High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano

Riepilogo

Nel corso degli ultimi anni, saggi cellulari vivi sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni di superficie e conformazionale. Qui, descriviamo un metodo con elevate throughput citometria consentire l'analisi di grandi coorti di pazienti. Individuazione di anticorpi romanzo migliorare la diagnosi e il trattamento di disturbi immuno-mediata.

Abstract

Nel corso degli ultimi anni, gli anticorpi contro le proteine ​​di superficie e conformazionali coinvolti nella neurotrasmissione sono state rilevate nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale nei bambini e negli adulti. Questi anticorpi sono stati utilizzati per guidare la diagnosi e il trattamento. Saggi cellulari hanno migliorato il rilevamento di anticorpi nel siero del paziente. Essi si basano sulla superficie espressione di antigeni cerebrali sulle cellule eucariotiche, che vengono poi incubate con sieri diluiti paziente seguito da anticorpi secondari coniugati con fluorocromi. Dopo il lavaggio, il legame anticorpo secondario viene quindi analizzata mediante citometria a flusso. Il nostro gruppo ha sviluppato un flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule-live per rilevare in modo affidabile gli anticorpi contro recettori dei neurotrasmettitori specifici. Questo metodo di citometria a flusso è dritto in avanti, quantitativa, efficiente, e l'uso di un sistema di campionamento ad alta velocità permette di grandi coorti di pazienti di essere facilmente analizzati in un breve lasso di tempo. Inoltre, questa cella basata comedire che può essere facilmente adattato per rilevare gli anticorpi a molti diversi target antigenici, sia dal sistema nervoso centrale e la periferia. Alla scoperta di biomarcatori supplementari romanzo di anticorpi consentirà una diagnosi tempestiva e accurata e migliorare il trattamento dei disturbi immuno-mediate.

Introduzione

Negli ultimi anni, sono state individuate forme autoimmuni del sistema nervoso centrale (SNC) malattie. E 'stato dimostrato che queste malattie sono associate e definiti dalla presenza di autoanticorpi. Questi anticorpi si legano ai recettori neuronali o proteine ​​sinaptiche coinvolte nella neurotrasmissione ^1,2. Sono stati rilevati diversi antigeni, come recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR) ^3-5, recettore γ-amminobutirrico B (GABA _B) recettore ^6, α-ammino-3-idrossi-5-metil-4- L'acido isoxazolepropionic (AMPA) recettore ^7, canale del potassio voltaggio-dipendenti (anti-VGKC) proteine ​​associate: leucina-ricchi glioma attivato 1 proteina (LGL-1) e contattonel-proteina associata 2 (capsr2) ^8,9, glutammato recettore ^5,10 , e la dopamina-2 recettore (D2R) ^11. In passato, questi disturbi autoimmuni del sistema nervoso centrale (principalmente chiamati encefalite) erano spesso non diagnosticata e non trattata. Questi biomarcatori anticorpi romanzo, ad esempio,NMDAR anticorpo o anticorpi D2R, hanno sostanzialmente migliorato la diagnosi e la consapevolezza, e hanno aperto le opzioni di trattamento per i pazienti. Infatti, il trattamento precoce con immunoterapie è associata con una migliore esito ^11,12.

I metodi tradizionali per rilevare gli anticorpi, come immunoenzimatico assay (ELISA) e Western Blot sono stati utilizzati per la rilevazione di anticorpi nel siero. Tuttavia, essi non consentono facilmente riconoscimento di epitopi extracellulari o di superficie e, invece, possono rivelare immunoreattività verso un epitopo intracellulare. Inoltre, gli anticorpi che si legano al dominio extracellulare di proteine ​​importanti coinvolti nella neurotrasmissione sono suscettibili di essere ^2,3,7,13,14 patogeni. Pertanto, lo sviluppo di analisi accurate e sensibili per scoprire superficie cellulare pertinente o bersagli degli anticorpi extracellulare nei pazienti è fondamentale. Il metodo gold standard nel campo si basa sull'utilizzo di cellule vive, nelle cosiddette "cell-basaggi sed ". Questo metodo comporta l'espressione di un antigene sulla superficie di cellule di mammifero (molto spesso renali (293) HEK293 cellule embrionali umane) nella sua forma nativa mediante trasfezione di vettori contenenti la sequenza di cDNA completa l'antigene di interesse. Cellule nonpermeabilized live vengono poi incubate con il siero del paziente diluito e seguiti da fluorocromo coniugato immunoglobulina anti-umana (Ig) anticorpo secondario. Viene quindi rilevata l'intensità o livello di fluorescenza ed è associato al livello di legame autoanticorpi. Questa tecnica è specifico, come un unico antigene è iperespresso nelle cellule. Il ampiamente usato "read-out" più è stata l'analisi di microscopia confocale dopo immunocitochimica ^4,5,8-10. Tuttavia, citometria a flusso saggi cellulari sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi nei pazienti con malattie demielinizzanti ^15-17. In particolare, Waters et al. ¹⁵ rispetto individuazione di anticorpi utilizzando una vaschettael di tecniche di rilevazione degli anticorpi, tra cui saggi cellulari seguite da microscopio o flusso analisi di citometria, e ha mostrato la citometria a flusso saggio basato su cellule ad essere il metodo più sensibile, accurato e affidabile. Pertanto, citofluorimetria saggio basato su cellule è vantaggioso in quanto è quantitativa, non investigatore-dipendente, e non comporta alcun uso di materiale radioattivo. E 'anche conveniente in quanto consente grandi coorti di pazienti da analizzare in un breve lasso di tempo.

