La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Riepilogo

Abbiamo stabilito un protocollo di ibridazione fluorescente in situ per la rilevazione di un genoma del virus DNA persistente all'interno di sezioni tissutali di modelli animali. Questo protocollo permette studiando processo di infezione da codetection del genoma virale, i suoi prodotti di RNA e proteine ​​virali o cellulari all'interno delle cellule singole.

Abstract

Codetection singola cella di un gene, il suo prodotto RNA e proteine ​​regolatrici cellulari è fondamentale per studiare regolazione dell'espressione genica. Questa è una sfida nel campo della virologia, in particolare per persistenti virus a DNA nucleare replicanti che coinvolgere modelli animali per il loro studio. Tipo virus herpes simplex 1 (HSV-1) stabilisce un'infezione latente permanente nei neuroni periferici. Latent virus funge da serbatoio, da cui riattiva e induce un nuovo episodio erpetica. La biologia cellulare di HSV-1 latenza rimane poco compresa, in parte a causa della mancanza di metodi per rilevare HSV-1 genomi in situ in modelli animali. Descriviamo un DNA-ibridazione in situ fluorescente (FISH) approccio efficiente rilevazione low-copia genomi virali all'interno di sezioni di tessuti neuronali provenienti da modelli animali infetti. Il metodo si basa sul-based calore antigene smascheramento, e direttamente etichettati sonde di DNA fatti in casa, o sonde disponibili in commercio. Abbiamo sviluppato un Stai triplaapproccio ning, combinando DNA-FISH con RNA-FISH e immunofluorescenza, utilizzando perossidasi basato amplificazione del segnale per soddisfare ogni esigenza di colorazione. Un miglioramento importante è la possibilità di ottenere, entro 10 micron sezioni di tessuto, segnali a bassa priorità bassa che possono essere esposte ad alta risoluzione mediante microscopia confocale e grande campo epifluorescenza convenzionale. Inoltre, la colorazione tripla lavorato con una vasta gamma di anticorpi diretti contro proteine ​​cellulari e virali. Il protocollo completo dura 2,5 giorni per accogliere anticorpo e la penetrazione della sonda all'interno del tessuto.

Introduzione

Tipo virus herpes simplex 1 (HSV-1) è un virus umano neurotropo persistente, stabilendo una infezione latente a lungo termine nei neuroni dei gangli del trigemino (TG) del sistema nervoso periferico, da cui si riattiva periodicamente per replicare e diffondersi. La HSV-1 è un genoma 150 kb dsDNA localizzazione nel nucleo del neurone ospitante dove rimane plasmidi chromatinized come multicopia, che non si integrano nel genoma della cellula ospite ^1,2. Durante la latenza, il programma genetico HSV-1 ciclo replicativo è fortemente represso, e l'espressione genica è limitata alla trascrizione latenza associata (LAT) locus, da stabilimento latenza apertura di riattivazione ^3. LAT produce un lungo 8.5 kb non codificante RNA trasformato in un importante 2 kb lariat stabile, e molti miRNA ^4-7. HSV-1 latenza è quindi caratterizzato dalla presenza del DNA genomico virale, LAT RNA, e l'assenza di proteine ​​del ciclo replicativi rilevabili.

ONTENUTO "> I modelli animali, prevalentemente topo e coniglio, sono modelli sperimentali riassumono diverse caratteristiche di latenza umana. Uno dei principali interessi di tali modelli è che essi consentono studiare aspetti fisiologici di HSV-1 latenza in ospiti immunocompetenti. Negli ultimi decenni , molti strumenti sperimentali, quali virus e topi geneticamente modificati, sono stati sviluppati per studiare la fisiologia, genetica e biologia cellulare di HSV-1 latenza, da tessuti animali. Finora, DNA genomico virale è stata rilevata e quantificata mediante Southern blot e qPCR da dissociato TG. Tuttavia, attualmente non esiste un metodo per rilevare il HSV-1 genoma mediante ibridazione in situ su sezioni di tessuto ^8. conseguenza, la latenza viene normalmente valutata su sezioni istologiche attraverso la rilevazione di RNA LAT da RNA ibridazione in situ anziché rilevazione del genoma virale. Poiché non è stato possibile caratterizzare cellule infette in base alla presenza di genomi virali, this limitazione tecnica è stato un grave inconveniente per l'analisi di molti aspetti delle interazioni ospite-virus, come il rapporto tra il genoma virale e l'espressione genica cellulare e virale o cellulo-mediata risposta immunitaria dell'ospite ^9,10.

Soprattutto, l'eterogeneità cellula-cellula dell'infezione latente rimane relativamente inesplorato e ha dimostrato di essere un elemento chiave della latenza nei topi e nei neuroni dei gangli sensoriali umani impiantati in topi SCID ^11-17. Tipicamente, è stato dimostrato da qPCR che il HSV-1 genoma numero di copie per cellula varia da 5 a diverse centinaia. Anche se LAT appare come un regolatore chiave della latenza e la riattivazione, i dati qPCR sui neuroni isolati e in situ PCR indicato che solo un sottoinsieme di neuroni latentemente infette, a partire da 30%, esprime il locus LAT ^11,12,18-21. Come la cellula ospite e l'ambiente cellulare all'interno del tessuto impatto sulla costituzione di latenza virus el'espressione genica virale rimane poco chiaro. Qui si descrive un robusto ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo per la rilevazione efficiente di bassa copia HSV-1 DNA genomico entro sezioni di tessuto neuronali animali. Questo metodo è stato progettato e da noi utilizzato per ottenere l'accesso a microscopia ad alta risoluzione di immagini che è necessario studiare l'interazione del genoma virale con la cellula ospite componenti intra-nucleari ^22. Inoltre, si descrive un metodo di colorazione multipla per la rilevazione simultanea del DNA virale con RNA e proteine, che è uno strumento unico per descrivere le interazioni virus-ospite che regolano l'espressione genica virale. Il metodo può essere applicato anche per una vasta gamma di analisi che richiedono la rilevazione di HSV-1 genoma latente, come quantificazione neuroni infetti in gran numero di sezioni. Un passo fondamentale è quello di applicare antigene trattamento di recupero per rendere il DNA virale accessibile a ibridazione. Così, questo protocollo potrebbe anche essere efficace per il rilevamentodi altri virus dsDNA, che attualmente non rilevabili da approcci DNA-FISH convenzionali all'interno di tessuti animali.

Protocollo

Questo metodo è stato utilizzato in uno studio pubblicato in precedenza ^22. Per il contesto generale e la descrizione di manipolazione convenzionale ISH, IF e FISH, suggeriamo la seguente letteratura disponibile ^23.

1. L'infezione degli animali

Tutte le procedure che coinvolgono animali da esperimento conformi alle questioni etiche dalla Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l'uso di animali nella ricerca, e sono state approvate dal Comitato Etico locale della UPR-3296-CNRS, in conformità della Comunità europea direttiva 86/609/CEE del Consiglio. Tutti gli animali hanno ricevuto un accesso illimitato al cibo e all'acqua.

Il metodo di infezione mouse con HSV-1 descritto di seguito è stato usato in studi precedentemente pubblicati ^24-26.

1. Preparare le seguenti soluzioni per la preparazione prima di partenza:
   
   HSV-1 virus soluzione madre
   Anestetizzante soluzione - Ketamine-100 mg / kg e Xylazina-10 mg / kg
   
2. Raccogliere 1 ml di virus (10 ⁶ PFU) in un microsiringa 5 microlitri di vetro collegato ad un dispositivo a pompa microsiringa erogare 0,1 ml / sec. Nota: Risospendere il brodo virus in un terreno privo di rosso fenolo per vedere il limite tra l'olio rosso presentare nel capillare e la soluzione virus e per evitare di iniettare aria nel sito di inoculazione virus.
3. Posare il mouse anestetizzato (Ketamina-100 mg / kg e xylazina-10 mg / kg) sulla sua faccia back up.
4. Posizionare la testa anestetizzato mouse sotto un binocolo stereo-microscopio e inserire l'ago nello strato subepiteliale del labbro superiore sinistro al confine mucocutanea. Iniettare la soluzione virus in due fasi (due volte 0,5 mL) ad una velocità di 0,5 pl per 5 sec Nota:. Rispetto una pausa di 10 secondi tra le due iniezioni da 0,5 microlitri, per consentire la sospensione virale di assorbire nel sito di iniezione.
5. Posizionare il mouse in37 ° C incubatore fino al risveglio.
6. Lasciare il mouse nelle strutture animali a recuperare per il tempo necessario. Nota: Nel modello murino, HSV-1 induce una infezione primaria, chiamato infezione acuta, che dura meno di 10 giorni al sito di inoculazione e all'interno di diversi tessuti neuronali compresi TGs, superiore gangli cervicale (SCG), e gangli delle radici dorsali (DRG), a seconda del punto di inoculazione. Segni di infezione primaria progressivamente scompaiono e la latenza è considerato pienamente stabilita circa 28-30 giorni dopo l'infezione (dpi) in poi. Tessuti neuronali possono essere raccolte in genere da 4 dpi per studi sulla infezione acuta, e dal 28 dpi per gli studi di latenza.

2. Mouse perfusione-fix

1. Preparare le seguenti soluzioni prima di iniziare: 50ml di tampone salina fisiologica
   
   60 ml di PBS 1x
   150 ml di preparato fresco 4% paraformaldeide in PBS 1x
   60 ml di 20% di saccarosio in PBS 1x.
   
2. Preparare il tubo per perfusione: collegare l'ago a un capillare, che è collegato ad una pompa peristaltica.
3. Anestetizzare il mouse come sopra descritto (SREP 1.2) e metterlo sulla schiena su un vassoio dissezione, attribuita dalle quattro gambe con perni.
4. Utilizzando forbici tagliare la pelle dalla pancia fino alla gola *. Strappare via lo strato di tessuto sottile che copre gli organi. Aprire la gabbia toracica tagliando le nervature su un lato dello sterno. Togliere la pelle strappo. Allontanarsi dal reciprocamente le parti destra e sinistra della gabbia toracica per rivelare il cuore. Nota: Prestare attenzione a non incidere le budella, polmoni e grandi vasi (arterie carotidi e le vene giugulari), che renderà impossibile nei profumi fissazione.
5. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro *. Incidere l'atrio destro con le forbici. Procedere con dissanguamento iniettando 20 ml di soluzione fisiologica nei vasi sanguigni attraverso il cuore. Lasciare il flusso di sangue nel vassoio. NTE: Durante questa procedura, prestare attenzione a non forare attraverso l'altro lato del cuore.
6. Profumato con 150 ml di PFA 4% in PBS 1x durante 15 min * (Attenzione: PFA è tossico, manipolare sotto cappa). Profumato 60 ml di 20% di saccarosio in PBS 1x durante 6 min. In quella fase il mouse è pronto per la raccolta TG. Nota: Impostare la pompa a 10 ml / min. Una buona perfusione è evidente quando la coda di topo irrigidisce, sollevare poi cadere di nuovo.

3. TG raccolta

1. Preparare la seguente soluzione prima di iniziare:
   
   20% di saccarosio in PBS 1x
   
2. Tagliare la testa a livello del collo. Tagliare la punta del naso appena dietro gli incisivi al fine di rivelare la cavità naso. Incidere il palato in due con forbici e allontanarsi ciascun lato del palato Nota:. TGS appare appena sotto il palato, come due masse bianche e oblunghe di 2-3 mm di lunghezza posto a destra elato sinistro e collegato al nervo trigemino.
3. Tagliare i rami del nervo trigemino su ciascun lato del TGS per rilasciare TGS dal tronco cerebrale. Rimuovere il TGS con le pinze chirurgiche e tenerli in una soluzione sterile di saccarosio del 20% per 24 ore. Nota: Utilizzare due destinatari diversi per destra e sinistra TG, per evitare la confusione tra il TG sinistra (infetti) e il diritto TG (o non debolmente infetta). Incubare il TGS nel 20% di saccarosio in 1x PBS per 24 ore prima di incorporamento.
4. Incorpora TGs in un unico blocco in criosezionamento mezzo di inclusione e congelare a -80 ° C.
5. Conservare blocchi a -80 ° C fino al sezionamento.

4. Cryosection Preparazione

1. Tagliare i longitudinalmente TGS 10 sezioni micron su una -20 ° C criostato, e metterli sullo leggermente riscaldata diapositive (30 ° C) SuperFrost. Lasciate le fette asciugare per 5-10 min poi congelare e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso. Nota: fino a 4-5 sezioni possono essere placed su una singola diapositiva, se gran numero di sezioni deve essere elaborato allo stesso tempo. Si procede come segue: sezioni seriali vengono depositati su 3 serie di vetrini etichettati A1, B1, C1 e, poi A2, B2, C2 e così via. Quindi, ogni serie slitta (A, B, e C) può essere elaborato per differente colorazione (ibridazione in situ, FISH, PCR in situ, LCM) ei dati ottenuti con le diverse tecniche può essere paragonata sapendo che scivoli trasportano lo stesso numero corrispondono alla stessa regione del TG.

5. HSV-1 Sonda Etichettatura

Il protocollo descritto in appresso per la rilevazione di HSV-1 genoma mediante FISH DNA è stato usato con successo con due tipi di sonde. Il primo è una sonda fluorescente Cy3-marcato fatta in casa che è appropriato per la multa analisi dell'organizzazione nucleare all'interno delle cellule individuali, mediante microscopia a fluorescenza alto ingrandimento. La seconda è una sonda biotinilata disponibile in commercio, che può essere combinanod con amplificazione del segnale basato perossidasi per fornire un segnale luminoso. Quest'ultimo è appropriato per l'identificazione e la quantificazione dei virus contenente neuroni a basso ingrandimento in tutta la sezione, e per l'analisi delle HSV-1 stili genoma. Gli utenti finali dovrebbero valutare quale approccio si adatta meglio lo scopo del loro studio. La sonda disponibile in commercio è presente nella sezione di reagente, e la preparazione della sonda fatta in casa è descritto di seguito.

1. Preparare le seguenti soluzioni prima di iniziare:
   
   HSV-1 genoma contenente i vettori (vedi punto 1)
   70% di etanolo, per biologia molecolare.
   
2. . Preparare cosmidi contenenti 30 kb porzioni di HSV-1 genomi (cosmidi numero 14, 28, e 56 descritti in riferimento ²⁰ usando colonne di purificazione dedicati ai grandi vettori Nota: Altri tipi di librerie contenenti HSV-1 genomi, come cromosomi batterici artificiali voglia lavorare così, finché la sonda copre alparte arge del HSV-1 genoma per produrre un segnale sufficientemente ^27-29. Nelle nostre mani, sonde fatte dal backbone cosmid vettore non hanno prodotto alcun segnale, e sono stati utilizzati come controllo negativo. Così interi vettori cosmide contenenti HSV-1 sequenza sono stati utilizzati nel nostro studio. È anche possibile tagliare la sequenza HSV-1 e usarlo per preparare la sonda.
3. . Etichetta 2 mg di ciascuno cosmide con Cy3-dCTP utilizzando un kit nick-translation secondo le linee guida produttore Nota: Eseguire etichettatura con un mix di reazione contenente solo Cy3-dCTP e non senza etichetta dCTP.
4. Arrestare la reazione aggiungendo 3 ml di 0,5 M EDTA nella miscela e riscaldamento a 70 ° C per 10 min. Raffreddare su ghiaccio.
5. Purificare la sonda su un minicolonna esclusione gel G50. Aggiungere 150 pg di DNA di sperma di salmone alla sonda e la sonda precipitare da precipitazione con etanolo. Il pellet di DNA deve essere rosa a causa di Cy3 incorporazione. Lavare il pellet con etanolo al 70% e rimuovere quanto più etanolopossibile con una pipetta. Non lasciate che il pellet asciutto.
6. Sciogliere il pellet con 100 ml di formammide deionizzata (Attenzione: formammide è tossico manipolare sotto cappa.). La concentrazione sonda non può essere valutato attendibilmente a questo punto. I quantitativi sonda citati nel testo si riferiscono alla quantità di DNA stampo utilizzato per effettuare la sonda. Il protocollo essendo basato su 2 pg di DNA stampo e 100 ml di formammide, è considerato essere di 20 ng / ml. Conservare a -20 ° C. La sonda marcata può essere preparato in gran quantità e congelati per diversi mesi.

6. DNA-FISH

La figura 1 mostra una panoramica delle principali fasi del protocollo DNA-FISH, e come eseguire DNA-FISH come parte di un esperimento di colorazione multipla per codetect RNA e proteine, come descritto nei protocolli 7-9.

1. Preparare le seguenti soluzioni prima di iniziare:
   
   0.5% Triton X-100 in PBS 1x
   2x SSC e tampone SSC 0.2x
   100 mM pH 6,0 tampone citrato (10x soluzione madre) e 10 mM pH 6,0 tampone citrato (soluzione di lavoro)
   Tampone di ibridazione 2x (vedi protocollo 4)
   
2. Il giorno 1, posizionare le diapositive su un supporto per diapositive a temperatura ambiente, e lasciare che le sezioni asciugare per 10 min. Il giro delle sezioni con una penna idrofobo. Reidratare le sezioni in 1x PBS per 10 min. Incubare le sezioni 20 min con 0,5% Triton X-100 in PBS 1x per permeabilize tessuto. Lavare 3x 10 min con 2x SSC, e tenere in 2x SSC fino a quando viene riscaldato il buffer smascheramento (vedi sotto).
3. Per smascheramento, preparare un vassoio vetrino (capacità 20 vetrini) riempita con 200 ml di 10 mM tampone citrato di sodio (pH 6,0). Riporlo in un contenitore più grande riempito con 500 ml di acqua distillata. Questa impostazione permette un migliore controllo di impulsi di riscaldamento. Prima di posizionare le diapositive nel cassetto, preriscaldare il buffer nel forno a microonde fino a quando il buffer raggiunge il punto di ebollizione (circa 8 min a 800 W).
4. Porre i vetrini nel cassetto-tampone contenente citrato preriscaldata, e verificare che siano completamente coperti con tampone. Calore per circa 20 secondi fino a quando il buffer raggiunge ebollizione. Attenzione, non lasciare che il buffer di sopra ebollizione, che potrebbero danneggiare il tessuto. Raffreddare a temperatura ambiente per 2 min. Ripetere il 6x ciclo di riscaldamento (7 cicli di riscaldamento totale) *. Far raffreddare 2 minuti e trasferire le diapositive in 2x SSC per 5 min.
   Nota *: Questa è una delle fasi più critiche. Il numero ottimale e la durata dei cicli di riscaldamento devono essere determinati empiricamente, e possono variare a seconda del tipo di tessuto o del tipo di sonda utilizzata. Il forno a microonde, vassoio, contenitore e volume del tampone nel vassoio e acqua nel contenitore devono essere tenuti identici per riproducibilità di smascheramento. Ebollizione eccessivo potrebbe causare la perdita di tessuti e cellule danneggiate. Per ogni impulso di riscaldamento, la comparsa di ebollizione viene osservarlo e caloreing deve essere ferma ai primi segni di ebollizione. Una volta creato, smascheramento appare robusto e riproducibile. Figura 2A mostra che HSV-1 genoma può essere rilevato da smascherare con buffer diversi, che indica che le condizioni di smascheramento possono essere ulteriormente esplorato. Smascheramento a base di citrato è stato trovato per fornire costantemente buon segnale FISH, e la conservazione dei tessuti, con sezioni di vari modelli di laboratorio e sugli animali.
5. Incubare i vetrini in metanolo: acido acetico: mix PBS (03:01:04) per 15 minuti, poi in un metanolo: mix acido acetico (3:1) per 15 minuti (Attenzione: acido acetico è corrosivo Manipolare sotto i fumi. cappuccio e utilizzare una protezione adeguata. Preparare questa soluzione giusta prima dell'uso).
6. Disidratare attraverso la sezione successiva 10 min di incubazione a 70%, poi 2x 10 min in etanolo al 100%. Lasciare asciugare a temperatura ambiente per 10 min. Tenere asciutto fino sondaggio.
7. Preparare la soluzione di sondaggio come segue: preparare in anticipo una scorta di 20 ml di 2x tampone di ibridazione containing 20% ​​di solfato di destrano (MW 500.000), la soluzione di 2x Denhardt, 4x SSC *. Aliquota della soluzione da 500 microlitri di microtubi, e conservare a -20 ° C. Per 1 scivolo (coprioggetto 22 mm x 50 mm), mescolare 90 ng di HSV-1 sonda Cy3 marcata (30 ng di sonda per ogni cosmide), e completare il volume a 40 ml con formammide. Aggiungere 40 ml di tampone di ibridazione 2x. Mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte.
   Nota *: Per preparare il buffer 2x ibridazione, mescolare 4 g di MW 500.000 destrano solfato in 10 ml di acqua distillata. Si fa un mix viscoso che si sciolgono su 3-4 ore a 70 ° C. Mescolare regolarmente per aiutare a sciogliere. Aggiungere 4 ml di SSC 20x, 100x 400 ml di soluzione Denhardt. Completare a 20 ml e mescolare bene con un vortice.
8. Goccia 80 ml di soluzione di sondare sulle sezioni secchi. Coprire con un coprioggetto 22 mm x 50 millimetri di vetro, e verificare che la soluzione sondaggio si estende sul'intera superficie del vetrino. Attenzione: non ci dovrebbero essere bolle. Presenza di bolle diminuisce l'efficienza di ibridazione. Sigillare il coprioggetto utilizzando mastice e lasciare asciugare. Conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente per almeno 2 ore per il segnale ottimale ibridazione in tutta la diapositiva.
   Nota: il cemento di gomma è conveniente come si asciuga in fretta, è impermeabile e protegge il campione da asciugatura durante ibridazione. E 'anche facile da staccare per rimuovere il vetrino dopo ibridazione. Nail polish è un'alternativa efficace, ma l'opzione meno conveniente.
9. Procedere con denaturazione ponendo i vetrini in un incubatore diapositiva 80 ° C per 5 min. In alternativa, posizionare i vetrini su un vassoio di metallo e riporlo in un bagno di acqua 80 ° C (il vassoio deve galleggiare). Poi trasferire rapidamente i vetrini su un vassoio metallico posti su ghiaccio. Lasciare agire per 5 min. Trasferire i vetrini a 37 ° C (riscaldamento vetrino o incubatore) per l'ibridazione durante la notte.
   Nota: Si sconsiglia l'ibridazione più breve, che si traduce in debole o nessun segnale.
10. Il giorno 2, rimuovere il mastice con una pinza, mantenendo il vetrino sul riscaldatore per mantenere la sezione a 37 ° C. Rimuovere il coprioggetto delicatamente con la punta di una lama di bisturi.
11. Lavare 3x con 2x SSC a 37 ° C per 5 min, e tre volte con 0.2x SSC a 37 ° C per 5 min. Risciacquare una volta con 2x SSC a temperatura ambiente per 5 min e procedere con colorazione DNA e montaggio (vedi protocollo 10 di seguito).
    Nota: Questo metodo consente la rivelazione di bersagli genomici cellulari, utilizzando sonde corrispondenti nella soluzione tastatura con HSV-1 sonde specifiche come pubblicato per centromerica e sequenze pericentromeriche ^22.

7. Doppio FISH RNA-DNA

Vedere la Figura 1, scatole verdi per una visione d'insieme.

Per di piùcolorazione procedure, tra cui un passo RNA-FISH, è generalmente consigliato di eseguire prima il rilevamento RNA come tale obiettivo è sensibile alla degradazione da RNAsi e prodotti chimici. Inoltre, la procedura di DNA-FISH comprende trattamenti che riducono l'efficienza di altri colorazione. Per RNA-FISH, abbiamo scelto un approccio di rilevamento enzimatico a base (Tyramide Signal Amplification (TSA) utilizzando sonde biotinilate e perossidasi (HRP) streptavidina accoppiati). TSA si basa su un substrato tiramide fluorescente (vedi tabella reagente per i dettagli), che è legata covalentemente al tessuto mediante una reazione enzimatica della perossidasi. Il segnale RNA-FISH è quindi conservata nel DNA-FISH.

1. Preparare le seguenti soluzioni prima di iniziare:
   
   Vector per la trascrizione in vitro di locus LAT (pSLAT-2)
   1x PBS contenente 2 mM RVC
   0.5% Triton X-100 in 1x PBS contenente 2 mM RVC
   3% H ₂ 0 ₂ in acqua distillata.
   70%, 80%, 95% etanolo, per biologia molecolare.
   Soluzione di ibridazione 4x RNA (vedi protocollo 4)
   
2. Almeno un giorno prima dell'esperimento RNA-FISH, preparare la sonda FISH RNA. Per rilevare l'HSV-1 Latenza Associated trascrizione (LAT), preparare una ribo-sonda biotinilato dal pSLAT-2 vettore ^30, o altro vettore per la trascrizione in vitro del locus LAT, come precedentemente descritto in riferimento ^26. In breve: Linearizza 10 mg di pSLAT-2 con HindIII e purificare il vettore digerito con un kit di purificazione del DNA. Sintetizzare un filamento singolo ribo-sonda da 2 pg di digerito pSLAT-2 con un T7 kit di trascrizione in vitro in presenza di biotina-16-UTP *. Purificare la sonda con un mini-colonna RNA e quantificare a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. Diluire la sonda a 50 ng / ml in DNAse / RNAsi acqua libera e conservare a -80 ° C, in piccole aliquote per evitare cicli di gelo-disgelo.
   Nota *: La biotina-16-UTP: rapporto UTP deve essere determinato empiricamente. Noi found un rapporto 40:60 per fornire le sonde di rilevazione in modo efficiente LAT da RNA-FISH.
3. Il giorno 1, posizionare le diapositive su un supporto per diapositive a temperatura ambiente, e lasciare che le sezioni asciugare per 10 min. Il giro delle sezioni con una penna idrofobo. Reidratare le sezioni in 1x PBS contenente 2 mM ribonucleoside Vanadyl Complex (RVC) * per 10 min. Incubare le sezioni per 20 min con 0,5% Triton X-100 in 1x PBS contenente 2 mM di RVC permeabilize tessuto. Lavare 3x 10 minuti con PBS 1x, 2 RVC mm. Per placare qualsiasi attività della perossidasi endogena, incubare la sezione 3% H ₂ O ₂ per 2x 10 minuti, e poi lavare una volta con PBS 1x, 2 RVC mm.
   Nota *: Durante la procedura di RNA-FISH, ribonucleoside vanadile complesso (RVC) è aggiunto tamponi e soluzioni per prevenire la degradazione dell'RNA.
4. Incubare 2x 10 min in etanolo al 70%. In questa fase, le sezioni possono essere memorizzati in 70% di etanolo a -20 ° C per diverse settimane. Disidratare sezioni mediante incubazione a 80%, 95% e 100% ethAnol, 5 min ciascuno. Lasciare la sezione asciugare per almeno 10 min.
   Nota: In alcuni casi, il trattamento etanolo può essere deleterio per la rilevazione di altri obiettivi. Un protocollo alternativo utilizzando un passo prehybridization nel 50% formammide - 2x SSC può essere utilizzato (vedi sotto nel protocollo 9 per i dettagli sulla colorazione tripla). Tuttavia, il trattamento etanolo è l'approccio più versatile per l'RNA-FISH e fornisce lo sfondo più basso.
5. Preparare la soluzione di sondaggio come segue: preparare in anticipo a 10 ml di brodo di una soluzione di RNA ibridazione contenente 4x 8x SSC, 20x soluzione Denhardt, EDTA 4 mm, 40% destrano *. Aliquota della soluzione da 500 microlitri di microtubi, e conservare a -20 ° C. Per 1 scivolo preparare 80 ml di soluzione (coprioggetto 22 mm x 50 mm), miscelando 20 ng di biotinilato riboprobe LAT, 40 ng di tRNA di lievito, 2 RVC mM, e completa a 20 ml con acqua. Aggiungere 20 ml di soluzione di RNA ibridazione 4x, e 40 microlitridi formammide (concentrazione finale 50%). Per facilitare le operazioni di pipettaggio e la miscelazione, si raccomanda di preriscaldare la soluzione di ibridazione RNA 4x a 75 ° C. Mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte.
   Nota *: Per preparare la soluzione di ibridazione RNA 4x, mescolare 4 g di solfato di destrano (MW 500000) in 3 ml di acqua distillata e 4 ml di SSC 20x. Si fa un mix viscoso che si dissolve a 3-4 ore a 70 ° C. Mescolare regolarmente per aiutare a sciogliere. Aggiungere 2 ml di soluzione di 100x Denhardt, e 80 ml di una soluzione di EDTA 0.5 M. Completare a 10 ml con acqua e mescolare bene con un vortice. Attenzione: utilizzare solo RNasi / DNasi prodotti gratuiti.
6. Denaturare la sonda 10 min a 75 ° C. Nel frattempo, mettere i vetrini in un incubatore set di diapositive a 65 ° C. Goccia 80 ml di soluzione della sonda sulle sezioni e rapidamente mettere un coprioggetto sulla goccia. Attenzione: non ci dovrebbe essere nessuna bolla. Presenza di bolle diminuisce ibridazione efficiency. L'incubazione deve avvenire in una camera umidificata in quanto il vetrino non è sigillato. Utilizzare un incubatore diapositiva che può contenere l'acqua (vedi tabella materiale), o preparare una camera umidificata all'interno di una scatola sigillata e metterlo in un 65 ° C forno di ibridazione.
7. Incubare per una notte a 65 ° C. Nota: LAT RNA-FISH è condotta a 65 ° C per prevenire il legame non specifico della sonda, che viene osservato a 37 ° C. Molte altre sonde RNA-FISH devono comportare buon segnale a 37 ° C.
8. Il giorno 2, prima di iniziare il lavaggio, preparare i reagenti di rilevazione secondo le istruzioni del produttore del kit di rilevazione TSA. La rivelazione viene eseguita con un kit per il rilevamento commerciale TSA compresa una perossidasi di rafano (HRP) streptavidina accoppiata e un substrato fluorescente verde o blu.
9. Mantenere le diapositive sulla stufa vetrino a 65 ° C. Rimuovere con attenzione il vetrino e rapidamente aggiungere 1 ml di 50% formammide in 2x SSC, preriscaldata unt 65 ° C. Attenzione, non lasciare che la sezione asciutto. Lavare due volte 10 min a 65 ° C in 50% formammide in 2x SSC e 2x 10 min in 2X SSC a 65 ° C. Lavare nuovamente con 2x SSC e posizionare il vetrino su una stufa diapositiva 37 ° C.
10. Procedere con la fase di rilevazione secondo le istruzioni kit di rilevamento TSA produttore. La concentrazione di HRP-streptavidina, la concentrazione di substrato fluorescente e il tempo di reazione deve essere determinata empiricamente *. Per il rilevamento RNA LAT, abbiamo usato ordinariamente la seguente condizione: HRP-streptavidina diluito a 1/500, reagente fluorescente a 1/100 per fluorescenza blu e 1/500 per fluorescenza verde, e il tempo di reazione di 10 min. Il segnale può essere rapidamente controllato con un microscopio a fluorescenza invertito senza montare, prima di procedere con il DNA-FISH.
    Nota *: Il protocollo di amplificazione sarà il design secondo i principali obiettivi dell'esperimento. Ad esempio, per localizzare finemente dell'RNA bersaglio, è annunciodazione di utilizzare tempi di reazione brevi. Al contrario, per identificare e contare le cellule positive a basso ingrandimento rapidamente, tempo di reazione può essere aumentata per generare un segnale luminoso.
11. Per DNA-FISH, seguire la procedura sopra indicata, a partire dalla fase di smascheramento (punto 6.2).

8. FISH Immuno-DNA

Vedere la Figura 1, scatole viola per una visione d'insieme.

