Spettroscopia Laser-Induced Breakdown: un nuovo approccio per la mappatura di nanoparticelle e la quantificazione in Tissue Organ

Riepilogo

Spettroscopia laser ripartizione indotta eseguita su organi sottile e tessuto tumorale rilevato con successo elementi naturali e gadolinio artificialmente iniettato (Gd), emessi da nanoparticelle a base di Gd. Immagini di elementi chimici raggiunto una risoluzione di 100 micron e sensibilità quantitativa sub-mM. La compatibilità del setup con la microscopia ottica standard sottolinea la sua capacità di fornire immagini multiple di uno stesso tessuto biologico.

Abstract

Spettroscopia di emissione di plasma indotto da laser è stato applicato ad analisi elementare di campioni biologici. Spettroscopia ripartizione laser-indotta (LIBS) eseguita su sezioni sottili di tessuti roditori: reni e tumorali, consente il rilevamento di elementi inorganici come (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, Fe e, naturalmente presenti nel corpo e (ii) Si e Gd, rilevati dopo l'iniezione di nanoparticelle a base di gadolinio. Gli animali sono stati sacrificati da 1 a 24 ore dopo l'iniezione endovenosa di particelle. Una scansione bidimensionale del campione, effettuata utilizzando un micrometrica 3D-stadio motorizzato, ha permesso il raggio laser infrarosso esplorare la superficie con una risoluzione laterale di 100 μ m. Immagini chimica quantitativa di elemento Gd all'interno dell'organo sono stati ottenuti con sensibilità sub-mM. LIBS offre un metodo semplice e robusto per studiare la distribuzione di materiali inorganici senza labeli specificong. Inoltre, la compatibilità della configurazione con microscopia ottica standard sottolinea il suo potenziale di fornire immagini multiple dello stesso tessuto biologico con differenti tipi di risposte: elementari, molecolari o cellulari.

Introduzione

L'ampio sviluppo di nanoparticelle per applicazioni biologiche sollecitato il parallelo miglioramento delle tecniche analitiche per la loro quantificazione e di imaging in campioni biologici. Solitamente la rilevazione e la mappatura delle nanoparticelle in organi sono fatti da fluorescenza o microscopia confocale. Sfortunatamente questi metodi richiedono l'etichettatura delle nanoparticelle da un colorante vicino infrarosso che può modificare la biodistribuzione delle nanoparticelle, in particolare per le piccolissime nanoparticelle per le sue proprietà idrofobiche. La rilevazione delle nanoparticelle etichettati, e soprattutto le piccole nanoparticelle (dimensioni <10 nm), potrebbe quindi interferire con la loro distribuzione biologica l'intera scala di corpo, ma anche a livello di tessuti e cellule. Lo sviluppo di nuovi dispositivi in ​​grado di rilevare le nanoparticelle senza etichettatura offre nuove possibilità per lo studio del loro comportamento e cinetica. Inoltre, il ruolo di oligoelementi, quali ferro e rame nel cervello Malattie di unmalattie neurodegenerative come l'Alzheimer d ^1, Menkes ^2,3, o ⁴ Wilson suggeriscono l'interesse di studiare e localizzare questi elementi nei tessuti.

Varie tecniche sono state usate per fornire la mappatura microanalisi elementare o di materiali diversi. Nel loro articolo recensione pubblicata nel 2006, R. Lobinski et al. Ha fornito una panoramica delle tecniche disponibili standard per microanalisi elementare in ambiente biologico, uno degli ambienti più difficili per le scienze analitiche ^5. Microsonda elettronica, che consiste di energia dispersiva microanalisi a raggi X in un microscopio elettronico a trasmissione, può essere applicato a numerosi studi se la concentrazione dell'elemento è sufficiente (> 100-1.000 mg / g). Per raggiungere limiti di rivelazione inferiori, sono state utilizzate le seguenti tecniche:

• microsonda fascio ionico usando particelle indotta da X-ray Emission μ-PIXE (1-10 mg / g) ⁶
• synchrotron microanalisi radiazione μ-SXRF (0,1-1 mg / g) ⁷
• spettrometria di massa di ioni secondari SIMS (0.1 mg / g) ⁸
• ablazione laser accoppiato induttivamente spettrometria di massa LA-ICP-MS (fino a 0,01 mg / g) ^9,10

Le tecniche sopra citate forniscono risoluzione micrometrica come mostrato nella Tabella 1 estratto da Lobinski et al.

