Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Riepilogo

Qui descritto è un metodo per misurare direttamente scintille di calcio, le unità elementari di Ca ^{2 +} liberano dal reticolo sarcoplasmatico in fibre muscolari scheletriche intatte. Questo metodo utilizza osmotico stress-mediata attivazione di Ca ^{2 +} liberazione dal recettore della rianodina nelle fibre muscolari isolate. La dinamica e la capacità omeostatica di intracellulare di Ca ^{2 +} segnalazione possono essere utilizzati per valutare la funzione muscolare in salute e malattia.

Abstract

Il mantenimento omeostatico Ca ^{2 +} segnalazione è un processo fisiologico fondamentale nelle cellule viventi. Ca ^{2 +} scintille sono le unità elementari di Ca ^{2 +} Segnalazione di fibre muscolari striate che appaiono come altamente localizzata Ca ^{2 +} eventi di rilascio mediati dal recettore della rianodina (RyR) Ca ^{2 +} rilascio canali sul reticolo sarcoplasmatico (SR) membrana. Corretta valutazione del muscolo Ca ^{2 +} scintille potrebbero fornire informazioni sulle intracellulari di Ca ^{2 +} proprietà manipolazione dei muscoli striati sani e malati. Sebbene Ca ^{2 +} scintille eventi sono comunemente visto in cardiomiociti riposo, sono raramente osservati in riposo fibre muscolari scheletriche, quindi vi è la necessità di metodi per generare e analizzare scintille nelle fibre muscolari scheletriche.

Dettagliate ecco un protocollo sperimentale per la misurazione Ca ^{2 +} scintille in digitorm brevis (FDB) fibre muscolari isolate flessori con fluorescent Ca ^{2 +} indictors e la microscopia confocale a scansione laser. In questo approccio, fibre FDB isolati sono esposti a stress ipoosmotico transitorio seguito da un ritorno di soluzione fisiologica isotonica. In queste condizioni, un robusto Ca ^{2 +} scintille risposta viene rilevato adiacente alla membrana sarcolemmal in giovani fibre muscolari sani FDB. Alterato Ca ^{2 +} scintille risposta viene rilevato in fibre muscolari scheletriche distrofici o invecchiate. Questo approccio ha recentemente dimostrato che la segnalazione membrana delimitato coinvolge cross-talk tra inositolo (1,4,5)-recettore trifosfato (IP ₃ R) e RyR contribuisce a Ca ^{2 +} attivazione scintilla nel muscolo scheletrico. In sintesi, i nostri studi con stress osmotico indotto Ca ^{2 +} scintille hanno dimostrato che questa risposta intracellulare riflette un muscolo meccanismo di segnalazione in fisiologia e l'invecchiamento / stati di malattia, compresi i modelli murini di distrofia muscolare (topi mdx) o la sclerosi laterale amiotrofica (ALS modello).

Introduzione

Libero intracellulare Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) è un messaggero secondario versatile e importante che regola molteplici funzioni cellulari nelle cellule eccitabili come i neuroni, cardiaco, scheletrico e muscoli lisci (per recensione vedi Stutzmann e Mattson ^1). Regolamentata Ca ^{2 +} mobilitazione e di cross-talk tra reticolo sarcoplasmatico (SR) e T-tubulo (TT) membrane sono regolatori fondamentali della fisiologia muscolare. Inoltre, variazioni di Ca ^{2 +} segnalazione avevano dimostrato di essere un meccanismo alla base della disfunzione contrattile in varie malattie muscolari.

Ca ^{2 +} scintille sono localizzati gli eventi Ca ^{2 +} rilascio elementari provenienti dall'apertura del recettore rianodina (RyR) del canale sul reticolo sarcoplasmatico (SR) membrana ^2. Nel muscolo cardiaco, scintille verificano spontaneamente attraverso l'apertura del canale RyR2 da un Ca ^{2 +-indotti} Ca ^{2 +} release (CICR) Meccanismo di ^3-5. Nel muscolo scheletrico, RyR1 è strettamente controllata dal sensore di tensione sulla membrana ^6,7 TT. Così Ca ^{2 +} scintille vengono soppressi e raramente rilevate in condizioni di riposo nelle fibre muscolari scheletriche intatte. Fino a poco tempo, la membrana sarcolemmal doveva essere disturbato da vari metodi chimici o meccanici "skin" per disaccoppiare la soppressione del sensore di tensione in RyR1 e ha permesso di Ca ^{2 +} innescare eventi per essere rilevati nel muscolo scheletrico ^8,9. Un metodo precedentemente descritto richiesto permeabilizzazione della membrana delle fibre muscolari dal detersivo saponina ^10.