Analogamente a RNA-DNA-FISH, si consiglia di eseguire prima l'immunofluorescenza, dal momento che il DNA-FISH rischia di denaturare le proteine ​​e prevenire il loro individuazione da anticorpi. La qualità del segnale immunofluorescenza è fortemente dipendente dalle caratteristiche anticorpi, e numerosi anticorpi dovrebbe essere testato quando possibile. Epitopo smascheramento viene eseguita una volta prima della immunofluorescenza per migliorare sia la rilevazione di proteine ​​e DNA-FISH. Per mantenere il segnale immunofluorescenza sul campione durante la procedura di DNA-FISH è necessario covalently collegarlo al tessuto. Presentiamo qui due approcci che hanno fornito buoni risultati nelle nostre mani, anticorpo di rilevazione post-fissazione e tiramide based (vedere il punto 8.5). La scelta dovrebbe essere guidata da prove preliminari per ogni coppia porta / anticorpo.

1. Preparare le seguenti soluzioni prima di iniziare:
   
   1x PBS contenente 3% di siero normale di capra (NGS).
   2% PFA in 1x PBS (diluizione della soluzione di riserva 4%)
   
2. Il giorno 1, i primi passi sono identici a DNA-FISH, fino alla fase smascheramento (passi 6,1-6,2).
3. Dopo smascherando, incubare le sezioni con 1x PBS contenente il 3% NGS per 1 ora.
4. Incubare con l'anticorpo primario diluito in 1x PBS contenente il 3% NGS per 24 hr. Tempo di incubazione inferiore può essere utilizzata per accorciare il protocollo, sebbene abbiamo trovato che una notte di incubazione di solito si traduce in un segnale più forte. Fino a 48-72 ore di incubazione potrebbe essere richiesto per anticorpi primari affinità basse come IgM.
5. Il giorno2, lavare 3x 10 minuti con PBS 1x.
6. Protocollo con l'anticorpo post-fissazione: incubare 1 ora con l'anticorpo secondario accoppiato con un colorante fluorescente verde, a 1/200 in 1x PBS contenente il 3% NGS. Lavare tre volte 10 min con 1x PBS. Post-fissazione viene eseguita con 2% PFA in 1x PBS per 10 min *. Lavare 3x 10 minuti con PBS 1x.
   Protocollo con rilevamento TSA: incubare 1 ora con l'anticorpo secondario HRP-accoppiata a 1/250 in 1x PBS contenente il 3% NGS. Lavare tre volte 10 min con 1x PBS. Procedere con rilevazione tiramide secondo le istruzioni del produttore. Come indicato sopra (passo 7.9), la diluizione dei reattivi e del tempo di reazione deve essere determinato empiricamente. Nella maggior parte dei casi, il protocollo è stato basato su una diluizione 1/500 del substrato fluorescente e un tempo di reazione 10 min. Lavare 3x 10 minuti con PBS 1x.
   Nota *: Post-fissazione è un passo fondamentale in immuno-FISH, e richiede un attento set-up. Più forte è il post-fissazione delmeglio il segnale IF, e minore è l'efficienza DNA-FISH.
7. Procedere con il DNA-FISH dalla fase di metanolo-acido acetico (punto 6.3). Durata della immuno-DNA-FISH è in genere tre giorni, con il primo anticorpo incubato per una notte.

9. Doppio FISH DNA-RNA Accoppiato con immunofluorescenza

Vedere la Figura 1, scatole arancioni per una visione d'insieme.

RNA-FISH viene eseguita per prima, seguita da immunofluorescenza, ed infine DNA-FISH. Se immunofluorescenza viene rilevato da reazione tiramide, è la chiave per estinguere completamente l'attività HRP dalla fase di RNA-FISH con H ₂ O _2, e per verificare che tempra è efficiente. Questo viene fatto utilizzando una diapositiva come controllo "no anticorpo primario".

Perché la disidratazione a base di etanolo è deleteria per alcune proteine ​​sensibili ai solventi, questa fase della RNA-FISH può inibire immunofluorescenza. Se è così, RNA-FISH può essere eseguita wesima un protocollo alternativo, come dettagliato di seguito in STPE 9.3.

1. Preparare la seguente soluzione prima di iniziare:
   
   50% formammide in 1x PBS contenente 2 mM RVC
   
2. Il giorno 1, preparare la sonda RNA-FISH e procedere come per il doppio RNA-FISH, fino alla H ₂ O ₂ step quenching (fase 7.2).
3. Caso 1, la colorazione immunofluorescenza funziona dopo etanolo disidratazione: procedere con RNA-FISH, come sopra indicato nei passaggi 7,3-7,9. Quindi procedere al punto 9.6.
4. Caso 2, la colorazione immunofluorescenza è impedito dal trattamento etanolo: Porre i vetrini in una camera umidificata su un riscaldatore diapositiva impostato a 65 ° C e incubare per 1,5 ore in una soluzione di preibridazione contenente 50% formammide, 1x PBS, e 2 mM RVC. Scolare la soluzione prehybridization e rilasciare 80 ml di soluzione di ibridazione, come indicato nei passi 7.4 e 7.5. Quindi procedere con l'RNA-FISH ibridazione e rilevazione come indicato above nei passaggi 7,6-7,9 (giorno 2 e 3).
5. Il giorno 2, dopo la RNA-FISH è completato, procedere con immuno-DNA-FISH di iniziare con il passo smascheramento (vedi punto 6.2). Quindi, seguire il protocollo immuno-DNA-FISH, come sopra indicato nei passaggi 8,2-8,6.

