Monitoraggio della concorrenza intraspecie in una popolazione di cellule batteriche mediante cocultivazione di ceppi marcati fluorescentmente

Riepilogo

I batteri possono accumulare mutazioni dannose o benefiche durante la loro vita. In una popolazione di cellule individui che hanno accumulato mutazioni benefiche possono rapidamente sovracompetire i loro simili. Qui presentiamo una procedura semplice per visualizzare la competizione intraspecie in una popolazione di cellule batteriche nel tempo utilizzando individui etichettati fluorescentmente.

Abstract

Molti microrganismi come i batteri proliferano estremamente velocemente e le popolazioni possono raggiungere alte densità cellulari. Piccole frazioni di cellule in una popolazione hanno sempre mutazioni accumulate che sono dannose o benefiche per la cellula. Se l'effetto di forma fisica di una mutazione fornisce alla sottopopolazione un forte vantaggio di crescita selettiva, gli individui di questa sottopopolazione possono rapidamente sovracompetarsi e persino eliminare completamente i loro compagni immediati. Pertanto, piccoli cambiamenti genetici e accumulo di cellule basate sulla selezione che hanno acquisito mutazioni benefiche possono portare a uno spostamento completo del genotipo di una popolazione cellulare. Qui presentiamo una procedura per monitorare la rapida espansione clonale e l'eliminazione delle mutazioni benefiche e dannose, rispettivamente, in una popolazione di cellule batteriche nel tempo per cocultivazione di individui etichettati fluorescentmente del batterio modello Gram-positivo Bacillus subtilis. Il metodo è facile da eseguire e molto illustrativo per mostrare la competizione intraspecie tra gli individui in una popolazione di cellule batteriche.

Introduzione

I batteri del suolo sono solitamente dotati di reti normative flessibili e ampie capacità metaboliche. Entrambe le caratteristiche consentono alle cellule di regolare i loro percorsi catabolici e anabolizzanti per competere con i loro simili e altri microrganismi per i nutrienti, che sono disponibili in una data nicchia ecologica¹. Tuttavia, se i batteri non sono in grado di adattarsi al loro ambiente, altri meccanismi possono causare la sopravvivenza di una specie. Infatti, poiché molti batteri proliferano rapidamente e le popolazioni possono raggiungere sottopopolazioni ad alta densità cellulare possono avere mutazioni benefiche accumulate spontaneamente che forniscono alle cellule un vantaggio di crescita selettivo e quindi aumentano la loro forma fisica. Inoltre, gli hotspot mutazionali e la mutagenesi adattiva indotta dallo stress possono facilitare l'evoluzione di un batterio^{maladotto 2,3}. Pertanto, l'accumulo di mutazioni e la crescita sotto selezione continua è l'origine dell'enorme diversità microbica, anche all'interno dello^{stesso genere 4,5}. Come in natura, la formatura dei genomi batterici si verifica anche in laboratorio a causa della coltivazione continua in fase di selezione. Ciò è esemplificato dall'addomesticamento del batterio Gram-positivo B. subtilis, che viene utilizzato in tutto il mondo nella ricerca di base e nell'industria. Negli anni '40 B. subtilis è stato trattato con raggi X dannosi per il DNA seguiti da coltivazioni in una specifica condizione di crescita⁶. Le mutazioni che si sono accumulate nei batteri durante la loro addomesticamento causano la perdita di molte caratteristiche di crescita, cioè il ceppo di laboratorio B. subtilis 168 ha perso la capacità di formare colonie complesse^7,8.

Al giorno d'oggi, per i batteri modello meglio studiati Escherichia coli e B. subtilis, è disponibile una varietà di potenti strumenti per manipolare geneticamente i loro genomi al fine di affrontare specifiche questioni scientifiche. A volte l'inattivazione di un gene di interesse causa un grave difetto di crescita, che è quindi chiaramente visibile sul mezzo di crescita standard⁹. Al contrario, le mutazioni che causano un difetto di crescita debole e quindi influenzano solo leggermente la forma fisica del ceppo vengono spesso ignorate. Tuttavia, in entrambi i casi l'incubazione prolungata e la passatura dei ceppi mutanti per diverse generazioni di solito si traducono nell'accumulo di mutanti soppressori che hanno ripristinato il fenotipo del ceppo^{genitore 2,9}. La caratterizzazione dei mutanti soppressori e l'identificazione delle mutazioni che hanno ripristinato il difetto di crescita del ceppo mutante genitore è un approccio molto utile che consente la spiegazione di processi cellulari importanti e spesso^{nuovi 10,11}.

Siamo interessati al controllo dell'omeostasi glutammato in B. subtilis¹². Simile a E. coli, B. subtilis risponde alla perturbazione dell'omeostasi del glutammato ( cioè blocco nella degradazione del glutammato²)dall'accumulodi mutanti soppressori. Le alterazioni genomiche in questi mutanti soppressori che sono state acquisite da mutazioni spontanee hanno dimostrato di ripristinare rapidamente l'omeostasi del glutammato^9,13. Pertanto, non sorprende che l'adattamento di B. subtilis a una condizione di crescita specifica durante l'addomesticamento del batterio si rispecchi nella sintesi enzimatica e nelle attività enzimatiche evolute, che sono coinvolte nel metabolismo del glutammato¹². È stato suggerito che la mancanza di glutammato esogeno nel mezzo di crescita durante il processo di addomesticamento sia stata la forza trainante per l'emergere e la fissazione del gene criptico glutammato deidrogenasi (GDH) gudB^CR nel ceppo di laboratorio 168^2,14. Questa ipotesi è supportata dalla nostra osservazione che la ridotta quantità di attività GDH nel ceppo di laboratorio fornisce ai batteri un vantaggio di crescita selettivo quando il glutammato esogeno è^{scarso 2}. Inoltre, la coltivazione di un ceppo di B. subtilis, sintetizzando il GDH GudB, in assenza di glutammato esogeno provoca l'accumulo di mutanti soppressori che hanno inattivato il gene gudB ². Ovviamente, la presenza di un GDH catabolicamente attivo è svantaggiosa per la cellula perché il glutammato prodotto endogenamente che potrebbe altrimenti essere utilizzato per l'anabolismo è degradato all'ammonio e al 2-ossoglutarato (Figura 1). Al contrario, quando il glutammato è fornito dal mezzo, un ceppo B. subtilis dotato di attività GDH di alto livello ha un vantaggio di crescita selettivo rispetto a un ceppo che sintetizza un solo GDH funzionale. È ragionevole supporre che l'attività gdh di alto livello consenta ai batteri di utilizzare il glutammato come seconda fonte di carbonio oltre ad altre fonti di carbonio fornite dal^{mezzo 2} (vedi figura 1). Pertanto, l'attività GDH influisce fortemente sulla forma fisica dei batteri, a seconda della disponibilità di glutammato esogeno.

Qui presentiamo un metodo molto illustrativo per monitorare e visualizzare la competizione intraspecie tra due ceppi di B. subtilis che differiscono in un singolo locus sul cromosoma (Figura 2). I due ceppi sono stati etichettati con i geni yfp e cfp che codificano i fluorofori YFP e CFP e cocultivati in diverse condizioni nutrizionali. Campionando nel tempo e placcando adeguate diluizioni su piastre di agar, i sopravvissuti in ciascuna delle colture potrebbero essere facilmente monitorati utilizzando un comune microscopio a fluorescenza stereo. La procedura descritta in questo articolo è facile da eseguire e adatta a visualizzare la rapida espansione clonale e l'eliminazione delle mutazioni benefiche e dannose, rispettivamente, in una popolazione cellulare nel tempo.

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Protocollo

1. Preparazione di piatti Agar, media culturali, criostock e preculture

1. Preparare i mezzi di crescita e i reagenti richiesti (vedi tabella dei materiali e dei reagenti).
2. Striature i ceppi di B. subtilis (ad es. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) e BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) esprimendo rispettivamente uno e due GDH attivi)² che saranno utilizzati nell'esperimento di competizione su piastre di agar medie SP per ottenere singole colonie. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
3. Assumere singole colonie e inoculare tubi di coltura sterile contenenti 4 ml di mezzo liquido LB. Far crescere i batteri durante la notte a 28 °C e 220 giri/min.
4. Coltivare colture notturne a 28 °C per evitare che le cellule si lecivano o spopolano.
5. Misurare la densità ottica delle colture ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD₆₀₀) utilizzando uno spettrofotometro standard.
6. Se le colture hanno raggiunto un OD₆₀₀ di 2.0, mescolare 0,75 ml delle colture con 0,75 ml di una soluzione sterile di glicerolo al 50% in tubi di reazione da 1,5 ml. L'OD_{600 finale} deve essere 1.0 per ottenere criostock contenenti circa 10⁸ cellule/ml.
7. Conservare i tubi a -80 °C.
8. Creare tre preculture di ogni ceppo etichettate con i geni cfp e yfp che codificano i geni del fluoroforo. Inoculare le precolture (tubi di coltura sterile contenenti 4 ml di mezzo liquido LB) con 1 μl di cellule da criostock a -80 °C. Incubare le colture durante la notte a 28 °C e 220 giri/min.

2. Cocultivazione di batteri, raccolta di campioni e stoccaggio dei campioni

1. Preparare al minimo 100 ml di C-Glc e CE-Glc (vedi tabella dei reagenti e dei materiali) e trasferire 20 ml di ogni mezzo in contenitori sterili da 100 ml di frullato.
2. Assumere 0,1 ml delle preculture coltivate durante la notte, diluirle con un mezzo LB da 0,9 ml in una cuvetta da 1,5 ml e determinare l'OD₆₀₀.
3. Per l'esperimento di competizione, prendere quelle preculture dei diversi ceppi che hanno un OD_{600 simile} tra 1.0-1.5.
4. Per ottenere popolazioni di cellule miste, diluire le cellule delle precolture che avevano l'OD₆₀₀ appropriato a un OD₆₀₀ di 0,05 in 20 ml di C-Glc e ce-Glc minimo mezzo integrato in flaconi di frullato da 100 ml. Per l'esperimento di competizione i due ceppi dovrebbero essere mescolati in un rapporto 1:1.
5. Prelevare campioni da 10 ml dai contenitori, trasferirli in tubi di plastica da 15 ml, raccogliere le cellule per centrifugazione per 10 min a 4.000 x g in una centrifuga da tavolo standard e scartare il supernatante.
6. Rimorsi le cellule in un mezzo LB fresco da 0,5 ml e trasferire le cellule in una tazza di reazione sterile da 1,5 ml. Aggiungere 0,5 ml di glicerolo sterile al 50%, mescolare la sospensione con un vortice rigoroso e conservare i campioni in un congelatore a -80 °C fino a un ulteriore trattamento.
7. Incubare le cellule che vengono lasciate nei contenitori di scuotimento per un massimo di 24 ore a 37 °C e 220 giri/min. Tenere i mastri di scuotimento al buio per evitare lo sbiancamento fotografico dei fluorofori.
8. Prelevare ulteriori campioni da 0,1 ml dopo 7 ore e 24 ore di crescita. Misurare e notare l'OD₆₀₀ di diluizioni 1:10 (in C-Glc o CE-Glc mezzo minimo) dei campioni.
9. Prendi la quantità appropriata di cellule da ogni coltura per creare criostock che hanno un OD₆₀₀ di 1,0. Conservare i campioni a -80 °C fino a un ulteriore trattamento.

3. Trattamento del campione, placcatura e incubazione per analisi quantitative

1. Dopo aver raccolto tutti i campioni, scongelare i criostock e diluire le cellule in una soluzione salina allo 0,9% (vedi tabella dei reagenti e dei materiali) fino a^10-3.
2. Piastra 0,1 ml delle^10-3 diluizioni su piastre di agar medie SP e distribuire le celle utilizzando pipette di vetro sterili.
3. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C al buio fino a quando non sono apparse singole colonie.

4. Conteggio dei sopravvissuti mediante microscopia a fluorescenza stereo per l'analisi quantitativa

1. Dividi il fondo della piastra dell'agar con una penna nera in quattro parti per un migliore orientamento mentre conti i sopravvissuti sotto il microscopio a fluorescenza stereo.
2. Posizionare la piastra capovolta al microscopio e mettere a fuoco le colonie utilizzando la fonte di luce fredda.
3. Una volta che le colonie sono a fuoco, passare al set di filtri appropriato per la PCP per visualizzare le cellule sopravvissute del ceppoetichettato cfp. Conta i sopravvissuti di questo ceppo etichettando le colonie con una penna e annota il numero.
4. Rimuovere le etichette con etanolo e passare al filtro YFP impostato per visualizzare le cellule sopravvissute del ceppo etichettato yfp. Conta di nuovo i sopravvissuti etichettando le colonie con una penna e annota il numero.

5. Trattamento del campione e microscopia per analisi semiquantitative

1. Per cifre illustrative, individuare 10 μl della diluizione^10-4 (circa 100 celle) dal passaggio 3.1 su una piastra di agar SP (vedere figura 3).
2. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C al buio fino a quando non sono apparse singole colonie.
3. Posizionare la piastra di Petri senza coperchio al microscopio e mettere a fuoco il punto utilizzando la fonte di luce fredda.
4. Scatta foto dei punti per figure illustrative. Scegli un tempo di esposizione appropriato per scattare le foto delle colonie con la fonte di luce fredda.
5. Senza spostare la piastra, passare al set di filtri CFP, regolare il tempo di esposizione e scattare una foto. Fai lo stesso con il set di filtri YFP e salva le immagini per ulteriori analisi.

6. Analisi dei dati

1. Utilizzare software come Excel per le analisi quantitative dei dati. In base alle colonie contate, calcola la percentuale di colonie gialle e blu rispetto all'intero numero di colonie, che sono impostate al 100%.
2. Utilizzare i numeri calcolati per creare un diagramma a barre in pila (vedere figura 4 e figura 5). Utilizzate un programma di elaborazione delle immagini come Adobe Photoshop per costruire immagini unite delle immagini scattate dai diversi punti. In alternativa, il software liberamente disponibile ImageJ, scaricabile da http://rsbweb.nih.gov/ij/ può essere utilizzato per l'elaborazione delle immagini.
3. Aprire le immagini da un punto scattate con il set di filtri CFP e il set di filtri YFP. Ottimizza il contrasto e la luminosità per ridurre la fluorescenza di fondo dal supporto.
4. Passare a una delle immagini e selezionare tutte. Copiare l'immagine e incollarla nell'altra immagine.
5. Utilizzare la funzione "schivare il colore" per unire le immagini o sovrapporre le immagini fluorescenti utilizzando la scheda canali. Immagini unite delle colonie da diversi media e diversi punti di tempo rappresentano la crescita dei diversi ceppi all'interno della coltura liquida.

7. Suggerimenti specifici: esperimento di commutazione di colorante e cocultivazione di ceppi isogenici etichettati con cfp e yfp

L'espressione di uno dei due geni codificanti al fluoroforo in B. subtilis potrebbe influenzare la forma fisica e quindi il tasso di crescita dei batteri. Pertanto, si raccomanda di eseguire i seguenti esperimenti al fine di escludere che l'eliminazione di un ceppo concorrente dalla popolazione cellulare durante la coltivazione sia semplicemente dovuta a un effetto negativo del fluoroforo:

1. Ripetere l'intero esperimento e cocultivare ceppi etichettati inversamente (ad esempio, il ceppo precedente etichettato cfpè ora etichettato con il gene yfp e viceversa). Sebbene inversi, i risultati ottenuti dovrebbero essere paragonabili all'osservazione precedente secondo cui un ceppo ha un vantaggio di crescita selettivo rispetto all'altro ceppo.
2. Ripetere l'intero esperimento e cocultivare i ceppi isogenicietichettati con yfp e cfp ( ad esempio BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) e BP41 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). Stimare l'effetto negativo di uno dei due fluorofori sulla forma fisica dei batteri seguendo la composizione della popolazione cellulare nel tempo.

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Risultati

Il metodo qui descritto è stato applicato con successo per visualizzare la concorrenza intraspecie in una popolazione cellulare costituita da ceppi di B. subtilis etichettati rispettivamente con i geni cfp e yfp che codificano i fluorofori CFP e YFP. Come illustrato nella figura 3, il metodo può essere utilizzato per visualizzare la concorrenza intraspecie in modo molto illustrativo. Individuando i campioni su piccole aree, la composizione clonale della popolazione cellulare ...

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Discussione

Diversi metodi sono stati sviluppati per analizzare la forma fisica competitiva dei^{batteri 16}. In molti casi i batteri sono stati etichettati con diverse cassette di resistenza agli antibiotici¹⁷. Simile al nostro approccio, l'etichettatura delle cellule con cassette di resistenza agli antibiotici consente la valutazione della forma fisica competitiva dei batteri durante la cocultivazione in condizioni di crescita definite. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per determinare la forma fisic...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, Germany	5239
Glucose	Applichem, Germany	A3617
Glycerol	Roth, Germany	4043
K2HPO4•3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, Germany	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4•7H2O	Roth, Germany	P027
MnCl2	Roth, Germany	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth, Germany	9265
Nutrient broth	Roth, Germany	X929
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712
Tryptone	Roth, Germany	8952
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445
Yeast extract	Roth, Germany	2363
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000
Freezer (-20 and -80 °C)	-	-
Fridge (4 °C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	-
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9
Powerpoint program	Microsoft, USA	-
Office Excel program	Microsoft, USA	-	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	-
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g agar for solid SP medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB Medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
15 g agar for solid LB medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%)			autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) Solution
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)