Nel 2003, abbiamo scoperto che lo stress sia ipoosmotico transitori o stress iperosmotico potrebbero indurre periferico Ca ^{2 +} scintille adiacente alla membrana sarcolemmal nelle fibre muscolari intatte ^11. Questo metodo è stato poi modificato per studiare il meccanismo molecolare e modulazione di Ca ^{2 +} rilascio e la dinamica ^12-16. Qui delineare i dettagli del nostro approccio sperimentale per l'induzione, il rilevamento e l'analisi di Ca ^{2 +} scintille nel muscolo scheletrico intatto. Presentiamo anche il programma di analisi scintilla su misura che può essere utilizzato per quantificare le proprietà elementari dei singoli Ca ^{2 +} scintille nel muscolo scheletrico, ad esempio la frequenza di accensione e ampiezza (Δ F/F0, che riflette la probabilità di apertura dei canali RyR e il Ca ^{2 +} carico all'interno del SR); tempo al picco (tempo di salita) e durata (FDHM, piena durata ampiezza metà-massimale) di scintille, così come la distribuzione spaziale di Ca ^{2 +} scintille. Inoltre, vi presentiamo la prova che pubblicitari alterato Ca ^{2 +} scintille ai diversi stati fisiopatologici nel muscolo scheletrico, come la distrofia muscolare e la sclerosi laterale amiotrofica.

Il vantaggio di questa tecnica comporta la capacità di misurare Ca ^{2 +} in relativamente isolatori passanticellule invecchiate, invece di nudo le fibre muscolari, permettendo la registrazione di Ca ^{2 +} scintille nelle condizioni più vicina alla fisiologica. Inoltre, il programma progettati su misura fornisce un calcolo più accurato delle proprietà della scintilla in relazione alle fibre muscolari.

Protocollo

1. Impostazione osmotica stress sistema di perfusione

La figura 1 è un protocollo schematica di calcio scintille valutazione in fibre muscolari scheletriche intatte.

1. Impostare un tre assi (xyz) micromanipolatore grado di posizionare l'estremità di uscita del sistema di perfusione contenente almeno due canali. Questo potrebbe essere fatto con barilotto monouso Luer-siringa con divisoria tre - vie Luer - Lok rubinetto per accendere e / o spegnere del flusso di soluzioni di perfusione. Questi canali perfusione dovrebbero poter erogare> 1 ml / min di soluzione attraverso una sola punta perfusione con> 0,2 mm di diametro.
2. Caricare due canali del sistema di perfusione, uno con isotonica Tyrode soluzione e l'altra con ipotonico Tyrode Solution.

