Imaging attraverso il caso pupa di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Riepilogo

Questo documento dimostra l'uso di una scansione rapida microscopio confocale a comportamenti cella di immagine direttamente attraverso il puparium. Lasciando il bozzolo intatto, questo metodo permette l'osservazione e la misurazione dei processi cellulari dinamiche in una fase di sviluppo Drosophila che è difficile da studiare direttamente.

Abstract

L'uso di lunga data di Drosophila come modello per la biologia cellulare e dello sviluppo ha prodotto una serie di strumenti. Insieme, queste tecniche hanno permesso l'analisi di biologia cellulare e dello sviluppo da diverse angolazioni metodologiche. L'imaging dal vivo è un metodo emergente per osservare processi cellulari dinamici, come la divisione cellulare e la motilità cellulare. Avendo mutazioni isolato in non caratterizzate proteine ​​del ciclo cellulare putative divenne essenziale osservare mitosi in situ utilizzando l'imaging dal vivo. La maggior parte degli studi di imaging dal vivo in Drosophila sono concentrati sulle fasi embrionali che sono accessibili alla manipolazione e l'osservazione a causa delle loro piccole dimensioni e chiarezza ottica. Tuttavia, in queste fasi del ciclo cellulare è insolito in quanto manca di una o entrambe le fasi gap. Per contro, le cellule dell'ala pupa di Drosophila hanno un ciclo tipica cellula e sottoposti ad un periodo di rapida mitosi attraversa circa 20 ore di sviluppo pupa. È facile identify e isolare pupe della fase di catturare mitosi in situ. Montaggio pupe intatta disponibile la migliore combinazione di trattabilità e durata durante l'imaging, consentendo di eseguire esperimenti per diverse ore con un impatto minimo sulla vitalità cellulare e animale. Il metodo permette l'osservazione di caratteristiche più piccolo, o minore di, volare cromosomi. Regolazione delle impostazioni del microscopio e dei dettagli del montaggio, ha consentito l'estensione della preparazione per la visualizzazione dinamica della membrana delle cellule adiacenti e proteine ​​fluorescente come la tubulina. Questo metodo funziona per tutte le proteine ​​fluorescenti testate e in grado di catturare le caratteristiche di scala inferiori al micron su una varietà di scale temporali. Mentre limitato al esterno 20 micron della pupa con un microscopio confocale convenzionale, questo approccio all'osservazione proteine ​​e dinamiche cellulari nei tessuti pupa in vivo può essere generalmente utile nello studio della biologia cellulare e dello sviluppo in questi tessuti.

Introduzione

La mosca dell'aceto, Drosophila melanogaster, è un modello affermato per studiare molti aspetti della biologia. Ricerca Drosophila ha una storia ricca di sperimentazione genetica che permette forme sofisticate di manipolazione genetica, tra cui l'espressione, l'abbattimento e la mutazione. Con l'avvento delle etichette proteine ​​fluorescenti, questo repertorio si è ampliato per includere studi sulle cellule e proteine ​​in animali vivi. L'embrione mosca è un ottimo sistema per tali studi è piccolo e otticamente trasparente permettendo profondo, immagini ad alta risoluzione in vivo ^1-3. Altri stadi di sviluppo mosca hanno dimostrato di essere meno trattabili, che richiedono l'anestesia ^4, la dissezione e la cultura a breve termine ^5,6, o la creazione di finestre nella cuticola per l'imaging ^7,8. Queste manipolazioni solito compromettono sviluppo animale a lungo termine o influenzano l'animale in modo che limitano imaging per brevi periodi.

ent "> Per studiare nuove mutazioni in geni che assomigliano regolatori del ciclo cellulare, era essenziale trovare un'adeguata preparazione per studiare la sincronizzazione e la fedeltà del ciclo cellulare. Poiché la maggior parte cicli cellulari embrionali sono troncati (SM o S-G2-M) e mutanti in studio non mostrano difetti fino fasi successive, era importante osservare il ciclo cellulare nei tessuti stadio di pupa. delle cellule epiteliali della pupa hanno un più tipico ciclo cellulare G1-S-G2-M e pupe di questa fase sono non capace di movimenti muscolari ^9. Il punto di partenza iniziale per manipolazioni inclusa intatta tutta pupe esprimere Histone2AV-GFP. Nonostante l'apparente opacità del bozzolo, questa preparazione intatta rivelata eccellente per lungo termine imaging in vivo. Questa tecnica è semplice basta che i ricercatori universitari abitualmente usano per studiare gli aspetti di biologia cellulare e dello sviluppo in Drosophila, eppure la risoluzione è abbastanza fine per consentire la discriminazione delle caratteristiche scala micrometrica. Con questo metodo, le osservazioni degli eventi più ore, minuti o secondi sono possibili semplicemente regolando i parametri di serie temporali. Video che utilizzano proteine, verde, giallo, arancio, rosso e blu fluorescenti, o combinazioni di questi, sono stati fatti. È importante sottolineare che, se si fa attenzione a ridurre al minimo l'intensità del laser, anche di imaging a lungo termine non ha alcun effetto sullo sviluppo o la vitalità degli animali.

Protocollo

1. Vola lavoro

1. Mantenere mosche sul medio farina di mais-agar-melassa, lievito normale a temperatura ambiente ^10.
2. Per croci, isolare vergini entro 6 ore di eclosion. Dopo aver attraversato ai maschi del genotipo desiderato, il cambiamento vola a nuovi flaconi ogni 3-4 giorni.

Nota: Per questi esperimenti, la linea Gal4 A9 è stato usato per guidare l'espressione dei transgeni nell'ala. Fly azioni possono essere ottenute presso il centro stock a Bloomington. Azioni utilizzati in questi esperimenti includono A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow ^11.

2. Selezione e Montaggio di Pupae

1. Fase pupe avviene mediante la raccolta come prepupae bianco (WPP) e tenerli a 25 ° C fino a raggiungere l'età appropriata o utilizzando criteri morfologici ^12.
2. Per osservare divisioni cellulari, selezionare pupa che hanno recentemente subito la testa eversione.Da questo momento fino a poco prima eclosion (a> 96 ore), pupe vengono immobile permettendo di osservazione prolungato time-lapse.
3. Rimuovere pupe dai flaconi per primo toccandoli con un pennello inumidito con acqua, in attesa di un minuto per permettere all'acqua di allentare l'adesivo e poi delicatamente sollecitazione sul pennello.
4. Lavare delicatamente pupe scelto da loro incitando con un pennello in acqua per eliminare i di adesivi e prodotti alimentari ghiandole salivari particelle.
5. Trasferimento pupe pulito per un piatto 25 millimetri Petri con un fondo coprioggetto (numero 1 ½ lamelle).
6. Utilizzando sottili strisce di plastilina sia o cera dentale come supporto, montare pupe modo che il tessuto di interesse è più vicino al coprioggetto.
   Nota: Negli studi qui descritti, sono stati osservati ali pupa, gambe, addominali o histoblasts Notum dorsale. In pratica, qualsiasi tessuto entro 20 micron della superficie del bozzolo è osservabile.
7. Pupe Orient attenzione in modo che il Tissue di interesse è parallela alla superficie coprioggetto di vetro.
8. Una volta pupe sono montati, utilizzare un pennello per trasferire un sottile strato di thiodiethylene glicole (TDG) allo spazio tra la pupa e il coprioggetto.

Nota: TDG riduce la dispersione delle superfici, corrisponde l'indice di rifrazione di olio, e permette all'ossigeno di permeare il tessuto ^13. L'uso di oli non è consigliato, in quanto tendono a privare i tessuti di ossigeno, causando la rapida cessazione dei comportamenti cellulari.

3. Imaging

Nota: Per l'imaging, un microscopio confocale è probabile che sia essenziale come parafocalità rimuove la maggior parte dello sfondo oscuramento causato da intensa illuminazione del bozzolo.

1. Regolare le impostazioni sulla confocale per minimizzare l'impatto dell'illuminazione sullo sviluppo pupa e la redditività. Per fare questo, trovare un equilibrio tra l'intensità dell'eccitazione e della sensibilità della raccolta. Una configurazione tipica per l'imaging with Leica SP5 utilizzato lo scanner risonante (8,000 Hz), potenza del laser impostato a 2% (10% di trasmissione di potenza 20%), insieme pinhole a 120 micron, e la linea medie impostato a 8. Impostazioni variano a seconda delle condizioni sperimentali.

Nota: Per risolvere scala multa offre 40X e 63X lenti ad immersione ad olio (0,1 millimetri distanza di lavoro) sono stati anche utilizzati con successo in questo metodo, anche se limitano la profondità di fuoco.

4. Analisi

Per analizzare i frame, z-stack o film importare i file di dati FIJI, che dispone di strumenti efficaci per la visualizzazione, la misurazione e la modifica di file per la presentazione ^14. Ad esempio, il tempo di completare la mitosi è stata misurata utilizzando l'intervallo di campionamento e browser di immagine multidimensionale per scorrere fotogrammi durante la visione di una cellula da prophase a telofase. x, y, z-dimensioni può essere misurata utilizzando lo strumento di misura. Per le istruzioni dettagliate sul software e il suo utilizzovedi: http://fiji.sc/Fiji.

Risultati

Cellule in epiteli pseudostratificato, come la sviluppo occhio Drosophila, o lo strato ventricolare del sistema nervoso centrale dei vertebrati sviluppo, subiscono movimenti nucleari, definito migrazione nucleare interkinetic, in fase con il ciclo cellulare. La replicazione del DNA avviene quando i nuclei sono o vicino alla superficie basale e cellule entrano mitosi quando i nuclei raggiungono la superficie apicale ^15,16. Le cellule ala pupa formano un monostrato in rapida divisione epitelio durante ...

Discussione

Per visualizzare, misurare e quantificare le caratteristiche delle cellule in divisione, lo sviluppo necessario di una semplice preparazione per osservare mitosi nell'ala pupa vivente di Drosophila mediante analisi confocale di His2AvGFP cellule che esprimono. Questo metodo è stato usato per documentare che il ciclo cellulare nell'ala pupa somiglianze forti alla cella cicli in epiteli pseudostratificato dal fatto che nuclei mossa alla superficie apicale dell'epitelio cui entrano mitosi. Dopo telofa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly stuff fly pad	Genesee Scientific	59-114	for fly anesthetization
CO2 gas	Airgas South	CD50	For fly anesthetization
Regulator	Airgas South		CO2 regulator
Fly vials	Genesee Scientific	32-113RLBF	Fly culture
Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)	Bloomington Stock Center
Glass bottom dishes #1 1/2	WillCo Wells BV		For microscopy
Thiodiethylene Glycol	Fluka	88559	mountant
Modeling clay	art supply store		Support to position pupae against
Paintbrushes	art supply store		To manipulate flies
Fine Forceps, Inox #5	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
computer	any		8 Gb RAM for image/movie analysis
Fiji software		Free ware http://fiji.sc/Fiji	Image analysis software
Confocal microscope			Any fast scanning confocal should be sufficient
20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses	any		For imaging tissue, cellular, and subcellular features
Immersion oil (nonfluorescent)
Stereomicroscope	any		For fly manipulation