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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La lumaca marina Aplysia californica è stata ampiamente utilizzata come modello di neurobiologia per gli studi sulle basi cellulari e molecolari del comportamento. Qui viene descritta una metodologia per esplorare il sistema nervoso di Aplysia per le analisi elettrofisiologiche e molecolari di singoli neuroni di circuiti neurali identificati.

Abstract

Una grande sfida in neurobiologia è comprendere le basi molecolari dei circuiti neurali che governano un comportamento specifico. Una volta identificati i meccanismi molecolari specifici, è possibile sviluppare nuove strategie terapeutiche per trattare le anomalie in comportamenti specifici causati da malattie degenerative o invecchiamento del sistema nervoso. La lumaca marina Aplysia californica è adatta per le indagini sulle basi cellulari e molecolari del comportamento perché i circuiti neurali alla base di un comportamento specifico potrebbero essere facilmente determinati e le singole componenti dei circuiti potrebbero essere facilmente manipolate. Questi vantaggi dell'Aplysia hanno portato a diverse scoperte fondamentali della neurobiologia dell'apprendimento e della memoria. Qui descriviamo una preparazione del sistema nervoso di Alysia per le analisi elettrofisiofisioiche e molecolari dei singoli neuroni. In breve, il ganglio sezionato dal sistema nervoso è esposto alla proteasi per rimuovere la tona del ganglio in modo tale che i neuroni siano esposti ma mantengano l'attività neuronale come nell'animale intatto. Questa preparazione viene utilizzata per effettuare misurazioni elettrofisiopatiche di singoli o multipli neuroni. È importante sottolineare che, seguendo la registrazione utilizzando una semplice metodologia, i neuroni potrebbero essere isolati direttamente dai gangli per l'analisi dell'espressione genica. Questi protocolli sono stati utilizzati per effettuare registrazioni elettrofisiofisioiche simultanee dai neuroni L7 e R15, studiare la loro risposta all'acetilcolina e all'espressione quantitante del gene CREB1 in singoli neuroni isolati L7, L11, R15 e R2 di Aplysia.

Introduzione

Il cervello umano è straordinariamente complesso con quasi 100 miliardi di neuroni e trilioni di connessioni sinaptiche. Ci sono quasi un numero uguale di cellule nonneuronali che interagiscono con i neuroni e regolano la loro funzione nel cervello. I neuroni sono organizzati in circuiti che regolano comportamenti specifici. Nonostante i progressi nella nostra comprensione delle funzioni cerebrali e dei circuiti neurali, poco si sa dell'identità dei componenti circuitali che controllano un comportamento specifico. La conoscenza delle identità di vari componenti di un circuito faciliterà notevolmente la nostra comprensione delle basi cellulari e molecolari del comportamento e aiuterà nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per i disturbi neuropsichiatrici.

La lumaca marina Aplysia californica è stata un cavallo di battaglia per determinare i circuiti neuronali alla base di comportamentispecifici 1-14. Il sistema nervoso dell'Alisia contiene circa 20.000 neuroni organizzati in 9 diversi gangli. I neuroni dell'Aplysia sono grandi e possono essere facilmente identificati in base alle loro dimensioni, proprietà elettriche e posizione nei gangli. Aplysia ha un ricco repertorio di comportamenti che possono essere studiati. Uno dei comportamenti ben studiati è il riflesso di astinenza branchiale (GWR). I componenti centrali di questo riflesso sono situati in gangli addominali. I componenti dei circuiti GWR sono stati mappati e sono stati determinati contributi di vari componenti. È importante sottolineare che i circuiti GWR subiscono l'apprendimento associativo e nonassociativo 5,6,15-19. Decenni di studio su questo riflesso hanno anche identificato diversi percorsi di segnalazione che hanno un ruolo chiave nell'apprendimento e nellamemoria 20-24.

Diversi preparativi di Aplysia furono usati per studiare le basi cellulari e molecolari della memorizzazione della memoria. Questi includono l'animaleintatto 2,3,la preparazione semi-intatta1,7,13,14,16 e la ricostituzione dei principali componenti dei circuiti neurali25-29. Qui viene descritta una preparazione ridotta per esplorare i gangli di Alisia per le analisi elettrofisiotiche e molecolari dei circuiti neuronali identificati. Sono stati studiati i seguenti quattro neuroni identificati. R15, un neurone che esplode, L7 e L11, due diversi motoneuroni e R2, un neurone colinergico. R2 è il più grande neurone descritto nel sistema nervoso invertebrato. In breve, questa metodologia prevede il trattamento proteasiale dei gangli, misurazioni elettrofisiologiche prima e dopo i trattamenti farmacologici e isolamento di singoli neuroni per l'analisi quantitativa dell'espressione genica. Questa metodologia ci consente di combinare le analisi molecolari con la registrazione simultanea da più neuroni. Questa metodologia è stata utilizzata con successo per studiare le risposte dei neuroni R15 e L7 all'acetilcolina (Ach) accoppiando registrazioni intracellulari. A seguito di misurazioni elettrofisiopatiche R15 e L7 e altri neuroni identificati come L11 e R2 sono stati isolati per l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) dell'espressione di CREB1, un fattore di trascrizione importante per la memorizzazione della memoria.

Protocollo

1. Preparazione di gangli addominali, misurazioni elettrofisiopatiche e isolamento di singoli neuroni identificati dal ganglio addominale di Alisia californica

  1. Mantenere Aplysia nell'acquario di laboratorio con acqua di mare artificiale circolante (ASW) a 16 °C in condizioni di luce:buio 12:12.
  2. Isolamento del ganglio addominale.
    1. Anestetizzare gli animali iniettando soluzione mgcl2 da 380 mM per 5-10 minuti (equivalente al 30-35% del peso corporeo dell'animale).
    2. Identificare il ganglio addominale in base alla sua posizione nel sistema nervosocentrale 24,28.
    3. Rimuovere i gangli mediante intervento chirurgico e conservare immediatamente in acqua di mare artificiale composta da NaCl da 450 mM, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2,55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3e 10 mM HEPES (pH 7.4).
  3. Trattamento proteasi.
    1. Incubare il ganglio addominale per 30 minuti a 34 °C±0,5 in una piastra di Petri con proteasi dello 0,1% (dispasi) diluita nell'ASW sopra descritta.
      NOTA: La quantità di proteasi utilizzata deve essere standardizzata con l'età e il peso degli animali. In generale, gli animali più vecchi e più grandi richiederebbero più proteasi.
  4. Rimozione della cannalia ganglia.
    1. Dopo il trattamento enzimatico, fissare i gangli alla base di Silicone di Sylgard di una camera cellulare (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) e per infusione con ASW (portata: 150 μl/min) a temperatura ambiente (18 °C±2 ).
      NOTA: Al fine di aumentare la visibilità dei neuroni identificati, posizionare il ganglio sulla parte superiore di un cilindro di vetro in policarbonato (Figura 1) (diametro Ø = camera cellulare modificata da 2 mm) che può essere facilmente illuminato dal basso utilizzando uno stereomicroscopio binoculare con ingrandimento 20X e 40X.
    2. Rimuovere con cura la toraia dal ganglio usando forcep e microscissori.
  5. Registrazione elettrofisiologia simultanea da due neuroni.
    1. Identificare il neurone di interesse.
    2. Impalare il neurone con un singolo microelettrodo acuto intracellulare con resistenza 10-15 MΩ riempita con soluzione di 3 M KCl.
    3. Registra l'attività neuronale (passaggio a banda 10 kHz) usando un sistema di registrazione intracellulare.
    4. Elaborare i dati di registrazione utilizzando software di elettrofisiologia come Axograph.
      NOTA: Si può facilmente effettuare la registrazione da più neuroni. I neuroni L7, L11 o R15 e R2 sono facilmente identificabili in base alla loro posizione. Per la registrazione simultanea da due neuroni L7 e R15 (Figura 2) sono necessari due amplificatori e due micromanipolatori.
  6. Applicazione di farmaci.
    1. Applicare il farmaco di scelta nella camera cellulare con pipettazione delicata o iniettare direttamente nei neuroni.
    2. Effettuare misurazioni elettrofisiopatiche.
      NOTA: A seconda dell'obiettivo sperimentale, si potrebbero misurare diversi parametri elettrofisiologici dei neuroni come i cambiamenti nel potenziale di membrana (MP) o nel potenziale di azione (AP) prima, durante e dopo l'applicazione del farmaco.
  7. Isolamento di singoli neuroni.
    1. Al termine degli esperimenti elettrofisiologici, interrompere la perfusione di ASW e lavare il ganglio con etanolo al 100%.  L'esposizione all'etanolo pietrifica i neuroni e, usando forcep fini, rende facile rimuovere i singoli neuroni senza danneggiare altri neuroni dal ganglio.
    2. Rimuovere singoli neuroni sotto uno stereomicroscopio e trasferirli in un piccolo tubo Eppendorf contenente reagente di estrazione dell'RNA ghiacciato da 500 μl. Singoli neuroni isolati possono essere conservati nel reagente di estrazione dell'RNA a -80 °C per analisi future.

2. Isolamento dell'RNA dai singoli neuroni e analisi dell'espressione genica da parte della PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)

  1. Precauzioni per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA:
    Le ribonucleasi (RNasi) degradano l'RNA e sono enzimi molto stabili e attivi. Durante la gestione degli RNA, a seguire le procedure seguenti.
    1. Pulire l'area di lavoro e gli strumenti con agenti disattivanti RNasi.
    2. Indossare i guanti in ogni momento durante la manipolazione dell'RNA e cambiare spesso i guanti.
    3. Utilizzare solo plastica priva di RNasi per gestire gli RNA.
  2. Isolare l'RNA totale da singoli neuroni:
    1. Il protocollo Trizol standard per l'isolamento dell'RNA può essere utilizzato per isolare gli RNA da singoli neuroni. Aggiungere brevemente il 20% v/v di cloroformio al Trizolo, mescolare bene con un breve vortice.
    2. Posizionare i tubi sul rotatore per 10 min a 4 °C. Ruotare la miscela Trizolo-Cloroformio a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
    3. Raccogliere la fase acquosa e trasferirlo in un tubo fresco.
    4. Aggiungere la soluzione di acetato di sodio (pH 5.5) ad una concentrazione finale di 0,3 M, 100 ng/ml del coprecipitante GlycoBlue e 2,5 volumi di etanolo al 100% per far precipitare l'RNA.
    5. Mescolare bene i campioni e incubare a -80 °C durante la notte.
    6. Ruotare i campioni a 12.000 x g per 20 min a 4 °C e un piccolo pellet blu sarà visibile nella parte inferiore del tubo.
    7. Rimuovere il supernatante e lavare il pellet con 850 μl di etanolo ghiacciato al 75% a 12.000 x g per 10 min a 4 °C.
    8. Rimuovere il supernatante con cura e asciugare all'aria il pellet di RNA per 7-10 minuti, massimo.
      NOTA: Assicurarsi che l'RNA non sia lasciato a lungo asciutto come oltre - asciugareil pellet di RNA rende la solubilizzazione molto difficile.
    9. Una volta essiccato, rimescolare il pellet di RNA in 10 μl di acqua libera di RNAse e determinare la concentrazione di RNA.
      NOTA: Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro. Quando non si utilizza subito, conservare l'RNA a -80 °C.
  3. sintesi dell'aRNA da singoli neuroni:
    1. Amplificare l'RNA (uno o due turni a seconda dell'obiettivo sperimentale) utilizzando il sistema di amplificazione dell'RNA lineare disponibile in commercio.
      NOTA: L'RNA totale dei singoli neuroni variava da ~10-60 ng. La resa prevista del primo ciclo di amplificazione è di ~100-300 ng e il secondo ciclo di amplificazione è ~0,8-1,5 μg di RNA.
  4. Trascrizione inversa dell'RNA:
    1. Per generare cDNA dall'aRNA, utilizzare 1,0 μg di aRNA in 20 μl di una reazione di trascrizione inversa. Diversi kit sono disponibili in commercio per questo scopo.

      NOTA: cDNA è stato sintetizzato secondo il protocollo del produttore utilizzando le seguenti impostazioni sul ciclore termico.
      5 min a 25 °C
      30 min a 42 °C
      5 min a 85 °C
      Tenere premuto a 4 °C
    2. Dopo la fase di trascrizione inversa, conservare il cDNA a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
  5. Progettazione e standardizzazione primer:
    Sono disponibili diversi eccellenti programmi software, gratuiti, per la progettazione di primer per amplificazioni in tempo reale.
    1. Selezionare oligonucleotidi da 18-24 anni che producono ampliconi da 70-110 bp e sintetizzare i primer utilizzando fonti commerciali.
      NOTA: Due o tre coppie di primer devono essere progettate per ogni gene di interesse. Ogni set di primer deve essere standardizzato da qPCR. Le coppie primer avanti e indietro utilizzate per il gene CREB1 (Figura 4) sono le seguenti:

      Primer set 1
      Attaccante: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAGA-3'
      Retromarcia: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Primer set 2
      Attaccante: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Rovescio: 5'-GACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. Per selezionare il primer migliore da utilizzare per le analisi a valle, monitorare il valore Ct e la forma della curva di amplificazione in qPCR.
      NOTA: I primer che danno valori Ct (Cycle threshold) tra 10-35 nell'amplificazione rotonda 40 e curve lisce durante la fase esponenziale della PCR seguita da un plateau liscio sono ottimali per le analisi dell'espressione genica.
  6. PCR quantitativo in tempo reale (qPCR):
    Nota: utilizzare tubi o piastre appropriati compatibili con la macchina qPCR.
    1. Diluire cDNA a 5x con acqua priva di nucleasi.
    2. A 2 μl di cDNA diluito, aggiungere 8 μl di una miscela master qPCR contenente 2 μl di H2O, 5 μl di 2x SYBR Green master mix e 1,0 μl di 10 μM (ciascuno) primer avanti e indietro.
    3. Chiudere i tubi e sigillare la piastra dopo pipettazione cDNA e master mix. Mescolare il contenuto toccando delicatamente e girando verso il basso a 1.500 giri/min per 30 secondi.
    4. Procedere alla configurazione della macchina qPCR.

Risultati

I pesi degli animali utilizzati in questo studio variavano da 100-200 g. Seguendo i protocolli descritti, abbiamo condotto misurazioni elettrofisiotiche e analisi molecolari di neuroni di gangli addominali isolati da animali che vanno da 2-5 g a 200-300 g.

La standardizzazione del trattamento proteasi è importante per misurazioni elettrofisioniche di successo dei neuroni nei gangli. Inizialmente, sono state utilizzate concentrazioni e durate multiple di proteasi (Dispasi) e sono stati registr...

Discussione

Il neurone R15 è coinvolto nella regolazione dei sistemi cardiovascolare, digestivo, respiratorio e riproduttivo30. Un'attività di bursting regolarmente ritmica dell'AP è una caratteristica di R15. Come mostrato nella sezione dei risultati, la registrazione accoppiata di R15 e L7 mostra che la preparazione dei gangli ha preservato l'attività dei neuroni R15. I neuroni R15 e L7 hanno risposto in modo appropriato ad Ach. Questa preparazione dei gangli potrebbe essere mantenuta fino a 8-10 ore e l'attività e...

Divulgazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Ringraziamo sinceramente la Whitehall Foundation per il supporto finanziario e i fondi di avvio dello Scripps Research Institute per aver svolto questo lavoro.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AplysiaNational Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2•2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2•6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
ProteaseGIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
ChloroformMP Biomedicals2194002
100% EthanolACROS64-17-5
GlycoBlueAmbionAM9515
3 M NaOAc, pH 5.5AmbionAM9740
Nuclease free waterAmbionAM9737
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbionAM1751
qScript cDNA SuperMixQuanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
ForcepsFine Science Tools11252-20
ScissorsFine Science Tools15000-08
Stainless Steel Minutien Pins Fine Science Tools26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal CyclerApplied BiosystemsVeriti Thermal Cycler
5430R CentrifugeEppendorf5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCRApplied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR
AmplifierBRAMP-01RNPI Electronics
Digidata ConverterInstrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
Micro ManipulatorPatch StarScientifica

Riferimenti

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