Nanopodia - sottili, fragili Proiezioni membrana con ruoli in movimento delle cellule e interazioni intercellulari

Riepilogo

Nanopodia sono canali di membrana sottile ma fragili che si estendono fino a 100 micron dai principali anteriore o posteriore finale di una cella e percepiscono l'ambiente cellulare. Fissaggio diretto a 37 ° C, lavaggio delicato, e di evitare di solventi organici come l'etanolo, metanolo o acetone e di maggiori Triton X-100 le concentrazioni sono tenuti ad osservare queste strutture cellulari.

Abstract

Cellule aderenti in coltura mantenere uno stato polarizzato per sostenere il movimento e le interazioni intercellulari. Nanopodia sono sottili, di forma allungata, in gran parte F actina-negativo-proiezioni di membrana in cellule endoteliali e tumorali che possono essere visualizzati attraverso TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) immunofluorescenza. Cluster TM4SF1 di 100-300 micron di diametro TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) contenente da 3 a ben 14 singoli TM4SF1 molecole. TMED sono disposte in modo intermittente lungo nanopodia ad una distanza regolare di 1 a 3 TMED per μ m ed ancorare saldamente nanopodia a matrice. Ciò consente nanopodia di estendere oltre 100 μ m dalla porta anteriore o posteriore finale delle cellule endoteliali tumorali o polarizzati, e fa sì che i residui di membrana di essere lasciato in matrix quando la cella si allontana. TMED e nanopodia sono stati trascurati a causa della loro estrema fragilità e sensibilità alla temperatura. Lavaggio di routine e la fissazione disturbare la struttura. Nanopodia sono conservate mediante fissaggio diretto in paraformaldeide (PFA) a 37 ° C, seguito da una breve esposizione al 0,01% Triton X-100 prima della colorazione. Nanopodia aprire nuovi orizzonti in biologia cellulare: promettono di rimodellare la nostra comprensione di come le cellule percepiscono il loro ambiente, rilevare e identificare altre cellule a distanza, avviare interazioni intercellulari a stretto contatto, e dei meccanismi di segnalazione coinvolte nel movimento, la proliferazione, e la cella -CELL comunicazioni. I metodi che sono sviluppati per lo studio nanopodia TM4SF1-derivati ​​possono essere utili per gli studi di nanopodia che si formano in altri tipi di cellule attraverso l'agenzia di tetraspanine classici, in particolare il ubiquitariamente espressa CD9, CD81 e CD151.

Introduzione

Durante la polarizzazione per il movimento, cellule animali si estendono una serie di dinamiche, protrusioni di membrana dalle loro superfici, tra cui filopodia, lamellipodia, fibre di retrazione, e volant ^1. Recentemente aggiunto a questa lista fosse nanopodia, un tipo recentemente riconosciuta sottile (100-300 micron di diametro), allungato (fino a 50-100 micron), membrana di proiezione che forniscono canali di membrana per l'estensione delle strutture di F-actina come filopodia e fibra di svincolo e quella macchia positivamente con TM4SF1 (transmembrana-4-L-sei-famiglia-1) in endoteliali tumorali e cellule in coltura ^2,3.

TM4SF1 è una proteina con topologia tetraspanin-come originariamente conosciuto come un antigene sulla cellula tumorale ⁴ prima della scoperta che la molecola è un biomarker cellule endoteliali che gioca un ruolo essenziale nella proliferazione delle cellule endoteliali e la migrazione ^2,3. Immunofluorescenza ha rivelato che TM4SF1 è localizzato perinucvescicole Lear e alla membrana plasmatica, e si arricchisce in TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED ancoraggio nanopodia alla matrice e presente in uno schema a fasce regolarmente distanziate di 1-3 lunghezza TMED / micron di nanopodia. Nanopodia tipicamente estendono dalla porta anteriore di una cella e finali posteriore durante polarizzazione cellulare per il movimento. A causa della natura aderente ditta di TMED, nanopodia sono in grado di rientrare nella cella mentre si allontana; residui nanopodia abbandonati tracciano così il percorso del movimento cellulare. Nanopodia fornire canali di membrana per l'estensione F-actina e retrazione, e sono siti di interazioni intercellulari e comunicazioni ^2,3. Queste caratteristiche fanno sì che nanopodia offrono un'opportunità unica di studiare i meccanismi alla base di montaggio F-actina durante la polarizzazione cellulare, rilevamento cellulare dell'ambiente, la determinazione del percorso e la direzione del movimento delle cellule, e le interazioni intercellulari unnd comunicazioni.

A causa della natura altamente idrofoba TMED e la natura membranoso sottile e fragile di nanopodia, particolare attenzione deve essere presa al fine di preservare TMED e nanopodia. La distruzione di nanopodia e la rimozione di TMED con metodi di laboratorio più comuni è un possibile motivo per cui solo sessantatré pubblicazioni sono apparsi su TM4SF1 fin dalla sua prima scoperta nel 1986 ¹ e per la totale mancanza di conoscenza di TM4SF1 arricchimento 100-300 micron microdomini su superficie delle cellule fino alla relazione del TM4SF1 in cellule endoteliali nel 2009 ^2.

Metodi di immunoistochimica convenzionali comunemente utilizzare solventi organici come etanolo, metanolo, acetone o riparare cellule e usare 0,1% o maggiore concentrazione di Triton X-100 per permeabilize celle ^5. Gli studi qui descritti implementati tre importanti modifiche al metodo convenzionale per rivelare TMED e nanopodia: (i) utilizzano 37 ° C 4% PFA e fissare le cellule a 3776; C incubatore, (ii) applicare dolce temperatura ambiente lavaggio PBS, e (iii) utilizzare meno dello 0,03% Triton X-100 solo brevemente permeabilize celle prima aggiunta di anticorpo primario, come Triton X-100 superiore a 0,03% estrarrà TM4SF1.

Tutti tetraspanine formano microdomini sulla membrana cellulare ⁶ e alcuni colocalize con TMED in endoteliali e cellule tumorali ^2,3. Come tetraspanine come CD9, CD81 e CD151 sono espressi ubiquitariamente, il protocollo di colorazione qui descritto può essere estesa a diversi tipi di cellule che mancano TM4SF1 per il controllo della funzione nanopodia.

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Protocollo

1. Coltura cellulare sul collagene rivestito disco di vetro

1. Dischi Luogo di vetro (12 mm di diametro) in un barattolo di vetro (4 oz) e autoclave per sterilizzare i dischi.
2. Mettete 25 ml di etanolo al 70% in un tubo Falcon da 50 ml e metterlo in una cappa di coltura cellulare. Questa soluzione può essere riutilizzato più volte fino a quando il livello della soluzione scende a 20 ml.
3. Posizionare una pinza nitide con un punto extra fine in etanolo al 70% per 5 minuti prima di utilizzarlo per gestire il disco di vetro.
4. Rimuovere con cautela la pinza dal tubo e chiudere il tappo, quindi inserire delicatamente i etanolo trattati pinza sulla parte superiore del tubo di aria secca per 2 min. Non permettere che la punta delle pinze per toccare nulla nel cofano.
5. Utilizzare le pinze sterili per afferrare un disco di vetro sterile fuori del vaso di vetro e metterla in un pozzetto della piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti. Ripetere l'operazione fino a quando il numero desiderato di pozzetti è stato popolato con dischi.
6. Mettete 500 ml di soluzione di collagene bovino (50 ng / ml) in ciascun pozzetto contenente un disco di vetro e porlo in 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore di coltura cellulare per almeno 30 min. Non vi è nulla di male in un incubazione più lungo.
7. Harvest HUVEC (cellule umane ombelicale Vena endoteliali) o PC3 (prostata cellule tumorali) che erano già coltivate in 150 millimetri piastra di coltura cellulare attraverso tripsinizzazione e bloccano l'attività tripsina utilizzando il suo terreno di coltura completo. Raccogliere le cellule in una provetta Falcon da 15 ml.
8. Contare il numero di cellulare e assicurarsi che la redditività è superiore al 90%.
9. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 200 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
10. Utilizzare il mezzo di coltura per diluire le cellule a 10 ⁵ cellule / ml. Posizionare cellule su ghiaccio.
11. Aspirare il collagene nella cappa coltura cellulare e posizionare delicatamente 500 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto in cui i dischi di vetro sono state fase solida con collagene. 5 x 10 ⁴ cellule / pozzetto della piastra a 24 pozzetti darà il 60% confluency per HUVEC e il 30% di confluenza di cellule PC3. Nota: aggiungi sospensione più cellulare per densità delle cellule superiore.
12. Cultura le celle di una 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 1 ora, 2 ore, 4 ore, 6 ore, o 24 ore per tracciare le attività nanopodia e il passaggio delle cellule. Tipicamente, le cellule saranno allegare al disco di vetro nei primi 30 min, poi iniziano a polarizzare e migrare nella prima ora, e svolgono interazioni intercellulari e divisione cellulare nelle ore successive.

2. Fissazione delle cellule

1. Ogni bene avrà bisogno di 500 microlitri 4% PFA (paraformaldeide) per fissare le cellule. Sia fabbricata commercialmente o appena fatto 4% PFA può essere utilizzato. Calcolare la quantità di PFA necessario in base al numero di pozzetti preparati, e posizionare PFA in un tubo Falcon da 15 ml. ATTENZIONE: paraformaldeide è un sospetto cancerogeno.
2. Inserire il tubo falco in uno stand di polistirolo che era già in atto in un 37 ° C incubatore. Lasciare il tubo in incubatrice per 30 min alla guerram il PFA a 37 ° C.
3. Posizionare una piastra elettrica nel cofano cultura e accenderlo.
4. Estrarre la piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti e preriscaldata PFA fuori dell'incubatore e collocarlo sulla parte superiore del pad di riscaldamento.
5. Utilizzare una sola mano per aspirare il mezzo da un pozzo, e subito dopo utilizzare l'altra mano per far scorrere delicatamente 500 microlitri PFA nel pozzo attraverso il bordo bene. Per facilitare l'aspirazione, inclinare la piastra di coltura a circa 45 °, appoggiandola contro il supporto polistirolo in modo che sia stabile a tale angolo. Ciò faciliterà l'aspirazione e l'aggiunta di soluzione PFA al pozzo senza disturbare le cellule in coltura. Questo è il passo più importante per preservare la struttura cellulare delle attività cellulari.
6. Ripetere il processo fino a quando tutti i pozzetti con un disco di vetro hanno ricevuto PFA. Nota: tutti i passi che devono cambiare soluzione pre-esistente dal pozzo si applicano stesse procedure di aspirazione.
7. Porre la piastra in 37 ° C per 5 min.
8. Prendere la piastra posteriore alla cappa cultura e inclinare contro Styrofoam come descritto al punto 2.5. Con una mano per trasferire delicatamente la PFA dal pozzo in un tubo di raccolta; utilizzare l'altra mano per posizionare subito dopo almeno 500 microlitri camera temperatura PBS nel pozzo. Dopo che tutti i pozzetti sono stati lavati, tornare e ripetere il lavaggio PBS ancora una volta in ogni bene. Svuotare la raccolta PFA in un contenitore per rifiuti pericolosi.
9. Preparare tampone di bloccaggio ICC con l'aggiunta di 2% siero fetale bovino da PBS. Sodio azide 0,04% (diluito dal 20% soluzione madre) è aggiunto come conservante. ATTENZIONE: sodio azide è un composto tossico. Il tampone può essere conservato in 4 ° C per un lungo periodo di tempo senza contaminazione batterica.
10. Con la piastra di coltura ancora inclinata contro uno stand, ancora una volta, il ciclo attraverso ogni bene aspirando per rimuovere PBS e subito dopo l'aggiunta di 500 ml di ICC tampone di bloccaggio. Le cellule sono ora pronti per immunofluorescenza. Se necessario, lacellule fisse possono essere memorizzati in un frigorifero a 4 ° C per una settimana senza significativa perdita di proteine ​​TM4SF1.

3. TM4SF1 immunofluorescenza colorazione di Nanopodia

1. In ogni pozzetto, sostituire il tampone bloccante 500 microlitri ICC con un nuovo tampone di bloccaggio contenente 0,01% Triton X-100 e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 ora. Non utilizzare superiore a 0,03% Triton X-100 in cui solleverà TM4SF1 dalle membrane cellulari. PBS lavato cellule dal punto 2.10 possono essere spostati direttamente al tampone bloccante contenente Triton se la colorazione è pronta per essere avviata immediatamente.
2. Diluire l'anticorpo primario anti-TM4SF1 (o anti-CD9) a 0,5 mg / ml a ICC tampone di bloccaggio.
3. In ogni pozzetto, rimuovere il tampone Triton ICC/0.01% e sostituirlo con 300 microlitri della soluzione anti-TM4SF1-anticorpo. Incubare 2 ore a temperatura ambiente o lasciare per una notte a 4 ° C.
4. Lavare ogni pozzetto con non meno di 500 microlitri di PBS. Ripetere 3x; ogni volta dare a least 5 min di tempo di incubazione.
5. Preparare una soluzione di anticorpo e phalloidin secondario ICC tampone di bloccaggio, utilizzando una diluizione 1.000 volte di Alexa 488 marcato asino anti-topo anticorpo secondario (2 mg / ml concentrazione finale) e 1000 x diluizione falloidina (50 ng / ml concentrazione finale).
6. Rimuovere PBS e aggiungere 300 ml di anticorpo secondario e la soluzione phalloidin ad ogni pozzetto e incubare per 2 ore o lasciare tutta la notte a 4 ° C.
7. Ripetere i passaggi di lavaggio PBS con almeno 5 minuti di incubazione per lavaggio. In ultimo lavaggio, lasciare ogni bene in PBS per 1 ora.
8. Cada una sola goccia (~ 10 ml) di fissaggio anti-sbiadimento media su un vetrino.
9. Piegare la punta di un 19 G 1 ½ in siringa 90 ° premendo delicatamente su una superficie dura. Con una mano tenere l'ago piegato e sollevare delicatamente un disco di vetro dal pozzo, e utilizzare l'altra mano per afferrare il disco usando le pinze taglienti.
10. Ruotare il disco di vetro &# 160; rivolto verso il basso lasciando il contatto lato della cella del supporto di montaggio sul vetrino. Inserire delicatamente il disco di vetro e lasciare asciugare durante la notte in un luogo buio a temperatura ambiente.
11. Procedere con l'immagine immunofluorescenza macchiato nanopodia, o conservare le diapositive in una scatola di diapositive a -20 ° C. Le diapositive resteranno visibili per alcuni mesi in -20 ° C.

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Risultati

Per la Fase 1:

Se le cellule (come HUVEC e PC3 utilizzato in questo studio) sono in grado di crescere normalmente, le cellule si attaccano al disco collagene rivestite entro 30 minuti dopo che sono teste di serie, polarizzano e diventano mobili poco dopo, e si estendono nanopodia prima del loro percorso di movimento. figure 1A e 1B mostrano rispettivamente una polarizzata e proliferanti HUVEC. Figura 2A mostra cellule PC3 polarizzate in uno sta...

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Discussione

Nanopodia sono sottili canali di membrana cellulare che attaccano saldamente alla matrice attraverso TMED e può estendersi più di 100 micron da una cella cellulare polarizzata di percepire l'ambiente e mediare le interazioni intercellulari ^2,3. Nanopodia aderire alla matrice così fermamente che i residui sono lasciati alle spalle come le cellule si allontana (figure 1 e 2). Nanopodia permettono quindi di studiare come le cellule percepiscono il loro ambiente e determin...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass disks	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm diameter
Glass jar	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz
Glass slide	Fisher Scientific	12-544-1	Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070	50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.
15 ml Falcon tube with Styrofoam rack	Corning	430790	Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes
Sharp forceps	Fisher Scientific	13-812-42	Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps
24-well Cell culture plate	BD Bioscience	353047	24-well Cell Culture Plate
150 mm Cell culture plate	BD Bioscience	353025	150 mm cell culture plate
19 G 1 ½ Syringe needle	BD Bioscience	309635	19 G 1 ½
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof
Collagen solution	BD Bioscience	354249	Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg
Trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Trypsin-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solution, pH 7.4
PFA (paraformaldehyde)	Affymetrix	19943 1 LT	4% in PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Fetal Bovine Serum
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement & Growth Factors
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.
Mouse anti-human TM4SF1 antibody	Millipore	MAB3127	Epitope is located in extracellular domain
Mouse anti-human CD9 antibody	BD Bioscience	555370	Epitope is located in extracellular domain
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Rhodamine-conjugated Phalloidin
Anti-fade mounting media	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI
70% Ethanol			17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double-deionized water
10x PBS (make 200 ml)			20 ml of 10x PBS 180 ml of double-deionized water
20% Triton X-100 (make 20 ml)			4 ml Triton X-100 16 ml double-deionized water
4% NaN3 (make 25 ml)			1 g of NaN3 25 ml of double-deionized water
50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)			Stock solution of 50 μg/ml (50 ml) 830 μl of Collagen I (3 mg) 50 ml PBS
ICC Blocking Buffer (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (add 1 ml) 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3)
ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)			50 ml of ICC Blocking Buffer 25 μl of 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Cell culture hood	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet
37 °C, 5% CO2 Cell culture incubator	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator
Heating pad	K&H Manufacturing	1020	K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (www.amazon.com)
Centrifuge	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Bright-Line Hemocytometer