10. Cursore di montaggio e Imaging

1. Preparare la seguente soluzione prima di iniziare:
   
   Hoechst 33342 a 0.5 mg / ml in PBS 1x
   
2. Nuclei macchia per 10 minuti con DAPI o Hoechst 33342 * a 0.5 mg / ml in PBS 1x per 10 min. Lavare 3x 10 minuti con PBS 1x.
   Nota *:. Attenzione Se uno dei sistemi di rilevamento utilizza un colorante blu fluorescente, non utilizzare DAPI o Hoechst. Invece, utilizzare un fluorescente coloranti DNA con spettri di emissione entro la lunghezza d'onda lontano rosso come Topro3.
3. Scolate quanto più liquido possibile dalla diapositiva. Goccia 80 ml di mezzo di montaggio contenenti un agente antiscolorimento in un'estremità della slitta. Coprire le sezioni con un'alta qualità otticacoprioggetto (n ° 1.5 di vetro). Lasciate che il vetrino scendere lentamente mantenimento ad una estremità con una pinza, al fine di consentire al mezzo di montaggio spread sopra la sezione senza bolle.
4. Sigillare con smalto e conservare a 4 ° C in una scatola di diapositive scuro.
5. L'osservazione diretta del segnale di DNA-FISH di latenti HSV-1 genomi richiede un ingrandimento obiettivo 40X o superiore immersione in olio, con elevata apertura numerica (ad esempio 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) e una sorgente di luce di eccitazione almeno equivalente ad una lampada a mercurio da 100 W. Ti consigliamo di utilizzare un microscopio di trasmissione ad alta efficienza come quelli forniti dai produttori negli ultimi 5 anni (vedi tabella di attrezzature). Microscopia confocale fornisce gli strumenti per raccogliere le immagini con sfondo inferiori a causa di auto-fluorescenza del tessuto, come il taglio sottile o immagini spettrali.

Risultati

Dopo diversi mesi di test approfonditi, abbiamo scoperto che a base di calore chimico smascheramento fatto latente HSV-1 genoma disponibili per ibridazione in situ fluorescente. Durante il processo, abbiamo provato varie procedure smascheramento, e trattamenti a base di solo calore (cioè il riscaldamento delle sezioni fino a temperatura sub-di ebollizione in un forno a microonde) apparso efficiente. Abbiamo poi testato diversi buffer di sale che vengono abitualmente utilizzati in immunoistochimica (IH...

Discussione

Il protocollo qui descritto permette il rilevamento di HSV-1 genoma latente all'interno dei neuroni di sezioni di tessuto neuronali di topo. La nostra comprensione dei percorsi che regolano l'espressione genica virale è stata limitata dalla mancanza di metodo per rilevare HSV-1 DNA genomico in situ all'interno dei tessuti neuronali. Informazioni sul numero di copie del genoma e la proporzione dei neuroni infetti è venuto soprattutto da PCR sui neuroni dissociati ^11,12. Nel chiarire il r...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb/c mice	Janvier, France		6 week-old females
HSV-1 strains	SC16 strain (wild type)		See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride	Sigma	K2753	Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline	Sigma	07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (sterile)	Life Technologies	10010-015
Sucrose	Sigma	84100	Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS.
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	SAKURA	4583
Large vector DNA purification kit	Qiagen	12462	To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C
Nick translation kit	Roche Applied Sciences	10 976 776 001
Cy3-dCTP	GE Healthcare	PA53021	Protect from light
0.5 M EDTA	Sigma	E6758
G50 Mini spin column	GE Healthcare	27-5330-01
Salmon sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Ethanol molecular biology grade	Sigma	87047	Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Formamid Molecular biology grade	Sigma	F9037	Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe	Enzo Life Sciences	ENZ-40838
ImmEdge hydrophobic pen	Vector Laboratories	H-4000
20x Saline Sodium Citrate (SSC)	Sigma	S6639	Prepare a 2x SSC solution in ddH20.
Triton X-100	Sigma	T8787	Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use.
10 mM Sodium citrate pH 6.0	Sigma	S1804	Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use.
Acetic Acid	Sigma	320099
Methanol, molecular biology grade	Sigma	322415
Dextran sulfate - MW 500,000	Euromedex	EU0606-A
Denhardt's solution (100x)	Euromedex	1020-A
Rubber Cement "FixoGum"	Marabut	290110000
DNA purification kit  - Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
T7 in vitro transcription kit	Ambion Life Technologies	AM1314
Biotin-16-UTP	Roche Applied Sciences	11388908910
RNA purification minicolumn	Qiagen	73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex	New England Biolabs	S1402S
H2O2	Sigma	H3410	Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA	Invitrogen	15401011	prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000
Primary antibodies	any supplier		The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies	Invitrogen Life Technologies		The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20937	TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20932
Hoechst 33342	Invitrogen Life Technologies	H3570	Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution.
22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass	Electron Microscopy Sciences	72204-04
Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science
Superfrost glass slides	FisherScientific	12-550-15
Equipment/Material	Company	Reference	Note
Needle for infection			Glass micropipette hot drawn. Custom made.
Dissection equipment	Moria, France		Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump	Cole Palmer Instruments		Easyload Masterflex
Microsyringe pump device (Nano Pump)	kdScientific	KDS310
Cryostat	Leica France	CM 1510-1
-80 °C freezer	Sanyo		Ultra Low -80 °C
Domestic microwave oven
Dry block heater	Eppendorf	022670204
Incubator Slide moat	Boekel Scientific	240000
Coplin Jar	Dominique Dutscher	68512
Staining glass container	Dominique Dutscher	68506
Fluorescent microscope	Zeiss		The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series