2. Fibre Preparazione intatto singolo flessore Brevis (FDB) muscolari di topo

1. Togliere il piede da un mouse euthanized seguente NIH e IACUC linee guida utilizzando un paio di forbici dissezione pesanti tagliando attraverso la gamba sopra la caviglia.
2. Pin il piede su una camera di dissezione pieno di Minimal Ca ^{2 +} Soluzione Tyrode con la superficie plantare rivolta verso l'alto.
3. Sezionare FDB tagliando il tendine e delicatamente tirando la tendine per separare il muscolo dal tessuto circostante.
4. Concretizzare dissezione tagliando il tendine distale dove si dirama in singole cifre negli strati profondi del muscolo.
5. Trasferire il muscolo FDB prelevando con una pinza attraverso i suoi tendini per evitare ulteriori danni alle fibre muscolari e posto in un tubo con un'aliquota scongelato di Collagenase digestione Solution preriscaldata a 37 ° C.
6. Incubare la provetta contenente FDB verticale su un agitatore orbitale a 37 ° C per 60-90 min con una velocità di 160 rpm. Questo protocollo dissociazione fasci muscolari deve essere esaminato sperimentalmente per diversi ceppi di animali, Soprattutto per quelle malattie / fibre mutanti vulnerabili ai danni della membrana.
7. Trasferire il digerito FDB nel tubo con 700 ml di soluzione isotonica Tyrode e triturare delicatamente per liberare le fibre disegnando muscolo più volte attraverso una serie di punte 200 ml-micropipetta di diametro via via decrescente tramite taglio con una lama di rasoio pulita per rimuovere le punte 200 ml micropipetta. Per evitare di danneggiare le fibre nei muscoli particolarmente deboli dalla malattia, assicurarsi che la punta è abbastanza grande da permettere il fascio di fibre di passare senza attaccare. Non forzare il fascio attraverso troppo piccolo un'apertura.
8. Placcare le fibre FDB delicatamente toccando e risospendere fibre FDB nel tubo e poi estraendo 70 ml (1/10 di fibre totali) con una micropipetta taglio 200 ml al centro di un piatto Delta TPG 35 millimetri contenente 1 ml di isotonica Tyrode soluzione per ridurre la diffusione in tutto il piatto.
9. Determinare il numero di intatte singole fibre in dish utilizzando un microscopio di dissezione. Aggiungere ulteriori aliquote di fibre FDB avere 3-4 fibre intatte sul piatto.
10. Conservare le fibre muscolari isolate supplementari a 4 ° C ed utilizzare entro 6 ore.

3. Fluo-04:00 Dye Caricamento e Ca ^{2 +} Imaging (Sparks Measurement)

1. Trasferimento 500 ml di soluzione isotonica Tyrode dal piatto con fibre di FDB placcati in una provetta da 10 ml Fluo-04:00 magazzino (1 mm), mescolare e aggiungere di nuovo al piatto per una finale Fluo-4 AM concentrazione di 10 mm. In alternativa, l'acido Pluronic può essere usato per aumentare l'efficienza colorante di caricamento.
2. Caricare per 60 minuti a temperatura ambiente al buio.
3. Lavare le fibre disegnando con cautela 500 ml di Fluo-4-AM contenente isotonica Tyrode soluzione dal piatto con una uncut 200 ml-plastica punta micropipetta e sostituirlo con uguale volume di fresca isotonica Tyrode Solution.
4. Ripetere questa operazione altre 3 volte.
5. Per visualizzare la funzione mitocondriale, trasferire 500 ml di Isotonic Tyrode soluzione dal piatto con fibre di FDB in una provetta con 5 ml TMRE magazzino (1 mm), mescolare e aggiungere di nuovo al piatto per una concentrazione finale di 50 nM.
6. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
7. Lavare le fibre disegnando con cautela 500 ml di TMRE contenente isotonica Tyrode soluzione dal piatto con una uncut ml punta micropipetta 200 plastica e sostituirlo con uguale volume di fresca isotonica Tyrode Solution.
8. Ripetere questa operazione altre 3 volte.
9. Trasferire il piatto al microscopio confocale e selezionare una fibra intatta con striature chiare e una membrana sarcolemmal liscio per la sperimentazione.
10. Posizionare la punta del sistema di perfusione 400-500 micron di distanza dalla fibra muscolare bersaglio e fuori centro utilizzando i controlli micromanipolatore.
11. Inizia flusso del isotonica Tyrode soluzione per garantire la fibra FDB resta al suo posto.
12. Registrare il segnale di fluorescenza di Fluo-04:00 con un obiettivo 40X immersione in olio ed emozionare Fluo-04:00 con unalaser argon (eccitazione lunghezza d'onda di 488 nm) e di emissione registrare segnali (lunghezza d'onda 510-580 nm). L'intensità del segnale fluorescente è proporzionale al livello relativo di concentrazione intracellulare ^{Ca2 +} ([Ca ^{2 +]} _i).
13. Indurre Ca ^{2 +} transitori modificando la pressione osmotica della soluzione extracellulare per produrre stress osmotico sulla fibra. Inizialmente profumato le fibre con una soluzione isotonica Tyrode (290 mOsm) (raccolta di base per 60 sec) e poi con soluzione ipotonica Tyrode (170 mOsm) per 100 sec per indurre gonfiore. Profumato le fibre FDB torna con una soluzione isotonica Tyrode. Generalmente, un solo shock osmotico è applicato ad una singola fibra intatta in un delta piatto TPG e gli eventi di accensione ultimo 10 min per l'acquisizione dati.
14. Record localizzazione spaziale di Ca ^{2 +} scintille (Figura 2) con un tempo di serie di XY immagini bidimensionali con velocità di scansione di 166 lps (linee per secondo, e EAlinea ch composta da 512 pixel conseguente 3.08 sec / telaio) per ciascuna condizione di isotonica (1 min), stress ipotonico (100 sec) e stress post-ipotonico (5 min). Segnali negozio per l'analisi offline per valutare la distribuzione e la frequenza di Ca ^{2 +} scintille dopo il completamento della sperimentazione.
15. Trovare una nuova fibra su un nuovo piatto e seguire lo stesso protocollo di shock osmotico per indurre Ca ^{2 +} transitori. Utilizzare una modalità (xt) (512 pixel in lunghezza, frequenza di campionamento di 2 scan msec / linea di scansione linea confocale per registrare Ca ^{2 +} transitori per un minuto (cioè 30.000 righe) con la linea di scansione confocale posto direttamente sotto la membrana sarcolemmal (Figura 3 ). Modificare la linea di scansione a diversi piani focali per registrare tre serie sequenziale (a intervalli di 1 min) di linescans per l'analisi della grandezza e cinetica dei singoli Ca ^{2 +} scintille.

