Imaging denaturate collagene fili<em&gt; In vivo</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Via Photo-triggered ibridazione di Caged collagene Mimetic peptidi

Riepilogo

Questa procedura dimostra in vivo vicino IR imaging di fluorescenza delle attività di rimodellamento del collagene nei topi, nonché ex vivo colorazione di collagene in sezioni di tessuto con gabbia collagene peptidi mimetici che possono essere foto-attivati ​​per ibridare con fili di collagene denaturato.

Abstract

Il collagene è un importante componente strutturale della matrice extracellulare che supporta la formazione di tessuto e manutenzione. Sebbene rimodellamento del collagene è parte integrante di rinnovo normale tessuto, eccessiva quantità di attività rimodellamento è coinvolto nei tumori, artrite e molte altre condizioni patologiche. Durante rimodellamento del collagene, la struttura a tripla elica di molecole di collagene è interrotto da proteasi nell'ambiente extracellulare. Inoltre, collageni presenti in molti campioni istologici sono parzialmente denaturate dai processi di fissazione e conservazione. Pertanto, questi filamenti di collagene denaturate possono servire come obiettivi efficaci per l'imaging biologico. Abbiamo già sviluppato un peptide di collagene mimetica in gabbia (CMP), che può essere foto-triggered per ibridare con fili di collagene denaturate formando la struttura a tripla elica, che è unica al collagene. Gli obiettivi generali di questa procedura sono i) per l'immagine filamenti di collagene denaturato resulting dalle normali attività di rimodellamento in vivo, e ii) per visualizzare collagene in ex sezioni di tessuto vivo utilizzando i CMP Caged foto-attivato. Per raggiungere ibridazione efficace e di successo in vivo ed ex vivo di imaging, CMP in gabbia fluorescente sono o-photo attivato immediatamente prima dell'iniezione endovenosa, o sono azionati direttamente su sezioni di tessuto. Normale scheletrico rimodellamento del collagene in topi nudi e collagene nelle sezioni prefissati topo di tessuto corneale sono ripreso in questa procedura. Il metodo di imaging basata sulla tecnologia ibridazione CMP-collagene qui presentato potrebbe portare ad una maggiore comprensione del processo di rimodellamento tissutale, nonché consentire lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici per le malattie associate all'attività elevato rimodellamento del collagene.

Introduzione

Il collagene, la proteina più abbondante nel mammifero, gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo dei tessuti e la rigenerazione sostenendo proliferazione e differenziazione delle cellule. Mentre collageni fibrosi (ad esempio di tipo I, II), nei tessuti connettivi dare resistenza meccanica ai tessuti, il collagene reticolare (tipo IV) formano impalcatura di base della membrana basale in cui le cellule si attaccano e formano tessuti organizzati. Rimodellamento del collagene coinvolge sia degradazione del collagene (da proteasi) e sintesi (promosso da fattori di crescita). Sebbene rimodellamento del collagene, per esempio in osso, fa parte del normale processo di rinnovamento dei tessuti, l'attività rimodellamento eccesso, o la sua presenza in posizioni anomale, indica tipicamente cicatrizzanti risposta ad un trauma o patologie croniche come il cancro, l'osteoporosi, l'artrite, e fibrosi ^1-4. La capacità di collageni immagine direttamente in fase di rimodellamento in vivo potrebbe portare alla comprensione dei progressiione di queste malattie, così come nuovi strumenti diagnostici e terapie. Ad esempio, l'imaging dal vivo in grado di fornire informazioni sulla gravità e la posizione delle malattie, e può anche essere utilizzato per valutare l'efficacia di nuovi agenti terapeutici. Multiphoton microscopia a scansione laser e generazione di seconda armonica sono state applicate a collageni fibrillari immagine per monitorare rimodellamento della matrice extracellulare in tumore in topi vivi ^5. Tuttavia, questa tecnica richiede animali da montare con le camere plica dorsale trasparenti, che è una procedura invasiva. Rappresentazione diretta e non invasiva di rimodellamento del collagene beneficerà di una sonda che si rivolge specificamente collagene in fase di ristrutturazione. Tale sonda è difficile preparare quanto deve distinguere i collageni rimodellamento dai collageni normali e mature, che sono abbondanti nei tessuti normali ^6.