Più di recente, abbiamo ottimizzato un flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule di rilevare NMDAR anticorpi e anticorpi D2R nei pazienti con malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale ^11. Il nostro gruppo ha recentemente rilevato anticorpi NMDAR nel siero del paziente usando la citometria a flusso saggio basato su cellule. Questi sieri anticorpo-positivi NMDAR sono stati precedentemente analizzati usando la microscopia confocale e sono stati anche trovato positivo ^11. Questo protocollo delinea una citofluorimetria saggio basato su cellule per la rilevazione di conformation sensibile anticorpi CNS nel siero del paziente utilizzando un campionatore ad alto rendimento automatizzato.

Protocollo

1. Subclonaggio Strategia Per costruire pIRES2-EGFP Vector Encoding D2R o NMDAR

1. Ottenere full-length cDNA clone di D2R umana o NMDAR subunità 1 (NR1).
2. Scegliere un vettore di espressione, come pIRES2-EGFP, che è adatto per l'espressione di proteine ​​transmembrana con una proteina migliorata verde fluorescente (GFP) reporter sotto il controllo di un sito di entrata del ribosoma interno (IRES), permettendo sia antigeni e GFP essere coespressi in cellule separatamente.
3. Subclone cDNA umano all'interno pIRES2-EGFP vettoriale.
   1. Per subclonare cDNA, utilizzare appropriati enzimi di restrizione (ad esempio NheI e XhoI per l'uomo D2R cDNA).
   2. Inserire legare taglio cDNA entro ristretto pIRES2-EGFP vettoriale.
   3. Sequenza ligato pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vettore per verificare se il vettore contiene la sequenza corretta.
   4. Purificare e amplificare pIRES2-EGFP D2R o NMDAR vettore per un uso successivo in trasfezione.

DENOMINAZIONE "> 2. HEK293 Trasfezione cellulare Manifestazione d'neuronale Antigen

1. Cellule Cultura HEK293 in tessuto fiasche di coltura con il fresco di Dulbecco Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) completa di 4,5 g / L D-glucosio, L-glutammina e 110 mg / L piruvato di sodio supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 GlutaMAX mM e 50 pg / ml Gentamicina.
2. Staccare cellule HEK293 con tripsina e trasferimento in un tubo conico.
   1. Lavare le cellule per centrifugazione a 250 xg per 6 min e risospendere il pellet di cellule in DMEM fresco completo.
3. Contare le celle e sementi 6 pozzetti a circa 8 x 10 ⁵ cellule / pozzetto e cultura pernottamento in DMEM 2 ml a 37 ° C e 5% di CO ₂ in un incubatore.
4. Una volta che hanno raggiunto circa il 70% di confluenza, trasfezione le cellule HEK293 con pIRES2-EGFP NR1 ⁽⁺ cellule HEK293 ^NMDAR), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 ^{D2R +} cellule), e (cellule HEK293 ^CTL; controllo vettoriale) pIRES2-EGFP come segue.Mantenere alcune cellule HEK293 untransfected di risarcimento in seguito.
   1. Preparare il volume richiesto di miscela di trasfezione comprendente 2,5 ug di DNA, 200 microlitri 0,9% cloruro di sodio e 4 mg / ml polyethylenimine / pozzetto (ciascuna contenente 2 ml di DMEM fresco completo).
   2. Vortice immediatamente la miscela per 10 sec e incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti, prima di aggiungere volume di miscela di trasfezione ai pozzetti appropriati.
   3. Coprire la piastra, avvolgere i lati con Parafilm e centrifugare a 280 xg per 5 minuti per aiutare trasfezione cellulare.
   4. Rimuovere il Parafilm e poi posto in incubatrice alla cultura a 37 ° C.
   5. Sostituire la cultura dei media 18 ore più tardi con DMEM fresco completo, e mantenere in coltura per un altro 72 hr.
   6. Facoltativo: 72 ore dopo la trasfezione, le cellule transfettate possono essere selezionati mediante coltura in DMEM completo supplementato con 250 ug / ml Geneticin, al fine di ottenere un policlonale trasfettante stabile.

3. Citometria a flusso test cellulare per il rilevamento di anticorpi alla superficie antigeni neuronali

1. Staccare HEK293 ^{NMDAR +,} HEK293 ^{D2R +,} e cellule HEK293 ^CTL mediante incubazione con 500 microlitri / pozzetto Versene per circa 5 min a 37 ° C.
   1. Risospendere in 2ml/well di PBS (-Ca ^{2 +} /-Mg ^{2 +)} integrato con il 2% FBS (PBS / FBS) e trasferimento a 15 ml o 50 ml tubo conico.
   2. Lavare le cellule per centrifugazione a 250 xg per 6 min e risospendere il pellet di cellule in 15-50 ml di PBS / FBS. Ripetere il lavaggio 2x.
   3. Contare le cellule e poi risospendere in PBS / FBS a 1 x 10 ⁶ cellule / ml.
2. Progettare il modello a 96 pozzetti per l'acquisizione citometria a flusso, visto che ⁺ cellule HEK293 ^{D2R +} o HEK293 ^NMDAR, così come le cellule HEK293 ^CTL dovranno essere incubate con ciascun campione clinico o anticorpo primario.
3. Cellule seme in una piastra a 96 pozzetti V-bottom a 50.000 cellule / noill secondo la citometria a flusso template di acquisizione.
4. Agglomerare le cellule per centrifugazione della piastra a 96 pozzetti a 450 xg per 5 min e rimuovere delicatamente il supernatante utilizzando una pipetta multicanale elettronica o manuale, inclinando la piastra su un angolo e facendo attenzione a non aspirare il pellet di cellule.
5. Incubare HEK293 ^{D2R +,} HEK293 ^{NMDAR +,} e le cellule HEK293 ^CTL per 1 ora a temperatura ambiente al buio con:
   1. Diluizioni seriali di anticorpo primario al fine di valutare l'espressione dell'antigene di superficie.
   2. I campioni dei pazienti al fine di rilevare gli anticorpi.
6. Usare adeguato flusso citometria a controlli di compensazione, ad esempio. cellule HEK293 untransfected non colorate, GFP ⁺ cellule HEK293 (AF647 ^-), e untransfected AF647 ⁺ HEK293 cellule (GFP).
7. Lavare le cellule per centrifugazione a 450 xg per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in 170 microlitri di PBS / FBS. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte.
8. Incubare le cellule per 1 hr alla RT al buio con diluizione 1:100 di AF647 coniugato anticorpo secondario (anti-IgG umane per il siero del paziente e anti-topo IgG per anticorpi primari anti-NR1 o anti-D2R).
9. Lavare le cellule tre volte, come al punto 3.7, e risospendere in 35 microlitri di PBS / FBS per citometria a flusso acquisizione cellulare.
10. Impostare il campionatore ad alto rendimento (HTS) sul citofluorimetro (BDLSRII).
11. Acquisire 10.000 eventi / bene secondo la citometria a flusso template di acquisizione.
12. Export e poi analizzare i dati per l'analisi utilizzando un citometria a flusso pacchetto software, come ad esempio FlowJo v7.5:
    1. In primo luogo, porta le cellule HEK293 viventi basata su avanti (dimensione) e laterale (granularità) disperde.
    2. Ulteriori cancello cellule vive HEK293 basato su alta GFP-positività per analizzare solo le cellule trasfettate.
    3. Determinare l'intensità di fluorescenza media (MFI) del canale AF647 all'interno delle cellule GFP-positive vivi.
    4. Esportare dati in Excel o Prism per l'analisi:
       1. Plot cconcentrazioni del di anticorpo primario (anti-NMDAR o anticorpo anti-D2R) contro l'MFI ottenuti dalle cellule incubate con questi anticorpi.
       2. Per ciascun campione e controllo, determinare il ΔMFI sottraendo il MFI delle cellule HEK293 ^CTL dal MFI del HEK293 ^{D2R +} o ^{+ NMDAR} cellule HEK293, rispettivamente.
       3. Calcolare la soglia di positività anticorpale con l'aggiunta di tre deviazioni standard sopra la ΔMFI media della coorte di controllo.
       4. Singoli campioni Plot raggruppati in base al loro tipo di siero su un grafico e rappresentano la soglia come una linea.

Risultati

Cellule vive HEK293 ^{D2R +} e HEK293 ^CTL sono stati acquisiti al citofluorimetro utilizzando un campionatore high-throughput. Durante l'analisi, le cellule sono state gated basato su forward scatter (dimensione) e parametri (granularità) (Figure 1A e 1D) side scatter. Cellule HEK293 trasfettate espressi molecola reporter, GFP, nel citoplasma, e le cellule non trasfettate sono stati esclusi dall'analisi (Figure 1B e 1E). All&...

Discussione

Questo articolo descrive una nuova applicazione di citometria a flusso saggio basato su cellule in tempo reale per individuare gli anticorpi specifici mirati proteine ​​neuronali superficie cellulare utilizzando un campionatore high-throughput. Utilizzando questa tecnica, si segnala che un sottogruppo di pazienti affetti da malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale hanno anticorpi sierici di superficie NMDAR o alla superficie D2R.

Passi essenziali per la rilevazione ottimale degli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180