Ultrasound Imaging guidata intracardiaca iniezione di sviluppare un modello murino di Breast Cancer metastasi cerebrali Seguito da longitudinale MRI

Riepilogo

Un seno cancro al cervello metastasi modello del mouse viene stabilito con ecografia guidata iniezione intracardiaca delle cellule MDA-MB231/Br-GFP. Sviluppo delle metastasi intracraniche multifocali è stato monitorato longitudinalmente utilizzando ad alta risoluzione di 9.4 T MRI.

Abstract

Metastasi cerebrali Cancro al seno, che si verificano nel 30% dei pazienti con carcinoma mammario in stadio IV, è associata ad alta mortalità. La sopravvivenza mediana è di soli 6 mesi. È fondamentale disporre di adeguati modelli animali per imitare la diffusione emodinamico delle cellule metastatiche nello scenario clinico. Qui, stiamo introducendo l'uso di piccolo ecografia animale per guidare un'iniezione accurata delle cellule tumorali mammarie tropicale cervello nel ventricolo sinistro di topi nudi atimici. MRI longitudinale viene utilizzato per valutare iniziazione intracranica e la crescita delle metastasi cerebrali. Iniezione intracardiaca ecoguidata garantisce non solo un'iniezione accurata e pertanto un più alto tasso di successo, ma anche diminuito significativamente il tasso di mortalità, rispetto al nostro precedente procedura manuale. In vivo alta risoluzione MRI permette la visualizzazione di lesioni iperintense multifocali, piccolo come 310 micron di diametro sulle immagini T _2-pesate a tre settimane dopo l'iniezione. Follow-up MRI rivela la crescita del tumore intracranico e aumento del numero di metastasi che distribuiscono in tutto il cervello.

Introduzione

Cervello metastasi è il tumore maligno intracranica più comune negli adulti. La prognosi è estremamente povero, con una sopravvivenza mediana di 4-6 mesi, anche con un trattamento aggressivo. Il cancro al seno è uno dei tre principali tumori primari con alta morbilità di metastasi cerebrali ^1-3. Diverse linee di cancro al seno brain-tropico sono in grado di sviluppare metastasi cerebrali dopo intracardiaca o iniezione intracarotidea ^4. Iniezione diretta di cellule tumorali nel ventricolo sinistro può ignorare il letto capillare polmonare e quindi aumentare l'incidenza di formare metastasi cerebrali minimizzando metastasi viscerali. La linea MDA-MB231Br è una delle linee di cancro al seno più utilizzati umane per sviluppare metastasi cerebrali in modelli di roditori ^5,6.

Come molti altri studi ^4,7, abbiamo eseguito una procedura manuale di iniezione intracardiaca nei nostri studi precedenti. Tuttavia, solo il 50% tasso di successo è stato ottenuto con il manualeiniezione e una frazione di topi morti per le procedure invasive ripetute se studi precedenti fallito. Qui, stiamo introducendo l'uso di una procedura di imaging-guidata per garantire l'iniezione di cellule di carcinoma mammario-cervello cerca nel ventricolo sinistro di topi atimici. Longitudinale alta risoluzione MRI è applicata a seguire lo sviluppo intracranica di metastasi cerebrali.

Protocollo

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso del University of Texas Southwestern Medical Centro.

1. Preparazione delle cellule MDA-MB231/Br-GFP

1. Recuperare e coltivare le cellule MDA-MB231/Br-GFP (gentilmente fornite da DRS. Palmieri e Steeg, NCI) in DMEM contenente 10% FBS, 1% glutamina e 1% di penicillina / streptomicina.
2. Osservare la condizione delle cellule e colore del mezzo, e sostituire medio ogni 2-3 giorni.
3. Trypsinize e raccogliere le cellule quando l'80% di confluenza è raggiunto, come indicato dal passo 1.3.1-1.3.5:
   1. Rimuovere il vecchio mezzo completamente e aggiungere 5 ml di PBS (1x) per lavare le cellule delicatamente. Rimuovere la PBS dal piatto.
   2. Aggiungere 1,5 ml di tripsina nel piatto; inclinare il piatto delicatamente per avere tutte le celle sono coperti da tripsina. Mettere il piatto di nuovo al incubatore cella e la tiene a 37 ° C per 1 min.
   3. Prendete il piatto di incubatore e osservarele cellule sotto il microscopio ottico per assicurare le cellule si staccano dal piatto.
   4. Aggiungere 3 ml mezzo per fermare l'effetto della tripsina. Raccogliere la miscela di cellule in una provetta da centrifuga. Centrifugare la miscela a 2.000 rpm per 5 min.
   5. Rimuovere accuratamente il mezzo e sospendere nuovamente le cellule in 5 mezzo privo di siero ml fino omogeneo.
4. Contare numero appropriato di cellule e risospendere in mezzo DMEM privo di siero con una concentrazione finale di 1,75 x 10 ⁵ cellule in 100 microlitri di volume.
   1. Prendere 50 microlitri miscela di cellule e aggiungere 50 microlitri Trypan Blue. Dopo la miscelazione, prendere 10 microlitri miscela e con attenzione aggiungere alla diapositiva conteggio delle cellule. Utilizzare campioni multipli per garantire il numero di cellule stima accurata.
   2. Stick nella diapositiva conteggio delle cellule, un capo alla volta e il contatore delle cellule inizia a contare automaticamente. Prendere media di tutti i risultati del conteggio e calcolare il numero totale delle cellule.
   3. Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere inil volume appropriato di mezzo privo di siero per determinare la concentrazione finale di 1,75 x 10 ⁵ cells/100 microlitri volume.
5. Cellule posto sul ghiaccio prima di iniezione intracardiaca.

2. Ultrasound Imaging guidata iniezione intracardiaca

1. Utilizzare topi nudi femminili (BALB / c nu / nu) tra 6-8 settimane.
2. Accedere al sistema di imaging. Inizializzare il trasduttore 704 (40 MHz).
3. Inizia un nuovo studio e inserire le informazioni.
4. Anestetizzare (3% isoflurane/100% O ₂ in una camera di induzione) e mantenere gli animali con isoflurano (2%) in 100% O ₂ (1 dm ³ / min) durante l'intera procedura tramite un'ogiva. L'anestesia è confermata quando nessun ritiro riflesso si osserva con pizzico punta.
5. Impostare la temperatura del tavolo di imaging a 37 ° C. Nastro il topo anestetizzato alla tabella di imaging riscaldata in posizione supina.
6. Mantenere il gel ultrasuoni a 37 ° C prima di iminvecchiamento. Applicare il gel sul torace del mouse.
7. Montare il trasduttore nel supporto. Abbassare il trasduttore fino a raggiungere la profondità delle immagini desiderata. Spostare lo stadio fino a quando il ventricolo sinistro si identifica con l'aorta ascendente il punto di riferimento (Figura 1A). Bloccare la fase in cui una chiara visione del ventricolo sinistro viene visualizzato.
8. Disegnare 100 ml di miscela di cellule in una siringa da 1 ml con un ago G 22. Posizionare e fissare la siringa sulla siringa montaggio.
9. Spostare la siringa in avanti verso il petto del mouse e spostare con cura un lato all'altro fino a che la punta dell'ago sia nel campo dell'imaging di vista (prima di entrare il mouse).
10. Regolare l'altezza dell'ago e l'angolo di puntare verso il basso il ventricolo sinistro.
11. Penetrare l'ago della siringa nello spazio intercostale tempestivamente, attraverso la pelle e muscoli strati nel ventricolo sinistro sotto la guida di imaging ad ultrasuoni.
    Un'indicazione del successo di inserimento dell'ago nel ventricolo di sinistracolo è il reflusso del sangue arterioso fresco (colore rosa in contrasto con sangue venoso rosso scuro) nella siringa
12. Iniettare la miscela di cellule lentamente (Figura 1B).
13. Al termine, togliere l'ago, sollevare il trasduttore, pulire il gel per ultrasuoni con una garza umida e rimuovere il nastro.
14. Preparare una gabbia pulita con un tampone preriscaldato.
15. Mettere l'animale sul pad e osservare l'animale fino a completa guarigione.
16. Monitorare il comportamento dell'animale ogni 24 ore per due giorni.
17. Condizioni generali e segni neurologici di complicanze nei topi sperimentali sono regolarmente monitorate.

3. RM Monitoraggio dello sviluppo del tumore intracranico

1. Utilizzare un Tesla magnete 9.4 per monitorare lo sviluppo intracranica di metastasi cerebrali.
2. Avviare MRI due settimane dopo l'impianto del tumore e ripetere una volta a settimana per un massimo di tre settimane.
3. Sedare gli animali con il 3% isoflurano e mantenerli sotto geneanestesia ral (1,5% isoflurano).
4. Monitorare e mantenere la temperatura corporea degli animali e costante respirazione tutto l'esperimento.
5. Risoluzione multistrato alta (14 fette con spessore di 1 mm, senza gap) T ₁ - e T _2-pesate coronali, che copre la regione del lobo frontale della fossa posteriore, sono acquisiti con i seguenti parametri: T immagini ₁ ponderati: girare eco fetta multipla (SEMS), TR / TE = 400 msec msec/20, matrice: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, nella risoluzione aereo: 78 x 78 micron ^2. T immagini _2-pesate: fast spin echo fetta multipla (FSEMS) sequenze, TR / TE = 2500 msec/48 msec, 8 treni eco, matrice: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, nella risoluzione aereo: 78 x 78 micron ^28,9.
   Lesioni tumorali appaiono più luminoso rispetto ai normali tessuti cerebrali su T immagini _2-pesate.
6. Dimensioni del tumore è determinata su magliette immagini _2-ponderata delineando manualmente il enhanziamento parte della massa su ogni immagine utilizzando programmi MATLAB scritti da noi ^8.
   Considerata la maggior parte del tumore diametri sono più piccoli rispetto allo spessore fetta (1 mm), la dimensione del tumore è presentato come nell'attuale piano anziché il volume.

4. H & E colorazione Confermando le metastasi

1. Sacrifica i topi subito dopo la scansione l'ultima MR, sezionare il cervello di tumore e incorporarlo in ottobre a medio e congelati in -80 ° C.
2. Sezione di una serie di 10 micron di spessore cervello coronale campioni con criostato.
3. Eseguire la colorazione H & E sulle sezioni cerebrali.

Risultati

Con l'alta risoluzione spaziale della RM (78 micron di risoluzione aereo), lesioni iperintense possono essere identificati piccolo come 310 micron di diametro (Figura 2). Dal momento che le metastasi in questo studio sono molto piccoli e lo sviluppo di necrosi ed edema è minima, la lesione iperintensa su magliette immagini _2-pesate davvero rappresentato la massa tumorale.

MRI studi longitudinali permettono la valutazione vivo non invasiva della cresc...

Discussione

Nel presente studio, abbiamo dimostrato che l'ecografia iniezione ventricolare sinistra di imaging guidata garantisce l'accuratezza modo che è stata osservata ogni animale in questo studio sviluppato metastasi cerebrali e non la morte degli animali. La bellezza di iniezione immagine-guida è che il percorso di penetrazione dell'ago della pelle e, infine, nel ventricolo sinistro può essere monitorato e regolato sotto la foto, che è distinta dalla procedura manuale che richiede severe punti di repere anatom...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30022.01
Trypsin	Mediatech	25-051-C1
Automatic cell counter	BioRad	TC10
Isoflurane	Baxter International Inc.	1001936060
VisualSonics Vevo 770 High-Resolution Imaging System	Visual Sonics Inc.
9.4 T horizontal bore magnet with a Varian INOVA Unity system	Agilent
O.C.T Compound	Sakura Finetek USA	4583