Ricostruzione 3D delle indagini 2D di serie potrebbe essere proposto anche per la ricostruzione dei tessuti più profondi ^11. Tuttavia, tutti i dispositivi e sistemi richiedono entrambi professionisti qualificati, moderati da attrezzature altamente costose ed esperimenti di lunga durata (in genere più di 4 ore per un 100 micron x 100 micron per μ-SXRF di 10 mm x 10 mm per LA-ICP-MS ) ^12. Complessivamente, questi requisiti rendono microanalisi elementare molto limitazione e incompatibile con i sistemi di imaging ottico convenzionale,microscopia a fluorescenza o microscopia non lineare. Un altro punto che si può menzionare qui è che la capacità di misura quantitativa è ancora abbastanza limitata e dipende dalla disponibilità di standard di laboratorio accoppiata alla matrice. L'ulteriore generalizzazione dell'uso di microanalisi elementare nei processi industriali, la geologia, la biologia e altri domini di applicazioni apporterà notevoli progressi concettuali e tecnologiche.

Lo scopo della presente manoscritto è quello di proporre soluzioni per la mappatura elementare quantitativa (o microanalisi elementare) nei tessuti biologici con una strumentazione tavolo pienamente compatibile con microscopia ottica convenzionale. Il nostro approccio è basato sulla spettroscopia ripartizione indotta da laser (tecnologia LIBS). In LIBS, un impulso laser viene focalizzato sul campione di interesse per creare la composizione e la scintilla del materiale. La radiazione emessa atomico nel plasma viene successivamente analizzato da uno spettrometro e il elementariLe concentrazioni TAL possono essere recuperati con le misure di calibrazione effettuate in anticipo ^13,14. I vantaggi di LIBS includono sensibilità (mcg / g per quasi tutti gli elementi), compattezza, preparazione molto semplice campione, assenza di contatto con il campione, risposta istantanea e localizzata precisamente (micro) analisi di superficie. Tuttavia, l'applicazione dell'imaging chimico tessuto rimane difficile dall'inizio della ablazione laser del tessuto deve essere finemente controllata effettuare mappe con elevata risoluzione spaziale e la sensibilità nell'intervallo mcg / g ^15,16.

Con tale soluzione, non è richiesta l'aggiunzione di rivelatori o agenti di etichettatura, che permette di rilevare elementi inorganici direttamente nel loro ambiente nativo nei tessuti biologici. Lo strumento LIBS sviluppato nel nostro laboratorio offre una risoluzione corrente inferiore a 100 micron, con una sensibilità stimata per Gd inferiore a 35 mg / g, pari a 0,1 mM ^16, che consentela mappatura di grandi campioni (> 1 cm ²⁾ in 30 min. Inoltre, il software casalingo facilita l'acquisizione e lo sfruttamento dei dati. Questo strumento è utilizzato per rilevare, carta, e quantificare la distribuzione tissutale di gadolinio nanoparticelle basate (Gd) ^{17 - 18} nei reni e campioni tumorali da piccoli animali, da 1 a 24 ore dopo l'iniezione endovenosa di particelle (dimensione <5 nm) . Elementi inorganici, che sono intrinsecamente contenute in un tessuto biologico, come Fe, Ca, Na, e P, sono stati rilevati e ripreso.

Protocollo

1. Preparazione del campione biologico

Tutti gli esperimenti descritti in questo studio sono stati approvati dal Comitato cura degli animali ed uso del CECCAPP (Lione, Francia) (autorizzazione # LYONSUD_2012_004), e gli esperimenti sono stati effettuati sotto la supervisione di persone autorizzate (L. Sancey, DDPP autorizzazione # 38 05 32).

1. Aggiungere 1 ml di H ₂ O a 100 pmol di nanoparticelle a base di gadolinio (Gd), attendere 15 min, e aggiungere 20 ml di HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, CaCl ₂ 20 mM a 100 ml di H ₂ O e 80 microlitri la soluzione primaria di nanoparticelle a base di Gd per ottenere una soluzione di 200 ml a 40 mm pronti per l'iniezione (Città: Villeurbanne, in laboratorio).
2. Iniettare la soluzione di nanoparticelle a base di Gd 200 ml per via endovenosa in anestetizzati tumore roditori (Città: Lyon Sud (Oullins), a 15 km da laboratorio).
3. 1-24 ore dopo l'iniezione, i topi sacrificare und mettere i campioni biologici in isopentano raffreddato con azoto liquido. Conservare i campioni a - 80 ° C (Città: Lyon Sud (Oullins), a 15 km dal laboratorio).
4. Tagliate il campione (Città: solitamente Grenoble, a 100 km dal laboratorio; cercherò di avere un accesso a Lione Sud) in 100 slides micron di spessore e mettere le diapositive biologiche su piatti di plastica specifici (piatto di Petri). Conservare a -80 ° C.
   Nota: i piatti di plastica sono fondamentalmente un campione di polimero molto puro. Essi sono utilizzati per evitare interferenze con gli elementi contenuti nel tessuto.

2. Preparazione del campione per la calibrazione

1. Preparare flaconi con dosi crescenti di nanoparticelle basato Gd in acqua (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 500 mM, 1 mM e 5 mM).
2. Mettere un 5 ml-drop di ogni soluzione regolarmente distanziate di 3 mm sulla piastra di Petri.
3. Asciutto a temperatura ambiente per 20 minuti.

3. LIBS Experiment

1. Inizializzazione Setup LIBS
   1. Impostazioni Laser. Dopo l'accensione degli strumenti, attendere 10-20 minuti per la stabilizzazione di energia laser a impulsi e il raffreddamento della macchina fotografica ICCD a -20 ° C. Regolare l'energia dell'impulso con l'attenuatore.
      Nota: I parametri ottimali laser per tessuti di mappatura sono 5 nsec durata dell'impulso, 1.064 nm di lunghezza d'onda, e l'energia di impulso di circa 4 mJ. Il laser utilizzato è un tipico Nd: YAG laser nanosecondo.
   2. LIBS Impostazioni. Impostare la posizione di focalizzazione laser (rispetto alla superficie del campione) per ottenere il diametro più piccolo cratere (circa 50 micron o meno).
      Nota: Questo corrisponde ad una focalizzazione dell'impulso laser 100 micron sotto la superficie del campione.
   3. Impostazioni spettrometro. Utilizzare lo spettrometro Czerny-Turner combinato con un 1.200 linee / mm reticolo e un elevato temporale fotocamera a risoluzione ICCD. Controllare tutti questi dispositivi da computer. Impostare il valore fessura di ingresso a 40 micron. Impostare l'intervallo spettrale reGARDING l'elemento da analizzare. Utilizzare l'intervallo spettrale copre 325-355 nm per rivelare Gd con alta sensibilità, così come Na, Ca e Cu. Impostare i parametri ICCD con un ritardo di 300 nsec, un cancello di 2 msec, e un guadagno di 200.
2. Mapping di misura
   1. Collocare il campione biologico sul supporto del campione LIBS motorizzato.
   2. Regolare l'altezza del campione secondo la posizione del fuoco del laser.
   3. Prendete un alta risoluzione foto della fetta del campione.
   4. Impostare il modulo mappatura del software di acquisizione LIBS effettuare una mappa con tipicamente 100 x 100 punti di misura distanziati da una risoluzione di circa 100 pm.
   5. Avviare l'acquisizione. Da questo punto di automatizzare tutto; il movimento sequenza così come la registrazione dello spettro e risparmio. 40 min sono necessari per una mappatura di 10.000 punti (equivalente a 1 cm ² per risoluzione di 100 micron). Raggruppare tutti gli spettri registrati in uno stesso file.
   6. Quando finished, scattare una seconda foto della fetta del campione
3. Misurazione Calibrazione

Con gli stessi parametri sperimentali, misurare i campioni di calibrazione (per i dettagli di preparazione, vedere paragrafo 2). Eseguire una mappa o record di 25 spettri (ottenuto da siti di misura nella parte centro della goccia) in ciascuna delle gocce di taratura.

4 LIBS Spectrum Analysis:. Costruire delle immagini chimici

1. Registrare tutti gli spettri LIBS dalla mappatura del tessuto e caricarli nel software di analisi LIBS. Sottrarre la linea di base per ogni spettro e costruire le immagini chimici con scala di intensità relativa utilizzando un colore falso.
   Nota: Un algoritmo recupera specifici intensità di linea, come Gd, Cu, Na, o Ca.
2. Eseguire la stessa operazione sul spettri misurati dal campione calibrato per consentire il calcolo curve di calibrazione (relazione tra intensità e concentrazione) e costruire aqmappa uantitative o immagine per Gd (o altro elemento di interesse).
3. Applicare i trattamenti adeguati alle immagini chimici, come interpolazione o levigatura. Salvare l'intensità o la concentrazione mappe in formato immagine (bitmap).

Risultati

Come mostrato in figura 1, il fascio di un laser Nd: YAG nella lunghezza d'onda fondamentale di 1.064 nm è concentrata verticalmente sulla fetta di tessuto da una lente di quarzo di 50 mm di distanza focale. L'energia di impulso è stato di 4 mJ e la frequenza di ripetizione 10 Hz. Al fine di evitare la generazione di plasma in aria, il fascio laser è focalizzato circa 100 micron sotto la superficie del campione. Nessuna plasma ad aria è stato osservato in questa condizione. Durante gli esper...

Discussione

Applicato al campione biologico, questa tecnica consente di imaging chimica, cioè la mappatura e quantificazione, di Do e Si iniettati da nanoparticelle a base di Gd in diversi organi. Dalle principali impostazioni critiche, il controllo delle proprietà del laser (lunghezza d'onda, energia dell'impulso, focalizzazione e stabilità) è fondamentale per una ablazione del tessuto preciso e fine (cioè risoluzione mapping), nonché per la sensibilità. Lavorare ad alta energia offre una migliore ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample