Millisecondo conformazionali Variazioni proteine ​​risolti dal Photothermal Rinvio del raggio

Riepilogo

Qui riportiamo un'applicazione della tecnica deflessione del fascio photothermal in combinazione con un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, per monitorare microsecondi e millisecondi dinamica ed energetica di cambiamenti strutturali connessi con l'associazione calcio per un sensore calcio neuronale, Downstream elemento di regolazione Antagonista Modulator .

Abstract

Deflessione del fascio Photothermal insieme con la foto-acustica calorimetria e griglia termica appartiene alla famiglia dei metodi fototermiche che controllano il volume e il tempo di entalpia profilo cambiamenti di luce indotti cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​sulla microsecondo per millisecondo scale temporali che non sono accessibili con fermata tradizionale -flow strumenti. Inoltre, poiché le variazioni complessiva del volume e / o entalpia vengono sondati, queste tecniche possono essere applicate a proteine ​​e altre biomacromolecole che mancano di un fluoroforo e o un'etichetta cromoforo. Per monitorare la dinamica ed energetica dei cambiamenti strutturali connessi con Ca ^{2 +} vincolante ai trasduttori di calcio, tali sensori di calcio neuronali, un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, è impiegato per foto-trigger un facile (τ <20 msec) aumento del calcio libero variazioni di concentrazione e il volume associato e entalpia vengono sondati con fascio fototermica tecnica di deflessione.

Introduzione

Photo-thermal metodi come la calorimetria fotoacustica, deflessione del fascio fototermica (PDB), e griglia transitoria accoppiato con eccitazione laser nanosecondo rappresentano una potente alternativa a transitori spettroscopie ottiche per gli studi risolta in tempo di breve durata intermedi ^1,2. Contrariamente alle tecniche ottiche, come l'assorbimento transiente e spettroscopia IR, che monitorano il profilo temporale delle variazioni di assorbimento nella cromoforo circostante; tecniche fototermiche rilevano la dipendenza dal tempo delle variazioni di calore / volume e quindi sono strumenti preziosi per lo studio di profili temporali otticamente processi "silenti". Finora, calorimetria fotoacustica e griglia transitorio è stato applicato con successo per studiare la dinamica conformazionale dei processi foto-indotto compreso diatomic migrazione ligando in globine ^3,4, interazioni ligando con proteine ​​sensore di ossigeno FixL ^5, elettrone e trasporto di protoni in eme-rame ossidasi ⁶ unnd fotosistema II così come foto-isomerizzazione in rodopsina ⁷ e dinamica conformazionale in cryptochrome ^8.

Per espandere l'applicazione di tecniche fototermiche a sistemi biologici che mancano un cromoforo interno e / o fluoroforo, la tecnica PBD è stato combinato con l'uso di composti gabbia a foto-trigger un aumento della concentrazione di ligando / substrato giro di pochi microsecondi o superiore, a seconda sul composto gabbia. Questo approccio consente il monitoraggio delle dinamiche e l'energetica dei cambiamenti strutturali connessi con il ligando / substrato legame alle proteine ​​che mancano di un fluoroforo interno o cromofori e scala temporale che non sono accessibili con strumenti stop-flow commerciali. Qui un'applicazione di PBD per monitorare la termodinamica del composto gabbia, Ca ^{2 +} DM-nitrophen, foto-scissione e la cinetica di Ca ^{2 +} associazione al dominio C-terminale del sensore calcio neuronale Giùflusso di regolamentazione Elemento Antagonista modulatore (Dream) è presentato. Il Ca ^{2 +} è foto-rilasciato da Ca ^{2 +} DM-nitrophen entro 10 msec e riassocia a una gabbia unphotolysed con una costante di tempo di ~ 300 msec. D'altra parte, in presenza di apoDREAM si osserva una cinetica supplementare che si verificano sul millisecondo scala temporale e riflette il legame alla proteina ligando. L'applicazione del PBD per sondare transizioni conformazionali nei sistemi biologici è stata in qualche modo limitato a causa delle difficoltà strumentali; allineamento es arduo della sonda e fascio di pompa per ottenere un segnale forte e riproducibile PBD. Tuttavia, una progettazione meticolosa di una strumentazione set-up, un controllo preciso della temperatura, e un attento allineamento del fascio sonda e pompa forniscono un segnale coerente e robusto PBD che consente il monitoraggio di volume-tempo risolto e variazioni di entalpia su un ampio scala temporale da 10 msec a circa 200 msec. Inoltre, modificzioni della procedura sperimentale per assicurare la rilevazione di campione e di riferimento tracce sotto temperatura identica composizione del tampone, orientamento cella ottica, potenza del laser, ecc riduce significativamente l'errore sperimentale in volumi di reazione misurati ed entalpie.

