Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

Riepilogo

La retina roditore è da tempo riconosciuta come finestra accessibile al cervello. In questa nota tecnica fornendo un protocollo che utilizza il modello murino di retinopatia indotta da ossigeno per studiare i meccanismi che portano al fallimento di rigenerazione vascolare nel sistema nervoso centrale dopo lesione ischemica. Il sistema descritto può anche essere sfruttata per esplorare le strategie per promuovere la ricrescita dei vasi sanguigni funzionali all'interno della retina e del SNC.

Abstract

La retina roditore è forse il sistema mammiferi più accessibile in cui indagare interazione neurovascolare all'interno del sistema nervoso centrale (CNS). È sempre più riconosciuto che diverse malattie neurodegenerative come l'Alzheimer, la sclerosi multipla e la sclerosi laterale amiotrofica presentano elementi di compromissione vascolare. Inoltre, le cause più importanti di cecità nella popolazione in età pediatrica e di lavoro (retinopatia della prematurità e la retinopatia diabetica, rispettivamente) sono caratterizzate da degenerazione vascolare e il fallimento di fisiologica ricrescita vascolare. Lo scopo di questo documento tecnico è quello di realizzare un protocollo dettagliato per studiare la rigenerazione vascolare CNS nella retina. Il metodo può essere impiegato per chiarire i meccanismi molecolari che portano al fallimento di crescita vascolare dopo la lesione ischemica. Inoltre, i potenziali modalità terapeutiche per accelerare e ripristinare plessi vascolari sani possono essere esplorati. Giudizio richiederlod utilizzando l'approccio descritto può prevedere vie terapeutiche per retinopatie ischemiche come quella del diabete o prematurità ed eventualmente beneficiare di altri disturbi vascolari del sistema nervoso centrale.

Introduzione

Nel corso dello sviluppo del sistema nervoso centrale, nervi, cellule immunitarie e vasi sanguigni istituire reti notevolmente accoppiati per garantire un'adeguata perfusione tissutale e consentire la trasmissione delle informazioni sensoriali ^1-5. La ripartizione dei sistemi vascolari risultati dell'ossigenazione tessutale insufficiente e fornitura metabolica compromesso ed è sempre più riconosciuto come un fattore importante per la patogenesi delle malattie neurodegenerative ^6. Dropout vascolare e il deterioramento dell'unità neurovascolare all'interno del cervello, per esempio, è associato con demenza vascolare, lesioni vascolari della materia bianca del cervello ⁷ e il morbo di Alzheimer con stenosi delle arteriole e piccole imbarcazioni ^8. Inoltre, alterata funzione barriera vascolare è pensato per contribuire sclerosi multipla ⁹ e sclerosi laterale amiotrofica ^10.

Di rilevanza diretta per il modello retinica descritto in questo protocollo, accecantemalattie come la retinopatia diabetica ¹¹ e retinopatia della prematurità ^{12, 13} sono caratterizzati da una fase precoce degenerazione vascolare. Lo stress ischemico conseguente sulla retina neurovascolare innesca una seconda fase di eccessiva e patologica neovascolarizzazione che probabilmente nasce come risposta compensatoria a ripristinare ossigeno e fornitura di energia ^14-16. Una strategia attraente per superare lo stress ischemico che è fondamentale per la progressione della malattia è ripristinare reti vascolari funzionali specificamente nelle zone ischemiche del neuro-retina (figure 2 e 3). Provocando una risposta angiogenica controllata può venire attraverso come contro-intuitivo per una condizione in cui i trattamenti anti-angiogenici come anti-VEGF sono considerati trattamenti adattati. Eppure, la prova della validità di questo approccio è il montaggio. Ad esempio, aumentando "fisiologica-like" ricrescita vascolare in ischemretinopatie ic è stato elegantemente dimostrata attraverso l'introduzione di cellule precursori endoteliali ^17, l'inibizione del VEGF Müller-cell espresso down-regulation indotta da altri fattori angiogenici ^18, iniezione di progenitori mieloidi ^19, l'inibizione della NADPH ossidasi apoptosi indotta ^20, aumentando la dieta ω-3 acidi grassi polinsaturi assunzione di acido ^21, il trattamento con un frammento carbossi-terminale del triptofano tRNA sintetasi ^22, e somministrazione diretta di VEGF o FGF-2 per la protezione delle cellule gliali ^23. Inoltre, abbiamo dimostrato che la modulazione classici spunti di orientamento neuronali quali Semaforine o netrins in retinopatie ischemiche accelera la rigenerazione vascolare dei vasi sani all'interno della retina e di conseguenza riduce angiogenesi patologica ^{24, 25.} Di rilevanza clinica diretta, molti degli studi sugli animali di cui sopra forniscono la prova che la promozione re vascolaregenerazione durante la prima fase ischemica delle retinopatie può ridurre significativamente vista minacciando neovascolarizzazione retinica ^{pre-19, 23, 24, 26,} probabilmente attraverso la riduzione degli oneri ischemica.

L'elaborazione di strategie terapeutiche che stimolano la rigenerazione dei vasi funzionali rimane una sfida significativa per biologi vascolari. Qui si descrive un sistema sperimentale che utilizza il modello murino di ossigeno indotta retinopatia (OIR) per esplorare le strategie per modulare la ricrescita vascolare all'interno della retina. Sviluppato da Smith et al. Nel 1994 ^27, questo modello funge da proxy per retinopatie proliferative umane e consiste nell'esporre cuccioli di topo P7 al 75% O ₂ fino a P12 e successivamente re-introdurre i cuccioli di ambiente della stanza O _2-tensione (Figura 1). Questo paradigma imita vagamente uno scenario in cui un neonato prematuro è ventilatocon O _2. L'esposizione dei cuccioli di topo all'iperossia provoca la degenerazione dei capillari retinici e microcircolo, e produce una superficie riproducibile di vaso-obliterazione (VO) in genere valutato caso di uscita dal O ₂ a P12, anche se zona VO massima è raggiunta a 48 ore (P9) dopo esposizione a O ₂ ^28. Nel topo, le zone VO avascolari rigenerano spontaneamente nel corso della settimana successiva reintroduzione di aria ambiente ed eventualmente zone VO sono completamente ri-vascolarizzati (Figura 2). Reintroduzione di aria ambiente di topi sottoposti a OIR provoca anche neovascolarizzazione pre-retinica (NV) (massimo a P17) che è in genere valutata per determinare l'efficacia di paradigmi di trattamento anti-angiogenici. Nella sua forma più pura, il modello OIR fornisce uno strumento altamente riproducibile e quantificabile per valutare la degenerazione vascolare indotta da ossigeno e determinare l'entità del distruttiva neovascolarizzazione pre-retinica ^29-31.

Diversi paradigmi di trattamento esplorative che modulano la rigenerazione vascolare del SNC può essere studiato utilizzando il modello OIR compreso l'uso di composti farmacologici, terapia genica, delezione genica e altro ancora. La propensione di un determinato approccio di influenzare la ricrescita vascolare è valutata graduale nella finestra tra P12 (VO massimo dopo l'uscita da iperossia) e P17 (NV massima). Valutazione del risultato del trattamento su NV patologica può essere rapidamente e facilmente determinato in parallelo ed è stato accuratamente descritto da Stahl e colleghi ^{30, 31.} Qui forniamo una semplice procedura step-by-step per studiare la modulazione di rivascolarizzazione fisiologico all'interno della retina neurale da composti farmacologici, potenziali terapie, vettori virali o di studiare l'influenza dei geni candidati in transgenici o knockout mice.

Protocollo

Dichiarazione etica: Tutto sperimentazione animale rispetta le linee guida per la cura degli animali, istituito dall'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research e del Consiglio canadese delle Animal Care.

1. Ossigeno indotta retinopatia (OIR)

1. Data di nascita di cuccioli di topo come P0 Record.
2. Registrare tutti i pesi degli animali al momento dell'entrata in O ₂ al fine di garantire un adeguato intervallo di peso. Nota: Per C57BL / 6 topi a P17, il peso corporeo deve essere compresa tra 5 e 7,5 g per NV massimo ^32. Al fine di mantenere la coerenza ambientale, si raccomanda di utilizzare cucciolata il controllo (per i topi geneticamente modificati, così come i topi ricevere trattamenti sperimentali). Nel valutare gli effetti di un vettore virale, si deve considerare tropismo del virus e consentire un tempo sufficiente per la piena espressione dei transgeni viralmente-consegnati. Rapidamente esprimere viralevettori quali 3 lentivirus ^terza generazione ^{24, 25, 33} sono raccomandati.
3. Cuccioli posto del mouse a P7 (C57BL / 6 o desiderato deformazione) e una CD1 promozione madre in una camera di ossigeno a 75% O ₂ per 5 giorni ^27. Umidità ambiente e la temperatura sono stati mantenuti costanti per tutto O ₂ esposizione. Nota: Strutture di ricerca equipaggiati con una sorgente centrale di O ₂ sono ideali e limitano la sostituzione ingombrante di O ₂ serbatoi vuoti. Se si lavora con transgenici o knockout topi, è importante garantire che il controllo e topi sperimentali sono acquisiti dal medesimo fornitore di limitare derive genetiche entro gli stessi ceppi ^{30, 29.}
4. A P12, togliere i topi dalla camera di ossigeno e tornare animali ambient O _2.

2. Iniezione intravitreale per la consegna dei composti al Retina interna (WhEffetti en Valutare di un composto farmacologico o proteina ricombinante)

1. A P14, anestetizzare i topi con il 2% isoflurano in ossigeno 2 L / min (o di protezione degli animali comitato approvato anestetico di scelta). Al fine di verificare l'efficacia dell'anestesia, in sequenza pizzicare la coda, piede posteriore e l'orecchio con una pinza.
2. Posizionare il mouse sulla pancia.
3. Usando una siringa sterile 10 microlitri con ago tirato vetro smussato, eseguire una iniezione di un volume massimo di 1 ml di soluzione contenente il composto in fase di studio o veicolo (soluzione fisiologica) al limbus posteriore dell'occhio, con un 45 ° angolo evitando la lente. Nota: Il vetro-ago tirato è attaccato alla siringa con una goccia di resina epossidica.
4. Applicare una goccia di lubrificante pomata oftalmica (idealmente con antibiotico) con un tampone per l'occhio del mouse.
5. Ritorno il mouse torna alla gabbia con la promozione madre. I topi sono poi accuratamente controllati fino a quando recoperto e completamente ambulatoriale.

3. Valutazione della nave Perfusione e Barrier Function (Integrity) di angiografia con fluoresceina

1. Anestetizzare i topi con il 2% isoflurano in ossigeno 2 L / min (o di protezione degli animali comitato approvato anestetico di scelta). Al fine di verificare l'efficacia dell'anestesia, in sequenza pizzicare la coda, piede posteriore e l'orecchio con una pinza. Nota: Questo è in genere eseguita a P17 quando viene valutata la rigenerazione. Carry out anche l'analisi a P19 e P21 per determinare se l'integrità vascolare è conservato nel tempo.
2. Una volta anestetizzato, pesare il mouse.
3. Effettuare una incisione addominale mediana con le forbici dissezione. Nota: gli strumenti per dissezione devono essere regolarmente controllati e affilate.
4. Tagliare costole lateralmente e sollevare la gabbia toracica con l'ausilio di pinze. Nota: È necessario tagliare lateralmente come possibile per evitare danni al cuore.
5. Dopo la rimozione peripHeral tessuto dal cuore, bloccare il aorta discendente con una pinza emostatica.
6. Iniettare lentamente fluoresceina destrano al ventricolo sinistro utilizzando un ago G 25. Nota: Se la funzione di barriera vascolare è indagato, 70 kDa fluoresceina destrano è impiegato come sarà fuoriuscire delle navi quando integrità imbarcazione è compromessa. Se l'investigatore vuole lanciare vasi sanguigni, viene utilizzato 2 MDa fluoresceina destrano. Passaggi critici: 1) Per garantire una ripartizione omogenea, centrifuga fluoresceina destrano e iniettare il surnatante, 2) Al fine di prevenire la vasocostrizione, iniettare soluzione di fluoresceina destrano riscaldato, 3) Il suo tempo di circolazione non dovrebbe eccesso di 4 min.
7. Decapitare topi 2 minuti dopo l'iniezione con le forbici operativi.

4. Enucleazione e la fissazione degli occhi

Nota: Nel valutare i tassi di rigenerazione vascolare, in primo luogo raccogliere retine in P12 e, in aggiunta a P14 e P17. Aumentare il numero di punto temporale campionatos per la determinazione più accurata dei tassi di rivascolarizzazione ^24.

1. Inclinare la testa del mouse e posizionarlo su un fianco.
2. Togliere la pelle e le palpebre che coprono gli occhi con le forbici dissezione.
3. Posizionare pinze curve sotto l'occhio e tirare delicatamente fino al nervo ottico è reciso.
4. Girare la testa del topo sull'altro lato ed eseguire gli stessi passi (passi 4.2 e 4.3).
5. Per garantire una migliore penetrazione del fissativo, perforare un foro nella camera anteriore dell'occhio utilizzando 30 ago G.
6. Trasferire occhi in una provetta contenente 4% paraformaldeide (PFA) e fissare per 1 ora a temperatura ambiente.
7. Rimuovere e lavare gli occhi PFA 4 volte con una soluzione di PBS ghiacciato.

5. Dissezione della retina

1. Mettere gli occhi di topo in una capsula di Petri contenente PBS freddo e di eseguire la dissezione delle retine sotto uno stereomicroscopio.
2. Rimuovere il grasso in / tessuto circostante l'occhio con micro-dissezione scissors.
3. Tagliare la cornea con le forbici micro-dissezione.
4. Utilizzando due coppie di pinze, minuziosamente sbucciare la sclera lontano dalla periferia verso il nervo ottico e scartare.
5. Stringere la lente (sfera biancastra sotto la cornea) con una pinza ed estrarlo dalla tazza occhio. Utilizzare un paio di pinze come supporto, e l'altra per afferrare e sollevare con attenzione e rimuovere la lente.
6. Staccare i vasi hyaloid dal lato interno della retina con piccoli pennelli (dimensione 0) e pinze.
7. Rimuovere fasci di navi hyaloid collegati al disco ottico utilizzando una pinza.
8. Trasferimento sezionato retine a 2 tubi ml microcentrifuga contenenti PBS e posto sul ghiaccio prima di avviare la procedura di colorazione.

6. Retina vascolare colorazione

1. Incubare retine sezionato notte con delicata agitazione a 4 ° C in una soluzione di fluorescenza accoppiata isolectin B4 (rodamina-lectina o altro) in PBS contenente 1 mM CaCl ₂ (a 1:100 diluizione di una soluzione B4 2 mg / ml isolectin raccomandata). Durante l'intera procedura di colorazione, tubi coprire con un foglio di alluminio o un foglio opaco al riparo dalla luce.
2. Il giorno seguente, rimuovere la soluzione colorante e lavare retine 3x in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.

7. Preparazione della retina Flatmounts

1. Trasferire retine, fotorecettori rivolto verso il basso, su un vetrino da microscopio e fare quattro profonde incisioni radiali equidistanti con un bisturi chirurgico per dividere la retina in quattro quadranti di uguale dimensione. Durante le incisioni, rinforzare la retina con una spazzola in modo che non si muove.
2. Utilizzando due spazzole imbevute di PBS, appiattire con attenzione la quadranti fotorecettore lato verso il basso e immergere la retina in mezzo di montaggio per impedire fotometabolismo. Poi posizionare accuratamente un coprioggetto sulla superficie della retina montata senza applicare pressione e fare in modo che le bolle d'aria non si accumulano sotto il vetrino.

8. Imaging e quantificazione dei Vasoobliteration (VO) e neovascolarizzazione (NV), come descritto in precedenza ³¹

1. Prendere immagini di retine intere montato con un microscopio a epifluorescenza con un ingrandimento di 10X.
2. Aprire l'immagine retinica in software di editing fotografico, cucire insieme e misurare l'area retinica totale, e la zona avascolare. Area può essere espressa in pixel.
3. Determinare misura di VO dividendo il numero di pixel nella zona avascolare per il numero di pixel nell'area retinica totale.
4. Determinare misura di NV dividendo il numero di pixel di NV per il numero di pixel per la regione retinica totale come descritto ^31.

Risultati

Il modello OIR è ampiamente utilizzato per studiare indotta da ossigeno degenerazione vascolare e neovascolarizzazione patologica indotta da ischemia nella retina ed è stato fondamentale nello sviluppo di attualmente impiegati trattamenti antiangiogenici per le malattie oculari ^{27, 29, 30.} I risultati ottenuti con questo modello possono essere liberamente estrapolati per retinopatie ischemiche come la retinopatia diabetica proliferativa e la retinopatia della prematurità ^30.

Discussione

Qual è il modo più efficace per stimolare la crescita di nuovi vasi sani in tessuto nervoso ischemico? È terapeuticamente valida per interferire e accelerare naturalmente ricrescita vascolare? In patologie neuro-ischemica, quali retinopatie ischemiche o ictus, la degenerazione vascolare è associata a una ridotta funzione neuronale ^35-38. Quindi, per contrastare il pregiudizio presto, ripristinando regionale micro-circolazione durante il segmento immediato / precoce della malattia può rivelarsi utile. In ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945