tumorali coltivate, le cellule glioma umane vengono dissociate dagli esemplari resected e trapiantate senza passaggio preventivo nella coltura tissutale per generare xenografti primari. La procedura in questo rapporto descrive in dettaglio la preparazione del campione tumorale, il trapianto intracraniale in topi immunocomprosi compromessi, il monitoraggio per l'innesto tumorale e la raccolta del tumore per il successivo passaggio negli animali riceventi o l'analisi. La preparazione delle cellule tumorali richiede 2 ore e la procedura chirurgica richiede 20 min / animale.

Introduzione

I gliomi maligni sono tumori gliali primari del sistema nervoso centrale che si verificano nel cervello e occasionalmente nel midollo spinale. I gliomi sono classificati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) in base alla somiglianza istologica con astrociti, oligodendrociti o cellule ependimali e quindi classificati numericamente (da I a IV) per caratteristiche patologiche di malignità. I sottotipi istologici più comuni sono astrocitomi, oligodendrogliomi e oligoastrocitomi misti. I gliomi maligni che comprendono i gradi da II a IV dell'OMS sono caratterizzati da crescita invasiva e recalcitranza alle terapie attuali. Ogni anno negli Stati Uniti, a circa 15.750 individui viene diagnosticato un glioma maligno e si stima che 12.740 pazienti soccombano a questa malattia. Queste statistiche evidenziano la natura particolarmente letale dei gliomi maligni e l'importante necessità di una maggiore efficacia terapeutica.

I modelli di cancro sono essenziali per studiare la biologia e le terapie tumorali. Le linee cellulari tumorali umane rappresentano un primo passo importante per le manipolazioni in vitro e gli studi di xenoin vivo (xenografti secondari)¹. Tuttavia, le colture standard di cellule tumorali subiscono una trasformazione fenotipico e genotipico^2-4 che potrebbe non essere ripristinata negli xenoinnesti^{secondari 5}. Inoltre, alterazioni genetiche come mutazioni dell'isocitrato deidrogenasi(IDH)⁶, popolazioni distinte di cellule staminali^{7 e} dipendenza dalle principali vie di segnalazione^{8 possono} essere perse nelle colture delle cellule tumorali. I profili genomici possono essere mantenuti in misura migliore nella cultura della sfera tumorale, anche se non riescono ancora a rispecchiare completamente il genotipo dei tumori^{primari 2,3}. Il trapianto ortotopico diretto nega le influenze della coltura in vitro, fornisce un microambiente adeguato e preserva l'integrità delle cellule che iniziano il tumore^9,10. Pertanto, gli xenoinnesti primari rappresentano un modello preclinico potente e pertinente per testare rigorosamente agenti mirati per aiutare nella progettazione razionale dei futuri studi^{clinici 5,11,12}.

Protocollo

1. Preparazione della sospensione delle cellule tumorali

Nota: Sono necessarie adeguate approvazioni istituzionali per l'uso di materiale paziente e animali per stabilire e mantenere gli xenografti di glioma ortotopici primari. Al Vanderbilt University Medical Center, il materiale tumorale reinsediato che è superiore a quello richiesto per scopi diagnostici viene raccolto con il consenso del paziente per un deposito di tessuti di ricerca. I campioni sono etichettati con un numero di database REDcap randomizzato a 5 cifre e tutti gli identificatori specifici del paziente vengono rimossi. Il database REDcap contiene dati clinici deidentificati per ogni campione nel repository tissutale che include sesso, età (negli anni), razza, stato di sopravvivenza, patologia, trattamenti antitumorali, anno di resezione e tempo di progressione. Per mantenere la sterilità e ottimizzare il successo del metodo dello xenograft primario, tutti i reagenti, gli strumenti chirurgici autoclavati a vapore e il sito chirurgico devono essere assemblati o preparati in anticipo.

Nota: Gli esemplari di glioma spesso contengono grandi quantità di mielina e detriti. A seconda delle dimensioni del campione, potrebbe essere necessario utilizzare più di 4 tubi gradienti discontinui per un'adeguata rimozione di mielina e detriti.

Nota: Il processo viene completato quando non rimane tessuto non dissociato, o poco, chiaramente visibile. Evitare l'introduzione di bolle durante il processo di triturazione.

Nota: La vitalità cellulare dopo la dissociazione è in genere >90%. Le viabilità più basse possono riflettere molte variabili tra cui la manipolazione del tessuto non ottimale o il tempo di trasporto dalla sala operatoria, il metodo di crioconservazione o la tecnica di dissociazione della papaina. Tuttavia, le minori capacità cellulari possono essere ancora adeguate, a condizione che un numero sufficiente di vitali possano essere trapiantati nel volume appropriato. Per ogni topo, 50.000-200.000 cellule vitali vengono impiantate in volume di 2 μl. A causa della punta smussata dell'ago della siringa, nel volume finale devono essere inclusi altri 5 μl di sospensione cellulare per garantire che nel volume finale possa essere prelevato materiale adeguato nella siringa per ogni iniezione. Ad esempio, per iniettare 2 μl/topo per 5 topi il volume finale dovrebbe essere di 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl).

1. Mettere il materiale paziente appena reinsediato e deidentificato in un contenitore sterile e chiuso sul ghiaccio per il trasporto in laboratorio. Elaborare il campione direttamente per il trapianto o crioconservare il campione in azoto liquido (vedi sotto) per la conservazione in azoto liquido e successivamente l'uso.
2. Preparare le soluzioni di dissociazione della papaina (soluzione di papaina, soluzione inibitore di lavaggio/proteasi e soluzione gradiente discontinuo) in una cappa sterile con i componenti del kit e le istruzioni fornite dal produttore. Etichettare tubi conici sterili in polistirolo da 15 ml e distribuire le soluzioni come segue:
   • Tubo 1: 5 ml di soluzione di papaina
   • Tubo 2: 3 ml di soluzione inibitore del lavaggio/proteasi
   • Tubi 3-6: 5 ml ciascuno di soluzione gradiente discontinuo
3. Posizionare il campione di glioma nel tubo 1 con 5 ml di soluzione di papaina e triturato con una pipetta da 5 ml in un periodo di tempo di 10-20 minuti.
4. Pipettare il materiale su e giù 10 volte e quindi incubare il materiale per 2-3 minuti a temperatura ambiente prima di iniziare il ciclo successivo di triturazione.
5. Posizionare la punta della pipetta da 5 ml più vicino al fondo del tubo conico con ogni ciclo di triturazione in modo che la punta tocchi il fondo del tubo negli ultimi 2 cicli.
6. Centrifuga a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e pipettare il pellet su e giù 10x in 3 ml della soluzione inibitore di lavaggio/proteasi.
7. Stratalizzare con cura un volume uguale della sospensione su ciascuna delle soluzioni di gradiente discontinuo da 5 ml (tubi 3-6), con un pipettor impostato alla velocità di erogazione "gravità".
8. Posizionare i tubi in una centrifuga dotata di un rotore a benna oscillante, con la velocità di accelerazione ridotta all'impostazione più bassa e il freno spento. Centrifuga a 76 x g per 12 min a temperatura ambiente. Con il freno spento, la centrifugazione viene generalmente completata dopo 20 minuti.
9. Rimuovere il supernatante, resuspend e combinare ogni pellet in 5 ml di soluzione di sale sterile bilanciato e posizionare le cellule sul ghiaccio.
10. Rimuovere una porzione (10-100 μl) della sospensione cellulare e determinare la densità delle cellule vitali mediante esclusione blu tripano con un emocitometro.
11. Centrifuga a 300 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare ad una densità di 25.000-125.000 cellule vitali per μl.
12. Trasferire un volume adeguato della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 200 μl (tubo PCR) e posizionarlo sul ghiaccio.

2. Preparazione del sito chirurgico e degli strumenti

Nota: I guanti chirurgici sterili vengono indossati durante la procedura. A seconda delle esigenze di ogni istituzione, possono essere necessari abiti chirurgici, berretti e protezioni per il viso.

1. Preparare un banco disinfettato per la chirurgia dei roditori con aree adiacenti separate per la preparazione degli animali, il campo operativo e il recupero degli animali.
2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici in un'autoclave a vapore. Successivamente, utilizzare uno sterilizzatore di perline calde per sterilizzare gli strumenti quando si passa da un animale all'altro.

3. Induzione, Anestesia e Analgesia

Nota: Gli interventi chirurgici che superano i 15 minuti dal momento in cui i topi potrebbero essere anestetizzati richiedono una fonte di calore di contatto. Per prevenire l'ipotermia, ai topi viene fornita una fonte di calore (coperta di acqua calda circolante) durante i periodi pre e post-operatori.

1. Preparare il cocktail di ketamina/xiazina per l'anestesia di induzione in modo che ogni topo riceva ketamina 100 mg/kg e xiazina 10 mg/kg iniettando 10 μl del cocktail per grammo di peso corporeo.
2. La tabella 1. Cocktail di anestesia.

   	Concentrazione di scorte	Volume per prepararsi
   		un mouse	cinque topi	dieci topi
   Ketamina	100 mg/ml	25 μl	125 μl	250 μl
   Xiazina	100 mg/ml	2,5 μl	12,5 μl	25 μl
   Salina isotonica		223 μl	1.113 μl	2.225 μl
   totale		250 ul	1.250 μl	2.500 μl

3. Preparare la soluzione di chetoprofene per l'analgesia diluendo la soluzione stock (10 mg/ml) 1:20 in acqua sterile e priva di piogeni in modo che ogni topo riceva una dose di 5 mg/kg iniettando 10 μl della soluzione per grammo di peso corporeo.
4. Pesare e registrare il peso prechirurgico. I singoli pesi del mouse variano, ma generalmente vanno da 18-22 g.
5. Iniettare 10 μl del cocktail chetamina/xiazina per grammo di peso corporeo del topo nello spazio intraperitoneale con una siringa per insulina. Ad esempio, iniettare 200 μl per un topo da 20 g.
6. Determinare se il mouse è completamente anestetizzato dal pizzico della gamba posteriore. Generalmente ci vogliono 3-5 minuti perché il mouse non si ritiri più dal pizzico.
7. Iniettare 10 μl della soluzione di chetoprofene per grammo di peso corporeo del topo per via sottocutanea nella pelle sciolta del fianco con una siringa per insulina. Ad esempio, iniettare 200 μl per un topo da 20 g.
8. Radere i capelli sul cranio con le tosaerba, strofinare il cuoio capelluto esposto con povidone-iodio usando un applicatore a punta di cotone e quindi pulire un tampone alcolico. Ripetere questi passaggi, scrub povidone-iodio e salvietta alcolica, altre due volte.
9. Applicare unguento oftalmico agli occhi del topo.
10. Fai un'incisione della linea mediana di 1 cm che si estende da dietro le orecchie a proprio davanti agli occhi con una lama sterile del bisturi.
11. Posizionare il mouse sotto un mirino di sezionamento ed esporre il cranio per identificare le linee di sutura. Utilizzando movimenti circolari con un trapano, centrare un foro di bava laterale di 2,5 mm al bregma e 1 mm posteriore alla sutura coronale.

4. Trapianto intracranale

Nota: I volumi di iniezione superiori a 2,5 μl possono essere letali per i topi.

1. Posizionare il mouse su un telaio stereotattico agganciando gli incisivi superiori sopra la barra incisiva e applicando il morsetto del naso in modo che il cranio sia saldamente tenuto in posizione neutra.
2. Disegnare 5-10 μl delle cellule in un tubo di microcentrifugo su e giù più volte in una siringa Hamilton da 10 μl bloccata nel supporto della sonda del manipolatore stereotattico per mescolare le sospensioni ed eliminare le bolle. Deprimere lo stantuffo in modo che la siringa sia caricata con 2 μl (il volume adeguato per iniettare un animale).
3. Tirare il bordo laterale dell'incisione cutanea per esporre il foro di bava e, con il micromanipolatore, introdurre l'ago nel foro di bava in modo che la porzione smussata sia appena sotto la superficie del cranio.
   1. Far avanzare l'ago di 3 mm e quindi ritirare l'ago di 0,5 mm per creare uno spazio per l'iniezione.
   2. Far avanzare lentamente lo stantuffo per oltre 30 secondi e quindi lasciare che l'ago rimanga nel cervello per altri 2 minuti. Prelevare gradualmente l'ago salendo di 0,5 mm e aspettando altri 30 secondi prima di rimuovere l'ago dal cervello.
4. Rimuovere il mouse dal telaio stereotattico e chiudere la ferita con un'autoclip.
5. Posizionare il mouse su un tampone riscaldante per mantenere la temperatura corporea e monitorare continuamente il modello di respirazione e il colore delle mucose e dei tessuti esposti (suole dei piedi).
6. Posizionare il topo in una gabbia di microisolatore sterile una volta recuperato completamente dall'anestesia (sternale e ambulatoriale) e restituirlo alla struttura abitativa degli animali.

5. Cura e osservazione degli animali post-impianto

Nota: L'indicazione più affidabile di innesto tumorale e crescita infiltrativa è una perdita di peso graduale e sostenuta accompagnata dallo sviluppo di postura intuizioneta e pelo ruvido. In rare occasioni, si nota deficit neurologici che includono atassia, paresi e convulsioni. Gli xenoinnesti primari ortotopici sono altamente invasivi e si sviluppano per un lungo periodo di tempo. I topi manifestano in genere sintomi di crescita tumorale 3-6 mesi dopo il trapianto.

1. Osserva quotidianamente topi con xenoinnesti ortotopici per l'assunzione di cibo e acqua, comportamento, toelettatura e segni di infezione nel sito di incisione.
2. Somministrare chetoprofene (5 mg/kg per via sottocutanea, 1-2 volte al giorno) se si osserva dolore o angoscia postoperatoriamente.
3. Rimuovere le clip automatiche 8-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
4. Pesare i topi settimanalmente.
5. Monitorare i segni e i sintomi dell'innesto tumorale.

6. Raccolta del tumore

Nota: Con questo metodo, la prima fetta coronale (#1) contiene l'aspetto posteriore dei bulbi olfattivi e l'aspetto anteriore dei lobi frontali. Il tumore innestato è più abbondante nell'emisfero destro delle successive 3 fette coronali (fetta #2, #3 e #4) e la vista di iniezione è regolarmente contenuta nella fetta coronale #3. A seconda delle esigenze sperimentali, il materiale può essere utilizzato per il passaggio tumorale, sezioni di tessuto congelato, sezioni di tessuto incorporato di paraffina fissa formalina, citometria del flusso del tessuto dissociato, coltura cellulare o lysati per analisi di DNA, RNA o proteine. Parti del tumore possono essere crioconservate per esigenze future con vitalità cellulare che vanno dall'80 al 95%.

1. Eutanasia dei topi per esposizione prolungata all'anidride carbonica seguita da lussazione cervicale.
2. Decapitare i topi eutanasiati alla base del cervello (livello di forame magnum) con un paio più grande di forbici chirurgiche e estrarre la pelle dall'incisione in avanti per esporre completamente il cranio.
3. Rimuovi il cervello.
   1. Inserire una punta di coppia di forbici chirurgiche fini nell'aspetto laterale del forame magnum al livello del meato uditivo esterno sinistro per tagliare l'osso occipitale lungo il lato sinistro del cranio. Eseguire lo stesso taglio sul lato destro.
   2. Tagliare l'osso occipitale lungo un piano coronale da un meato uditivo esterno all'altro e rimuovere l'osso per esporre il cervelletto.
   3. Tagliare le placche ossee nasali tra gli occhi.
   4. Tagliare la sutura sagittale tagliando posteriormente lungo la sutura sagittale dalle placche ossee nasali al bregma. Completare l'incisione della linea mediana lungo la sutura sagittale tagliando anteriormente dalla lambda al bregma.
   5. Inserire con cura la punta di un bel paio di force lungo l'apertura sagittale su ciascun lato per strappare qualsiasi adesione durale del cranio al cervello e quindi sbucciare le due metà del cranio lateralmente per esporre dorsalmente il cervello e i bulbi olfattivi.
   6. Far scorrere le forcep tra l'aspetto ventrale dei bulbi olfattivi e il cranio per liberare eventuali aderenze.
   7. Inclinare il cranio verso l'indietro per consentire al cervello di essere retratti in modo che l'ottica e altri nervi cranici siano esposti. Sever i nervi cranici per rilasciare il cervello in un piatto contenente PBS sterile.
4. Trasferire il cervello con una spatola di pesatura su un filtro a fette a matrice e generare fette coronali da 2 mm con lamette da barba.
5. Disporre le fette coronali in un piatto contenente PBS sterile per un'ulteriore ispezione visiva e un'ulteriore lavorazione dei tessuti.

7. Crioconservazione tumorale

1. Preparare una soluzione stock di mezzo di crioconservazione.
   1. Aggiungere 50 ml di integratore di proliferazione, 5 ml di penicillina 100x e soluzione di streptomicina e 450 μl di 0,2% di eparina a 450 ml di mezzo basale.
   2. Conservare la soluzione stock a 4 °C protetta dalla luce.
2. Preparare una soluzione funzionante di mezzo di crioconservazione.
   1. Unire 47,5 ml di mezzo di crioconservazione e 2,5 ml di DMSO sterile in un tubo conico in polipropilene da 50 ml e mescolare bene.
   2. Aliquota 1,0 ml di soluzione di lavoro per ogni crioviale e conservare a 4 °C protetto dalla luce.
3. Posizionare una fetta coronale di cervello xenografato di 2 mm in un mezzo crioconservato contenente crioconservazione sul ghiaccio.
4. Cappuccio stretto il flaconcino e posizionarlo in un contenitore di congelamento a -80 °C. Trasferire il criovio il giorno seguente in un serbatoio di azoto liquido per una conservazione più lunga.

Risultati

Le cellule di glioma dissociate vengono trapiantate direttamente nel cervello di topi immunocompromessi per ottenere linee primarie di xenograft ortotopico. Ad ogni campione tumorale viene assegnato un numero randomizzato prima del trapianto, come parte del processo di deidentificazione per rimuovere le informazioni sanitarie protette. A tale scopo utilizziamo un numero di database REDcap a 5 cifre. La figura 1 illustra il processo e la nomenclatura per stabilire una linea di xenograft da un glioblastoma...

Discussione

Linee cellulari coltivate, xenografti e topi geneticamente modificati sono i metodi più comuni per modellare i gliomi e ci sono benefici e limitazioni distinti per ogni sistema^{modello 3,13,14}. I benefici rilevanti degli xenografti di glioma ortotopico primario includono la crescita infiltrativa che caratterizza i gliomi diffusi e la ritenzione di alterazioni genetiche e importanti meccanismi di segnalazione che possono essere estremamente difficili da mantenere nelle cellule di glioma coltivate. Ad esempio, <...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040-133
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corp.	LK003150
Trypan blue solution 0.4%	Life Technologies	15250061
Ketamine HCl	Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
Xylazine HCl
Ketoprofen
Ophthalmic ointment
Povidone-iodine	Fisher Scientific	190061617
Cryopreservation medium and proliferation supplement	StemCell Technologies	05751
0.2% Heparin sodium salt in PBS	StemCell Technologies	07980
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D6250-5X10ML
NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	NSG mice
Anti-human vimentin antibody	Dako	M7020	Use 1:200 to 1:800
Anti-human IDH1 R132H antibody	Dianova	DIA-H09	Use 1:100 to 1:400
Centrifuge with swinging bucket rotor
Pipetter with dispensing speed control
Disposable hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-100
Sterile surgical gloves	Fisher Scientific	11-388128
Disposable gown	Fisher Scientific	18-567
Surgical mask	Fisher Scientific	19-120-1256
Tuberculin syringe	BD	305620
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-246-073
Portable electronic scale	Fisher Scientific	01-919-33
Zoom stereomicroscope
Surgical clipper	Stoelting	51465
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades, #10
Stereotaxic instrument	Stoelting	51730
High-speed drill	Stoelting	51449
Drill bit, 0.6 mm	Stoelting	514552
Hamilton syringe	Hamilton	80336
Autoclip, 9 mm	BD	427630
Circulating water warming pad	Kent Scientific	TP-700 TP-1215EA
Hot bead dry sterilizer	Kent Scientific	INS300850
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11
Spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-30
Semimicro spatulas	Fisher Scientific	14374
Mouse brain slicer matrix	Zivic Instruments	BSMAS002-1
Cryogenic storage vials	Fisher Scientific	12-567-501