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Protocollo

1. Preparazioni di esempio

1. Eseguire la preparazione dei campioni e tutte le manipolazioni del campione in una stanza buia per evitare un uncaging indesiderato.
2. Solubilizzare DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetossifenil) - N, N, N ', N'-tetrakis [(ossi-carbonile) metil] -1,2-ethanediamine) in HEPES 50 mM tampone, KCl 100 mM, pH 7,0 ad una concentrazione finale di 400 pM (ε = _350nm 4330 m ^-1 cm ^{-1 9).}
3. Aggiungere CaCl ₂ dalla soluzione stock 0,1 M per ottenere un rapporto desiderabile di [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen]. Per le proteine ​​con la K _d per Ca ^{2 +} associazione più grande di 10 pM, il rapporto di [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen] 1:1 è preferibile evitare inceppamenti di foto-rilasciato Ca ^{2 +} a uncaged DM-nitrophen . Infatti, considerando il valore _d K per DM-nitrophen essere 10 nm e la concentrazione totale di DM-nitrophen e Ca ^{2 +} essere 400 mM, ~ 90% di una proteina legante calciocon K _d = 10 pM saranno nel apoform. D'altra parte, per lo studio di Ca ^{2 +} legame alle proteine ​​con K _d <10 pM, è preferibile ridurre la [Ca ^{2 +]:} rapporto [DM-nitrophen] a 0,95 per evitare Ca ^{2 +} complessazione con l'apo- proteine ​​prima la gabbia foto-dissociazione.
4. Solubilizzare il composto di riferimento, K ₃ [Fe (III) (CN) _6] o Na ₂ CrO _4, nello stesso tampone come per il campione.

2. Impostazione dell'esperimento

1. La configurazione sperimentale di base è mostrata in Figura 2.
2. Utilizzare un foro per perno (P ₂₎ per regolare il diametro del fascio sonda (632 nm uscita del laser He-Ne, ~ potenza del laser 5 mW) a 1 mm e propagare il fascio sonda attraverso il centro di una cella posta in temperatura controllata supporto cella utilizzando un M ₁ specchio.
3. Usare uno specchio (M ₂₎ dietro il campione per centrare il fascio sondasu un centro di rivelatore sensibile posizione.
4. Focalizzare il fascio sonda sul centro del rivelatore in modo tale che la differenza di tensione tra i due diodi e peggiori due diodi e la differenza di tensione tra i due diodi sul lato sinistro e destro del rivelatore è zero.
5. Successivamente, forma un diametro del fascio di pompa, un'uscita 355 nm di Q-switched Nd: YAG, FWHM 5 nsec) utilizzando un foro 3 mm (P ₁₎ posta tra due specchi laser 355 nm.
6. Copropagate fascio di pompa attraverso il centro della cuvetta come mostrato nella Figura 2. E 'importante che entrambi i fasci laser sono propagati attraverso il centro della cella ottica in maniera quasi collineare avere un angolo di deviazione misurabile e quindi elevata ampiezza di segnale PBD. In condizioni sperimentali, l'angolo di intersezione dei fasci sonda e della pompa è inferiore a 15 °.
7. Utilizzare un composto di riferimento per allineare la sonda e pompafascio per ottenere un segnale PBD soddisfacente e un buon rapporto S / N e stabile ampiezza PBD su scale temporali più lunghi (~ 100 msec).
8. Regolare la posizione del fascio di pompa rispetto al fascio sonda da un adeguamento incrementale di 355 specchi laser nm.
9. Misurare l'ampiezza del segnale di riferimento PBD come una differenza tra due fotodiodi superiore e inferiore del rivelatore sensibile alla posizione. Il segnale PBD deve presentare un rapido aumento dell'ampiezza su una scala temporale veloce (<10 msec) e rimanere stabile su scala temporale 100 msec come mostrato nella Figura 3. Il colpo alla variabilità colpo dell'ampiezza PPB è entro il 5% dell'ampiezza del segnale e la riproducibilità del segnale è influenzata principalmente da vibrazioni.
10. Verificare la linearità della ampiezza del segnale PBD rispetto all'energia termica liberata misurando la dipendenza lineare del segnale PBD sulla potenza del laser di eccitazione e sul numero di Einstein assorbita, e _un= ^(1-10-A), dove A corrisponde alla assorbanza di riferimento alla lunghezza d'onda di eccitazione.
11. Mantenere la potenza del laser di sotto di circa 1.000 μJ e assorbanza del composto campione / riferimento alla lunghezza d'onda di eccitazione inferiore a 0,5 per evitare l'assorbimento multifotonico e diminuzione della potenza del fascio pompa, rispettivamente, e assicurare linearità del segnale PBD.

3. Misure PBD

1. Iniziare con la misura delle tracce PBD per il riferimento. Posizionare la soluzione del composto di riferimento in una cella di quarzo x 0,5 centimetri 1,0 centimetri x 1,0 cm o 1,0 cm, posizionare la cella nel supporto temperatura controllata. Entrambe le lunghezze del percorso prevedono paragonabile ampiezza PBD.
2. Rilevare il segnale di riferimento PBD in funzione della temperatura nell'intervallo di temperatura 16-35 ° C con l'incremento della temperatura di 3 ° C.
3. Ad ogni cambiamento di temperatura, controllare la posizione del fascio sonda sul rivelatore sensibile posizione e riregolare la posizione al centro del rivelatore, se necessario.
4. Controllare la linearità del segnale PBD in funzione della [(dn / dt) / C _p ρ] termine secondo l'equazione 2.
5. Porre la soluzione campione nella stessa cella ottica come per il composto di riferimento mantenendo lo stesso orientamento della cella ottica per la misurazione di riferimento.
6. Rileva le PBD tracce del campione nello stesso intervallo di temperatura per il riferimento e verificare la linearità della ampiezza del campione PBD rispetto al [(dn / dt) / C _p ρ] termine.

4. Analisi dei dati

L'entità della deformazione è direttamente proporzionale alla variazione di volume dovuto al riscaldamento del campione (ΔV _th) e variazione di volume non termico (ΔV _nonth) secondo l'equazione 1:

L'ampiezza del campione (A _S) E di riferimento (A _r) PBD segnale può essere descritto mediante equazioni 2 e 3, rispettivamente.

PBD segnale è direttamente proporzionale al parametro di risposta dello strumento (K) e il numero di Einstein assorbita (E _a). Il primo termine dell'equazione 2, (dn / dt) (1/ρC _p) Q, corrisponde alla variazione segnale a causa del calore ceduto al solvente. Il dn / dt termine rappresenta la variazione dipendente dalla temperatura nell'indice di rifrazione, ρ è la densità del solvente, C _p è la capacità termica. Tutti i parametri sono noti per l'acqua distillata e possono essere determinati per una soluzione tampone confrontando un segnale PBD per il composto di riferimento in acqua distillata e in un tampone appropriato. Q è la quantità di calore returned al solvente. Il ρ (dn / d ρ) è un termine costante unità-less che è indipendente dalla temperatura nell'intervallo di temperatura da 10-40 ° C ^10. Δn termine _abs corrisponde alla variazione dell'indice di rifrazione per la presenza di specie assorbenti nella soluzione ed è trascurabile se la lunghezza d'onda del fascio sonda viene spostata rispetto agli spettri di assorbimento di qualsiasi specie nella soluzione. Il segnale derivante dal composto di riferimento (A _r) è espressa dalla equazione 3 _{h ν} dove E è l'energia del fotone alla lunghezza d'onda di eccitazione, E _{h ν} = 80.5 kcal / mole per 355 nm di eccitazione.

1. Prendere l'ampiezza del segnale di riferimento PBD come differenza tra il segnale e pretrigger PBD alberino grilletto come dimostrato nella Figura 3. In modo simile, determinare l'ampiezza del digiuno (A _s ^veloce) e fase lenta (A _s ^lento) Del segnale del campione PBD.
2. Per eliminare il parametro di risposta dello strumento, K, scalare l'ampiezza del segnale campione PBD dall'ampiezza del segnale PBD per il riferimento. Il rapporto tra il segnale campione del segnale di riferimento dà Equazione 4 e può essere scritto come:
   
   
3. Utilizzando questa equazione, determinare il calore ceduto alla soluzione (Q) e variazione di volume non termico (ΔV _nonth) associato a una reazione di avviata dal coefficiente angolare e, rispettivamente, di un appezzamento di [(A _s / A _r) E _{h ν]} termine in funzione della temperatura dipendente termine [(dn / dt) (1/ρCp)].
4. Per determinare il volume di reazione e variazione di entalpia per la veloce e il processo lento, ridimensionare il volume osservato e variazione di entalpia per la resa quantica adatto secondo Equazioni 5-7.
   
   
   
   
   
   
   Per un processo a più stadi con cinetica che si verificano sulla scala temporale tra 10 msec ~ 200 msec, il volume e variazioni di entalpia associati alle singole fasi della reazione può essere determinato. Le ampiezze e durate dei singoli passi vengono analizzati inserendo i dati alla funzione F (t) che descrive il profilo temporale del volume e variazioni di entalpia.
   
   dove α ₀ corrisponde alla A _s ^veloce e α _i corrisponde ad A _s ^lento per ogni singolo processo e τ _i sono la durata delle singole fasi di reazione. Dalla dipendenza dalla temperatura della costante di velocità for singoli processi (k _i = 1 / τ _i) i parametri entalpia ed entropia di attivazione si può facilmente determinare utilizzando trame Eyring.

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Risultati

Un esempio rappresentativo di PBD tracce di Ca ^{2 +} photo-release di Ca ^{2 +} DM-nitrophen è mostrata in figura 3. La fase veloce corrisponde alla foto-scissione di Ca ^{2 +} DM-nitrophen e Ca ^{2 +} liberazione, mentre la fase lenta riflette Ca ^{2 +} legame alla gabbia nonphotolysed. La trama del PBD ampiezza campione per la fase veloce e lento scalato all'ampiezza del composto di riferimento in funzione del fattore dipendeva temperatura [C _p ...

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Discussione

Il principio fisico dietro metodi fototermiche è che una molecola fotoeccitati dissipa l'energia in eccesso tramite vibrazionale rilassamento allo stato fondamentale, con conseguente riscaldamento termico del ^1,12 solvente circostante. Per solventi come acqua, questo produce una rapida espansione del volume (ΔV _th). Molecole Eccitato statali possono anche subire processi fotochimici che si traducono in variazioni di volume non termici (ΔV _nonth) a causa di legame scissione / forma...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300