Il collagene è costituito da proteine ​​struttura estremamente rara chiamata tripla elica, che èspaccati da proteasi come metalloproteinasi della matrice (MMP) durante rimodellamento del collagene. I frammenti di collagene spaccati perdono la loro struttura a tripla elica e diventano fili piegati (gelatina), ulteriormente digeriti da proteasi aspecifici ^1. E 'stato recentemente scoperto che il peptide mimetico collagene (CMP), che ha la propensione a piegare in struttura a tripla elica può rivolgono specificamente filamenti di collagene che si dissociano dal suo stato tripla elica da una denaturazione calore o da degradazione enzimatica ^1,7. L'associazione è guidata principalmente da tripla elica ibridazione tra CMP monomeriche e le ciocche di collagene denaturato. Perché CMP auto-assemblano in triple eliche omotrimerica a temperatura ambiente con poca forza trainante per il collagene ibridazione, un CMP in gabbia [(GPO) ₄ ^NB GPO (GPO) _4, designato come ^NB (GPO) _9, O: idrossiprolina], è stato sviluppato , che contiene un nitrobenzil foto distaccabilegruppo (NB) attaccato alla glicina centrale del peptide. Il gruppo gabbia NB impedisce stericamente il CMP di piegatura in tripla elica, ancora, la rimozione del gruppo gabbia per irraggiamento UV innesca subito la piegatura tripla elica del collagene e ibridazione ^1. Quando CMP monomeriche etichettati con vicino infrarosso (NIR) fluorofori sono sistematicamente consegnati a modello i topi, possono rivolgono specificamente e permettere imaging in vivo di collagene denaturate nei tessuti sottoposti a normale (per esempio in osso e la cartilagine) e patologici (ad esempio nei tumori) rimodellamento ¹ .

CMP fluorescente possono essere utilizzati anche per l'imaging collageni in sezioni di tessuto istologici. In studio istologico, i tessuti raccolti sono spesso conservati da fissazione per mantenere i componenti cellulari e la morfologia dei tessuti in generale dal deterioramento. Le procedure di fissaggio, che comprendono calore, e il trattamento con solventi organici e chimici cross-linking reagenti (ad esempio paraformaldeide), snaturare la struttura a tripla elica del collagene ^8. Questo denaturazione genera i siti per CMP ibridazione. E 'stato dimostrato che i CMP fluorescente possono legarsi specificamente a collageni in sezioni di tessuto fissate (ad esempio pelle, cornea, e osso) ancora più efficace di un anticorpo anti-collagene, che ha permesso l'identificazione facile di condizioni patologiche in tessuti del fegato fibrotici ^9. Il CMP rivolge fili di collagene denaturato contenenti sequenza amminoacidica di motivi tripla elica, che è comune a tutti i tipi di collagene. Pertanto CMP può essere considerato un ampio spettro agente collagene colorazione. Qui vi presentiamo procedure sperimentali dettagliate per i) l'imaging fili di collagene denaturato in vivo e collagene ii) visualizzando in ex sezioni di tessuto vivo con CMP Caged fluorescente. Un tag NIR, IR680, è stato coniugato al CMP gabbia per l'imaging dal vivo, while carboxyfluorescein (CF) è stato utilizzato nel tessuto lavoro colorazione per la sua compatibilità con microscopi a fluorescenza standard. Questo protocollo si concentra sulla applicazione di imaging del CMP, ritenuti correlati al rimodellamento del collagene. Metodi per la sintesi CMP possono essere trovati nelle precedenti relazioni ^1,7,9-15. In questo rapporto video, immagini tessuti scheletrici in topi normali e sezioni tissutali di topo cornea sono stati scelti per scopo dimostrativo, ma i metodi qui presentati possono essere facilmente applicati a molte patologie e modelli biologici che coinvolgono rimodellamento del collagene (ad esempio i tumori, la guarigione delle ferite), come nonché a quasi ogni campione di tessuto prefissata contenente collagene.

Protocollo

Tutti gli studi su animali sono state realizzate in conformità con le disposizioni della cura degli animali e del Comitato Usa Johns Hopkins.