4. Analisi dei dati

1. Raccogliere un gran numero discansione lineare xt traccia per valutare la morfologia e la cinetica dei singoli parametri di Ca ^{2 +} scintille, vale a dire l'ampiezza (F / F _0; dove F ₀ è il riposo di Ca ^{2 +} fluorescenza), tempo di salita, tempo di picco, la durata (FDHM , tutta la durata a metà grandezza), e ampiezza spaziale (FWHM, piena larghezza a metà grandezza) delle scintille registrati. Questi parametri rappresentano le proprietà di gating di base del RYR Ca ^{2 +} canali come il Ca ^{2 +} flux (ampiezza), e la cinetica di comando dei RyRs (durata).
2. Analizzare i dati di immagini digitali con un algoritmo semi-automatico personalizzato sviluppato che è stato creato con il linguaggio di elaborazione delle immagini IDL (Interactive Data Language), come descritto in precedenza ^11,16. Poiché la cinetica uniche di Ca ^{2 +} di stampa nel caso di Ca ^{2 +} scintille indotte in fibre FDB da stress osmotico, è meglio combinare le funzioni manuali e automatizzati di Ca ^{2 +} innescare eventil'identificazione e il trattamento con questi programmi di analisi di immagine personalizzata-build ^11. Questo algoritmo è molto utile quando è necessario individuare manualmente il ROI (regione di interesse) in alcuni modelli di malattia muscolare. Una volta che il ROI è definito, l'algoritmo potrebbe derivare automaticamente i parametri di accensione di cui sopra che potrebbero poi essere esportati in file Excel. In alternativa, il software di elaborazione delle immagini a disposizione del pubblico, ad esempio SparkMaster in ImageJ, può essere utilizzata per definire le proprietà cinetiche di Ca ^{2 +} scintille e la loro distribuzione spaziale nel muscolo scheletrico ^17.

Risultati

Studi precedenti hanno mostrato che lo stress ipoosmotico transitori indotti periferico Ca ^{2 +} scintille adiacente alla membrana sarcolemmal nelle fibre muscolari intatte ^11. Figura 1 mostra le immagini delle fibre muscolari intatte singole con membrana sarcolemmal liscia e caratteristiche striature chiare. Figura 2 è tipica Ca ^{2 +} scintille (come immagini XY) sono stati indotti da (100 sec) trattamento transitorio con una soluzione ipoosmotico...

Discussione

Questo metodo di valutazione Ca ^{2 +} scintille nel muscolo scheletrico intatto è un utile strumento per la fisiologia muscolare e ricerca di malattia. Abbiamo dimostrato che la risposta Ca ^{2 +} scintilla è stato alterato in condizioni diverse, comprese distrofia muscolare ^11, invecchiamento ^{18, _19,} così come nella sclerosi laterale amiotrofica ^20. Il nostro recente studio ha anche rivelato l'accoppiamento funzionale tra IP ₃ recettore e Ry...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60 mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become a clear, colorless solid substrate.
60 mm glass Petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 Axis Micromanipulator	Narishige International	MHW-3
Temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation