Valutare progressione del ciclo cellulare delle staminali e cellule progenitrici del cervello di sviluppo del mouse dopo stress genotossico

Riepilogo

La somministrazione di due analoghi della timidina, EdU e BrdU, nei topi in gravidanza permette l'analisi della progressione del ciclo cellulare in cellule progenitrici neurali e nel cervello embrionale mouse. Questo metodo è utile per determinare gli effetti dello stress genotossico, incluse le radiazioni ionizzanti, durante lo sviluppo del cervello.

Abstract

Neuroni della corteccia cerebrale sono generati durante lo sviluppo cerebrale da diversi tipi di cellule staminali e progenitrici neurali (NSPC), che formano un epitelio pseudostratificato rivestimento ventricoli laterali del cervello embrionale. Stress genotossici, come le radiazioni ionizzanti, hanno effetti estremamente deleteri sullo sviluppo del cervello connesse con l'elevata sensibilità di NSPC. Delucidazione dei meccanismi cellulari e molecolari coinvolti dipende dalla caratterizzazione della risposta al danno del DNA di questi particolari tipi di cellule, che richiede un metodo preciso per determinare NSPC progressione attraverso il ciclo cellulare nel tessuto danneggiato. Qui viene mostrato un metodo basato su successive iniezioni intraperitoneali di EdU e BrdU nei topi in gravidanza e ulteriore rilevazione di questi due analoghi della timidina nelle sezioni coronali del cervello embrionale. EdU e BrdU sono entrambi incorporati nel DNA delle cellule si replicano durante la fase S e sono rilevate da due diverse tecniche (azide oun anticorpo specifico, rispettivamente), che facilita il loro rilevamento simultaneo. EdU e BrdU colorazione sono quindi determinate per ciascun nucleo NSPC in funzione della sua distanza dal margine ventricolare in una regione standard del telencefalo dorsale. Così questa tecnica dual etichettatura permette distinguere cellule che avanti attraverso il ciclo cellulare da coloro che hanno attivato un punto di controllo del ciclo cellulare che porta all'arresto del ciclo cellulare in risposta al danno del DNA.

Un esempio di esperimento viene presentato, in cui EdU stato iniettato prima dell'irraggiamento e BrdU immediatamente dopo e analisi effettuata all'interno del 4 ore dopo irradiazione. Questo protocollo fornisce un'analisi accurata della risposta al danno del DNA acuta di NSPC in funzione della fase del ciclo cellulare in cui sono stati irradiati. Questo metodo è facilmente trasponibile a molti altri sistemi per determinare l'impatto di un particolare trattamento sulla progressione del ciclo cellulare nei tessuti viventi.

Introduzione

Durante lo sviluppo embrionale del cervello, neuroni di proiezione della corteccia cerebrale sono generati nella zona ventricolare, un epitelio pseudostratificato composto da diversi tipi di staminali neurali e cellule progenitrici (NSPC) che riveste le ventricoli laterali. Tra NSPC, le cellule gliali radiali (RGC), che servono come le cellule staminali neuronali, subiscono migrazione nucleare interkinetic (INM): eseguono mitosi alla superficie del ventricolo e fase S al limite basale della zona ventricolare (VZ) ^{1, 2,3.} Essi possono suddividere simmetricamente per generare due RGC o asimmetricamente per generare un RGC e un neurone o una cellula intermedia progenitore (IPC) ^{4, 5.} IPC migrare verso uno strato sovrastante proliferare chiamata zona subventricolare (SVZ), dove, dopo un ultimo divisione simmetrica che generano due neuroni di proiezione immaturi ^6-8. Contrariamente a RGC, IPC non subiscono INM (recensito in ^9). Neuroni appena generati Migrmangiato radialmente lungo le fibre radiali attraverso la zona intermedia (IZ) per raggiungere la destinazione finale nella piastra corticale (CP) ^{10, 8.} Il tempismo perfetto di tutti questi eventi è essenziale per un corretto sviluppo corticale. Per esempio l'interruttore dalla proliferazione di differenziazione delle popolazioni progenitrici neurali è controllata dalla durata della fase G1 ^{11, 12.} L'allungamento della fase G1 correla quindi con differenziazione cellulare.

Stress genotossico, come le radiazioni ionizzanti, lo sviluppo del cervello compromettere gravemente (rivisto nel ^13). Noi e altri abbiamo dimostrato che NSPC sono molto inclini a radiazione indotta l'apoptosi ^{14, 15,16.} Le radiazioni ionizzanti inducono rotture del DNA doppie che sono i danni più gravi alle cellule proliferanti. Una componente essenziale della risposta al danno al DNA (DDR) nelle cellule ciclismo è l'attivazione di punti di controllo del ciclo cellulare ai G1 / S o G2 / M transizioni o durante Sfase (intra-S checkpoint) ^17-21. Bloccano la progressione del ciclo cellulare per fornire il tempo per riparare i danni del DNA o eliminazione delle cellule troppo danneggiate. Di conseguenza, la morte cellulare e la progressione del ciclo cellulare ritardato possono alterare lo sviluppo del cervello in risposta a esposizione a radiazioni ionizzanti ^22-24. Era quindi interessante sviluppare un metodo per valutare l'attivazione di punti di controllo del ciclo cellulare in NSPC nel topo cervello embrionale irradiato.

La progressione del ciclo cellulare è ordinariamente seguita mediante l'incorporazione di un analogo della timidina, 5-Bromo-2'-deossiuridina (BrdU). BrdU viene incorporata nella fase S del ciclo cellulare, quando il DNA si replica. L'uso di un anticorpo contro BrdU permette successivamente la rilevazione di cellule che erano in fase S durante l'impulso di BrdU.

Un analogico timidina romanzo, 5-etinil-2'-deossiuridina (UDE) è rilevata da un azide fluorescente. I diversi modi per rilevare EdU e B RDU non cross-reagisce ^25, consentendo il rilevamento simultaneo di entrambe analoghi della timidina, che è utile per lo studio della progressione del ciclo cellulare. Solitamente le cellule vengono prima pulsate con EdU e poi pulsate con BrdU, dove il tempo tra due incorporazioni dura paio d'ore ^{25, 26.} Aggiunta di BrdU in mezzi di coltura contenente EdU provoca preferenzialmente incorporazione di BrdU nel DNA con l'esclusione di EdU, mentre aggiunta simultanea di EdU ²⁵ con BrdU equimolare o mezza equimolare ai risultati di media in solo incorporazione di BrdU ^27. Questo semplifica il protocollo dual etichettatura eliminando le fasi di lavaggio che normalmente necessari per rimuovere la prima etichetta dal supporto di coltura prima dell'aggiunta della seconda etichetta. Ciò è di particolare interesse per lo studio in vivo, in cui le fasi di lavaggio non sono possibili, per determinare il tempo esatto della fase S entrata o di uscita della popolazione cellulare.

t "> Recentemente, è stato sviluppato un metodo di etichettatura con doppia impulsi in cervello di topo embrionale utilizzando EdU e BrdU ^{23, 24,22} per analizzare la progressione del ciclo cellulare e INM di NSPC dopo irradiazione in utero. Inoltre è stato dimostrato che, durante fase S, cellule di topo replicare prima le regioni eucromatina e poi il heterochromatin pericentrica ^28,29,30. interessante, eterocromatina pericentrica di diversi cromosomi raggruppati in nuclei interfasiche per formare foci eterocromatico noto anche come chromocenters e facilmente rilevabile con colorazione DAPI come foci brillante. Pertanto, i differenziali Edu e BrdU colorazioni di euchromatin e chromocenters ci ha aiutato ad analizzare con maggiore precisione la progressione fase S di NSPC.

Questo metodo ha permesso la dimostrazione della apparente mancanza di G1 / S checkpoint in NSCP ^22-24, che è abbastanza sorprendente, dal momento che questo checkpoint dovrebbe essere critica per la stabilità del genoma. Diversi expdisegni erimental basati su diverse combinazioni di Edu e BrdU impulsi sono stati utilizzati per analizzare la progressione del ciclo cellulare nel telencefalo ventrale e dorsale. Qui, diamo un esempio di protocolli per lo studio del danno al DNA acuta NSPC all'interno dei primi 4 hr seguente irradiazione in utero di embrioni di topo E14.5.

Protocollo

1. Procedure di animali

Questo protocollo è stato progettato in conformità con la Direttiva Comunità Europea del Consiglio, del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) ed è stato approvato dal nostro comitato istituzionale sul benessere degli animali (CETEA-CEA DSV IDF).

1. Iniezioni con EdU / BrdU e irradiazione della E14.5 topi in gravidanza (Figura 2A).
   1. Preparare una soluzione di EdU a 1 mg / ml e BrdU a 5 mg / ml in PBS. Eseguire una iniezione intraperitoneale (IP) di 100 pl di soluzione EdU usando un ago 25 G in topi in gravidanza. 1,5 ore dopo, irradiare i topi (irradiazione corporea totale) a 0 Gy o 2 Gy (0,6 Gy / min). Subito dopo, iniettare (IP) 200 ml di soluzione di BrdU utilizzando un ago G 25 nei topi in gravidanza.
2. Preparazione di fette coronali del cervello embrionali.
   1. A 1 ora o 4 ore dopo l'irradiazione, eutanasia i topi in gravidanza dal biossido di carbonio.
   2. Aprire l'Cavi addominalety oltre tre centimetri con le forbici. Separare le due corna uterine dal resto dell'utero sezionando due estremità delle corna. Trasferire le corna uterine in una capsula di Petri contenente PBS 0,6% di glucosio. Aprire le corna uterine con le pinze al fine di isolare gli embrioni. Rimuovere il sacco amniotico di ogni embrione usando le pinze.
   3. Sezionare teste embrionali con una pinza e fissarli per immersione in 4% paraformaldeide (PFA, pH = 7.4) O / N a 4 ° C.
   4. Sciacquare teste embrionali in PBS per almeno una notte a 4 ° C. Le teste possono essere tenuti in PBS per diversi giorni.
   5. Teste incorporare in paraffina utilizzando un processore infiltrazione sotto vuoto come indicato nella Tabella 1. Capi embedding possono anche essere eseguite sotto cappa chimica per l'etanolo e bagni xylen, e poi in un forno a 65 ° C per i bagni di paraffina.
   6. Preparare a 5 micron di spessore sezioni coronali con un microtomo.
   7. Montare su vetrini da microscopio polilisina rivestita.
   8. I vetrini possono essere conservati a temperatura ambiente (RT) per diversi mesi.

2. EdU / BrdU colorazione

1. Deparaffinizzazione e l'antigene smascheramento
   1. Deparaffinare le sezioni di cervello in paraffina per immersione di vetrini in 3 bagni di toluene per 5 min.
   2. Reidratare per 3 minuti in 2 bagni di ciascuna delle soluzioni di una minore concentrazione di etanolo come segue: etanolo 100%, etanolo 95%, etanolo al 70%, e 5 min in H ₂ O. I vetrini possono essere conservati in acqua deionizzata per diverse ore.
   3. Bollire le fette per 10 min in soluzione di citrato (10 mM, pH 6), e poi incubare in acqua deionizzata per 5 min.
2. EdU colorazione
   1. Eseguire il rilevamento EdU secondo il protocollo del produttore. Permeabilize cellule con 0,5% Triton X-100 in PBS per 10 minuti.
   2. Preparare additivo tampone 1X EdU diluendo la soluzione di 10X in acqua deionizzata. Questa soluzione deve essere preparata e utilizzata sulla stessa day.
   3. Preparare EdU cocktail di reazione, tra cui EdU Alexa Fluor 488 azide. È importante aggiungere gli ingredienti seguendo l'ordine elencato nella Tabella 2, in caso contrario, la reazione non procede in modo ottimale. Utilizzare il cocktail reazione EdU entro 15 minuti dalla preparazione.
   4. Rimuovere il buffer permeabilizzazione (passo 2.1.1), poi lavare due volte con PBS.
   5. Aggiungere 150 ml di EdU cocktail reazione, mettere un coprioggetto e incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
   6. Rimuovere il cocktail reazione EdU, quindi lavare una volta con PBS.
3. BrdU colorazione
   1. Preparare tampone di saturazione con siero di capra 7,5% e 7,5% di siero fetale bovino in PBS. Aggiungere 150 microlitri di tampone di saturazione su fettine cerebrali, mettere un coprioggetto e incubare per 1 ora a RT per bloccare legame di anticorpi non specifico.
   2. Rimuovere il vetrino. Aggiungere 150 ml di topo anti-BrdU anticorpo primario diluito a 1/300 in tampone di saturazione, mettere un coprioggetto e incubare O /N a 4 ° C.
   3. Rimuovere il vetrino, poi lavare 3 volte in PBS.
   4. Aggiungere 150 ml di capra anti-topo-Alexa594 anticorpo secondario diluito a 1/400 in tampone di saturazione, mettere un coprioggetto e incubare per 1 ora a RT.
   5. Rimuovere il vetrino, quindi lavare una volta in PBS.
   6. Colorazione nucleare: aggiungere 150 ml di 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) a 1 mg / ml in PBS, mettere un coprioggetto e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
   7. Montare i vetrini in mezzo di montaggio.

3. Analisi

1. Esaminare sezioni di cervello sotto un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 20X o un microscopio confocale e acquisire immagini in tre canali (488 nm, 594 nm e UV) e separa i file.
2. Stack le immagini con il software Photoshop.
3. Analizzare sezioni di cervello in un settore standard della parete cerebrale dorsomedial. Questo settore è 100 micron nella sua dimensione mediale-laterale ed è divisa in 18 bidoni (o più) di 10 μaltezza m nella sua dimensione radiale utilizzando una griglia sovrapposta sulle immagini (Figura 1) come descritto in precedenza ^31.
   1. Allineare la griglia come il primo bin sia in superficie ventricolare, con il suo asse parallelo al confine ventricolare. Poi numerare il etichettato EdU, BrdU e / o nuclei picnotici (corrispondenti a nuclei apoptotici) in ogni bin. Numero un nucleo situato sul confine di due scomparti nel raccoglitore che contiene la parte più grande, o al raccoglitore inferiore, quando il nucleo occupa aree uguali nei due scomparti.
4. L'analisi statistica.

Analizzare almeno due fette corticali per embrione. Ripetere gli esperimenti su almeno 3 embrioni provenienti da diverse cucciolate. I risultati devono essere espressi come media ± errore standard della media (SEM). Le analisi statistiche sono condotte con Graphpad Prism mediante ANOVA a due vie e Bonferroni più test di confronto POSTHOC.

Risultati

Nell'esperimento descritto nella Figura 2, EdU stata somministrata 1,5 hr prima dell'irraggiamento e BrdU appena dopo l'irradiazione. Quattro tipi di cellule sono state poi distinti in fette corticali preparati a 1 o 4 ore post-irradiazione, secondo l'incorporazione di uno o EdU BrdU, entrambi o nessuno (Figure 2A e 2B). Importante, né EdU né incorporazione di BrdU cambiato il livello di apoptosi indotta da radiazioni (dati non mostrati). Inoltre, i me...

Discussione

Il disegno sperimentale qui descritto sulla base di incorporazione di EdU 1,5 ore prima dell'irraggiamento e l'incorporazione di BrdU subito dopo l'irradiazione ha permesso la dimostrazione che NSPCs sono in grado di attivare S e checkpoint G2 / M, ma non il checkpoint G1 / S durante la 1 ^° ora dopo un stress genotossico nel cervello fetale mouse. Abbiamo eseguito altri esperimenti in cui EdU è stato iniettato in tempi diversi dopo l'irraggiamento e BrdU, a solo 1 ora prima topi sacrifici, c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
EdU	Life Technologies	A10044	1 mg/ml
BrdU	Life Technologies	B5002	5 mg/ml
IBL 637	CIS BIO International
Tissu Tek VIP	Leica
Microtome	Leica	RM 2125 RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit	Life Technologies	C10083
Anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1/300
Goat anti mouse-Alex594	Life Technologies	A11001	1/400
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01
Polysine slide	Thermo scientific	J2800AMNZ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS	Life Technologies	20012-068
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Microscope BX51	Olympus
Confocal microscope SPE	Leica
Prism software	Graphpad		Version 5.0c
Photoshop software	Adobe