1. Near Infrared (NIR) imaging di fluorescenza di collagene rimodellamento scheletrico in vivo

1. Photo-attivazione della iniezione vena CMP e la coda in gabbia
   1. Preparare 110 ml di soluzione di CMP gabbia per ciascun topo (20-30 g peso mouse): 100 ml di soluzione per il dosaggio, con un ulteriore 10 microlitri cuscino per la possibile perdita durante il trasferimento e l'iniezione. Mescolare 11 ml di ^IR680-Ahx-NB (GPO) ₉ soluzione madre (400 micron) con 11 ml di 100 mM cisteina in soluzione PBS sterile, quindi portare il volume complessivo a 110 ml con tampone 1x PBS. La soluzione peptide finale contiene 4 nmol di ^IR680-Ahx-NB (GPO) ₉ e 1 nmol di cisteina in 100 ml di soluzione di 1x PBS.
   2. Lentamente prelievi dagliw la soluzione peptide in una siringa da insulina 0,5 ml con una canna trasparente e un piccolo calibro (28-30 G) dell'ago, e con attenzione rimuovere le bolle d'aria. Accendere la lampada UV per permettere alla lampada di riscaldare per 2-5 min.
   3. Posizionare la siringa-peptide contenente direttamente sotto la lampada UV (365 nm,> 25 mW / cm ²⁾ per 5 minuti per consentire fotoattivazione.
   4. Nel frattempo, posizionare il mouse in un restrainer sotto una lampada riscaldata, etichettare il mouse con un pennarello indelebile sulla coda o altri metodi di identificazione come marchio auricolare o la punta del tatuaggio, e disinfettare la coda con il 70% di alcol.
   5. Subito dopo l'attivazione UV, iniettare 100 pl di-UV attivata ^IR680-Ahx-NB (GPO) ₉ soluzione nella vena della coda, preferenzialmente nella parte posteriore della coda. Posizionare il mouse torna alla gabbia dopo l'iniezione.
2. NIR imaging di fluorescenza di attività rimodellamento del collagene
   1. Setla conca del letto di imaging della termocamera impulso a 37 ° C utilizzando Pearl Impulse software 2.0.
   2. Ponga il mouse nude o rasati nella camera di induzione dell'anestesia contenente il 2% isoflurano in ossigeno. Verificare la profondità di anestesia piano dalla mancanza di movimento del mouse durante la manipolazione e monitorando la frequenza delle respirazioni (~ 1/sec).
   3. Dopo che il mouse è anestetizzato, aprire il cassetto Pearl imager, e mettere l'animale sul letto di imaging. Rimuovere rapidamente la spina cono, e far scorrere il muso del mouse all'interno del cono di tenere il mouse in anestesia (dal 2% isoflurano in ossigeno erogato a 2 L / min attraverso il cono naso) durante il processo di imaging. Una volta che il mouse è a posto, chiudere il cassetto.
   4. Quando lo strumento indica "ready" sul pannello software di immagine, fare clic su "canale 700", "luce bianca" e "85 micron" scatole seguito dal tasto "Acquisisci immagine". NIR (eccitazione 685 nm, emissione 720 nm), und foto a luce bianca saranno poi scattate con messa a fuoco automatica e l'esposizione.
   5. Quando la registrazione è completata, aprire il cassetto, girare il mouse e acquisire immagini da un'altra angolazione. Il mouse può essere posizionato con la sua parte anteriore (ventrale), posteriore (dorsale) o lati di fronte alla telecamera. Strette strisce di nastro possono essere utilizzati come sistemi di ritenuta per allungare gli arti per ottenere la migliore vista sulla regione di interesse (ad esempio gabbia toracica, caviglie e polsi).
   6. Un momento giusto per osservare la captazione scheletrica di IR680-CMP è compresa tra 24-96 ore dopo l'iniezione (HPI), sulla base del dosaggio (~ 4 nmol / mouse). Per acquisire immagini ad alta risoluzione, sacrificare il mouse per dislocazione cervicale mentre sotto anestesia profonda dopo 72 hpi, togliere la pelle (e capelli) con pinze e forbici chirurgiche, e immagine dal NIR fluorescenza come descritto sopra.
   7. Analizzare le immagini di fluorescenza NIR acquisite.

2. Visualizzazione di Collageni in ex vivoSezioni di tessuto; 0

1. Preparazione del materiale
   1. Preparare 1 ml di 10% (w / v) di BSA in acqua deionizzata. Scongelare 1 ml di siero di capra in un bagno d'acqua a temperatura ambiente. Tagliare alcuni pezzi di Parafilm delle dimensioni di circa 2 cm x 5 cm.
   2. Preparare 10 ml di tampone di bloccaggio miscelando 500 ml di siero di capra, 1 ml di PBS 10x e 8,5 ml di acqua deionizzata. Preparare 5 ml di tampone di diluizione CMP diluendo 50 ml di 10% (w / v) BSA con 4,45 ml di acqua deionizzata e 500 microlitri di PBS 10x.
   3. Diluire le soluzioni stock di carbossifluoresceina marcato gabbia CMP, CF ^NB (GPO) ₉ (480 micron), a 5 micron utilizzando il tampone di diluizione CMP. Concentrazione ottimale CMP varia 2,5-30 mM, a seconda del tipo di tessuto e la natura di campioni di tessuto. Un volume di 100 microlitri è raccomandato per la colorazione una sezione di tessuto diapositiva. Conservare il solut CMP formulatoioni nel buio.
   4. Lasciate il mouse scorre tessuto cornea portare a temperatura ambiente. Incubare i vetrini in tampone PBS 1x per 5 min. I tessuti cornea topo utilizzati in questa dimostrazione sono stati prefissati con 4% paraformaldeide in PBS per 1 ora, crioconservati in Tissue-Tek Ottobre medio, cryosectioned a 8 um di spessore, e montati su vetrini praticati.
2. Colorazione tissutale e di imaging
   1. Porre i vetrini in una camera umidificata. Per ciascun vetrino, applicano 0,5 ml di soluzione di blocco e incubare i vetrini per 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di saturazione tamponando i vetrini su un tovagliolo di carta.
   2. Applicare circa 100 ml di CF ^NB (GPO) ₉ soluzioni per coprire le sezioni di tessuto di ogni diapositiva. Incubare i vetrini per 2 minuti per consentire alla soluzione CMP di permeare i tessuti.
   3. Accendere la lampada UV. Quando la lampada è riscaldato, esporre il tessuto CMP coperto seZIONI alla luce UV per 6 minuti (365 nm, ~ 8 mW / cm ²⁾ per deproteggere i CMP gabbia. Dopo l'esposizione ai raggi UV, coprire le sezioni di tessuto di ogni diapositiva con un pezzo di Parafilm per evitare l'essiccazione. Porre i vetrini nella camera umida e incubare a 4 ° C per 2 ore.
   4. Preparare una diluizione 1:3,000 di soluzione DAPI in 1x PBS. Dopo CMP colorazione, rimuovere delicatamente il Parafilm con una pinza, e asciugare le diapositive su un tovagliolo di carta per rimuovere la soluzione in eccesso CMP. Applicare circa 100 ml di soluzione DAPI diluito per ciascun vetrino tessuto e incubare per 1 min a temperatura ambiente.
   5. Dopo la colorazione, immergere i vetrini in tampone PBS 1x in una vaschetta di colorazione per 5 min. Ripetere questa 3x in fresco 1x PBS per lavare agenti macchianti non associati.
   6. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio sulla sezione di tessuto e coprire con una scivolata copertura in vetro, evitando bolle d'aria. Mettere i vetrini in un vassoio diapositiva di cartone per proteggerli dalla luce.
   7. Immagine i fili di collagene (canale FITC) e nuclei cellulari (canale DAPI) nei vetrini di tessuto con un microscopio a fluorescenza.

Risultati

La Figura 1 mostra un tipico risultato di come foto-triggered IR680-Ahx-(GPO) ₉ distribuisce in un sano SKH1 femmina topo nudo dopo l'iniezione 24-96 hr postale. Essa mostra evidente accumulo CMP nello scheletro dopo il 24 HPI, a quel punto la maggior parte dei peptidi non legati sono stati in gran parte ripulito. Il processo di CMP ibridare con i trefoli di collagene rimodellamento sembra relativamente lento, soprattutto in contrasto con altre sonde di imaging peptide RGD (ad esempio ^16). Questo probabilmente è dovuto al tasso lento ripiegamento del collagene tripla elica ^17,18. Tuttavia, una volta ibridati, i trefoli CMP sono fortemente legati ai tessuti collagene, come solo lieve riduzione del segnale è visto dopo 24 hpi (Figura 1). A 96 hpi, l'immagine NIR fluorescenza del mouse dopo la rimozione della pelle dimostra chiaramente la captazione scheletrica di IR680-Ahx-(GPO) ₉ in spina dorsale e costole, nonché all'interno delle ginocchia, caviglie,polsi e mandibole inferiori (Figura 2A).

In ex vivo colorazione dei tessuti, foto-triggered fluorescenza marcata CMP Caged specificamente ibridano in filamenti di collagene denaturato in sezioni di tessuto. In Figura 3, CMP colorazione rivela chiaramente i fini fibrille di collagene parallele nello stroma corneale, che dimostra il suo uso come agente specifico colorazione collagene.

Figura 1. Seriali NIR immagini di fluorescenza di un topo nudo somministrati per via endovenosa con foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) ₉ mostra la captazione scheletrica in quattro giorni. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2. NIR immagini di fluorescenza di topi somministrati con la foto-decaged IR680-Ahx-(GPO) ₉ (A), gabbia ^IR680-Ahx-NB (GPO) ₉ senza esposizione ai raggi UV (B), prefolded tripla elica [IR680-Ahx-(GPO ) _{9] 3} (C), o calore dissociata singolo filamento IR680-Ahx-(GPO) ₉ (D) a 96 HPI dopo la rimozione della pelle. scheletrico di targeting dal CMP può essere osservata solo in A e D. Segnali di fluorescenza NIR sono mostrati in scala arcobaleno. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3. Micrografie fluorescenza di un co toposezione di tessuto rneal prefisso in paraformaldeide, e colorati con DAPI e la foto-triggered CF (GPO) ₉ utilizzando il protocollo 2, visualizzando denso stroma collagene (macchiata da CMP, in verde), così come epitelio cellulare e endotelio (macchiata di DAPI, in blu ) (barra della scala: 100 micron).

Discussione

Come si può vedere in questo protocollo, la consegna di CMP è semplice poiché la UV-attivazione dei CMP gabbia è l'unico passaggio aggiuntivo alla coda comune protocolli di iniezione vena ^19. La chiave è quello di iniettare le sonde peptide in uno stato a singolo filamento Uncaged e metastabile. Il gruppo gabbia impedisce CMP di auto-assemblaggio e vincolante di collagene (Figura 2b) fino a quando non viene rimosso dalla luce UV a questo punto il CMP inizia a piegare in tripla elica. La formulazione iniettabile contiene cisteina, che può reagire rapidamente con il gruppo gabbia spaccati durante l'irradiazione UV per minimizzare la tossicità. Numerosi topi con ceppi diversi (ad esempio SKH-1 e DR-1) sono stati testati utilizzando questa formulazione, e non abbiamo rilevare eventuali difetti di salute comportamentali o di altri in questi topi fino a sei mesi. Se l'iniezione non segue immediatamente dopo l'esposizione ai raggi UV, i CMP si piega in triple eliche omotrimerica, che non hanno capacità di ibridazione. Figura 2C mostra un caso estremo in cui prima dell'iniezione i CMP sono stati completamente riassemblati in triple eliche da tempo di ritardo lungo (> 2 giorni). Per aggirare questo problema, la soluzione CMP deve essere preparato in concentrazione relativamente bassa (ad es ~ 40 micron), e iniettato in topi subito dopo UV-decaging. A causa della ridotta velocità tripla elica piegatura delle CMP in condizioni diluite (primo tempo di ripiegamento:> 50 min) e la breve esposizione UV e il tempo di iniezione (5 ~ 7 min totale), la maggior parte dei CMP entrano nel flusso ematico in single- strand forma quando questo protocollo è seguita. Una volta iniettato, CMP dovrebbero rimanere come singoli trefoli, come la concentrazione viene ridotta di un fattore 20 nel pool sanguigna, con conseguente drastica riduzione del tasso rimontaggio ^18. Se l'iniezione è in ritardo (ad esempio per la movimentazione degli animali) e ripiegamento omotrimerica si sospetta, i peptidi parzialmente assemblati possono essere riattivati ​​dal riscaldamento sopra 7076; C dissociare i CMP di filamenti singoli, seguiti da rapido raffreddamento e di iniezione. Anche se meno conveniente, tali CMP-calore dissociata anche mostrare risultati attesi in vivo di targeting (Figura 2D).

In questa dimostrazione, topi nudi sono stati usati per NIR fluorescenza perché fino al 50% del segnale NIR può essere bloccato da capelli. Quando si lavora con modelli murini pelo (soprattutto quelli con i capelli neri), si consiglia la rasatura il mouse nella regione di interesse prima di imaging con un rasoio elettrico o di rimozione dei capelli. In figura 1, vi sono segnali falsi positivi regione addominale dell'animale, che è causata da auto-fluorescenza delle clorofille nella dieta animale. Tali segnali di fondo possono essere significativamente ridotte passando il mouse per diete purificate circa 4 giorni prima di imaging. Come visto nelle figure 1 e 2A, vi sono forti assorbimenti CMP nello spin codae. Pertanto, per evitare artefatti derivanti da iniezioni coda vena imperfetti, si consiglia di iniettare nella parte posteriore della coda in modo che il sito di iniezione non viene catturata l'immagine in fluorescenza.

Il CMP etichettato consente di targeting e di imaging di luoghi specifici di rimodellamento del collagene in vivo che sono difficili da rilevare con altri metodi. Per esempio, i saggi di sangue ed urine basati ELISA sono sensibili per frammenti collagene telopeptide spaccati, ma il metodo non possono localizzare la fonte del turnover del collagene, perché riguarda antigeni solubili. Le principali limitazioni della tecnica di imaging in vivo utilizzando NIR etichettati CMP sono attenuazione della profondità di penetrazione e tempra da prossimali pooled globuli rossi come emoglobina è un quencher endogena di 680/710 nm coloranti NIR. Le future applicazioni di CMP di imaging in vivo comprendono SPECT o PET di imaging utilizzando CMP marcati con radionuclidi gamma emittenti diretti o con positroni emitters, per la diagnosi di patologie che coinvolgono il rimodellamento del collagene (ad esempio, l'osteoporosi, l'artrite, l'aterosclerosi, e fibrosi). Questi CMP analoghi radio-marcati eliminerà le limitazioni della perdita di segnale dovuta alla profondità dei tessuti e la presenza di globuli rossi pool, e consentiranno misurazioni quantitative dei tessuti malati. Inoltre, il tempo di imaging relativamente tardi (ad esempio 48-96 HPI) derivanti dalla lenta liquidazione vincolante e di CMP potrebbe rendere difficile seguire rapidi cambiamenti nel rimodellamento del collagene. Tale limitazione può essere superata con una ulteriore ingegnerizzazione delle cinetiche di legame e l'affinità di agenti di imaging CMP. Poiché CMP si lega al collagene denaturate che hanno poca struttura, imaging a base di collagene-CMP è complementare alla seconda microscopia generazione di armoniche che può solo fibre di collagene immagine ^5.

Quando la colorazione di sezioni di tessuto con contrassegnati in modo fluorescente CMP, abbiamo trovato vantaggioso per incubare l'campioni nelle soluzioni peptide-UV attivato a 4 ° C, perché l'ibridazione a tripla elica è facilitata a temperatura inferiore ^{a 1,20.} Si è anche scoperto che immergendo i vetrini in PBS fresco in un barattolo di colorazione è il modo più efficace per lavare i CMP non associati, che funziona molto meglio che limitarsi a pipettaggio tamponi di lavaggio sui campioni. L'ibridazione CMP-collagene filamento è molto preciso e robusto, per cui il semplice protocollo di colorazione presentata in questo video può essere facilmente modificato per costaining biomarcatori supplementari, e per identificare collagene degradati in sezioni di tessuto non fissati. Questo è un efficace e conveniente alternativa all'utilizzo di anticorpi anti-collagene per rilevare collageni fibrosi in vari campioni istologici.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRdye 680RD Maleimide (IR680)	LI-COR	929-71050	Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1.
5(6)-Carboxyfluorescein	Sigma	21877-5G-F	Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12.
Cysteine	Advanced Chemtech	YC2200
Isoflurane	Butler Veterinary Supply	4/4/5260
Goat Serum	Sigma	G9023-10ML
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A9647
DAPI	Roche Applied Science	10236276001
Fluoroshield mounting medium	Sigma	F6182-20ML
Syringes	BD	329461
UV lamp	McMaster-Carr	1447T17
Pearl impulse imager	LI-COR	9400
Surgical forceps and scissors
EasyDip slide staining system	Light Labs	M900-12B
20-place cardboard microscope slide tray	Light Labs
Cover glasses	Fisher	12-545-c
Fluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE2000-E