Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Riepilogo

Descriviamo una serie di metodi per iniettare coloranti, vettori di DNA, virus e cellule per monitorare sia destino cellulare e fenotipo di cellule endogene e innestate derivate da cellule embrionali o pluripotenti entro embrioni di topo al giorno embrionale (E) 9.5 e fasi successive di sviluppo.

Abstract

Testare il destino di cellule staminali derivati ​​embrionali o pluripotenti nei protocolli in vitro ha portato a risultati controversi che non riflettono necessariamente la loro potenziale vivo. Preferibilmente, queste cellule devono essere collocati in un ambiente embrionale adeguato al fine di acquisire il loro fenotipo definito. Inoltre, linea cellulare tracciando studi nel topo dopo etichettatura cellule con coloranti o vettori retrovirali è rimasto per lo più limitato alle fasi iniziali embrioni di topo con gli organi ancora poco sviluppati. Per superare queste limitazioni, abbiamo progettato i protocolli microiniezione standard e ultrasuoni-mediata per iniettare vari agenti in regioni mirate di cuore in embrioni di topo a E9.5 e fasi successive di sviluppo. Espianto embrionale o gli embrioni vengono poi coltivate o da sinistra a sviluppare ulteriormente in utero. Questi farmaci comprendono coloranti fluorescenti, virus, shRNAs, o cellule staminali progenitrici di cellule di derivazione. I nostri metodi permettono la conservazione del function dell'organo durante il monitoraggio della migrazione e il destino delle cellule marcate e / o iniettati. Queste tecnologie possono essere estesi ad altri organi e sarà molto utile per affrontare le questioni biologiche fondamentali in biologia dello sviluppo.

Introduzione

Più di un decennio fa, le cellule staminali embrionali umane (HuESCs) sono state derivate da blastocisti umane ^1. Da allora, queste cellule sono diventati oggetto di un importante campo di ricerca che affronta le domande insoddisfatte in biologia dello sviluppo umano. HuESCs hanno inoltre fornito speranze nella medicina rigenerativa. Negli ultimi anni, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) sono stati generati da cellule somatiche paziente-specifiche, fornendo modelli di malattia genetica ^2. Molti protocolli in vitro per la differenziazione delle cellule staminali embrionali pluripotenti indotte o verso varie linee cellulari, comprese le linee del cuore ^3, sono stati segnalati. Le cellule differenziate sono spesso caratterizzati fenotipicamente mediante analisi di RNA e proteina espressione, immunostaining, e / o nei test funzionali in vitro. Tuttavia, i derivati ​​di cellule staminali pluripotenti devono essere collocati in un ambiente embrionale adeguato per verificare se essi acquisiscono pienamente il cell destino della loro controparte embrionale e se ricapitolano la vera funzione in vivo in risposta alle indicazioni regionali. Mentre l'ingegneria dei tessuti è promettente, ma non fornisce ancora tutti i segnali noti e sconosciuti di una corretta in vivo di sviluppo tessuto embrionale ^4,5.

Etichettatura delle cellule con coloranti o vettori retrovirali in embrioni, compresi embrioni di topo, hanno portato importanti informazioni circa l'origine embrionale delle linee cellulari durante lo sviluppo cardiaco ^6. Ad esempio, tingere iniezione nello spazio pericardico di embrioni di topo ex vivo, seguita da coltura in vitro di cuori isolati, è stato utilizzato per marcare cellule epicardici ed i loro discendenti ^7. Tuttavia, tintura e l'etichettatura delle cellule retrovirali sono stati per lo più applicate agli embrioni precoci di topo con gli organi ancora poco sviluppate, o embrioni di pollo, che sono più facilmente accessibili ^8. Un'eccezione è il cervello, che è più facile bersaglio in embryos ^9,10. Tale approccio non è stato ancora applicato al battere del cuore embrionale del mouse.

Per completare l'etichettatura diretta con coloranti o virus e di effettuare lineage tracing in embrioni di topo fase più avanzata e topi adulti, l'approccio di etichettatura delle cellule è stato combinato con l'analisi di topi transgenici che utilizzano la tecnologia Cre / Lox. L'approccio Cre / Lox ¹¹ presenta tuttavia alcune limitazioni dovute alla specificità spazio-temporale delle regioni regolatorie genomiche utilizzate per guidare l'espressione della ricombinasi, e l'efficienza della ricombinazione Cre / Lox ^12. Inoltre, questo approccio non risolve appieno le domande specifiche della cella migrazione guidata acquisizione del destino delle cellule in quanto si può etichettare solo un precursore dopo l'attivazione della regione regolatoria utilizzato per guidare l'espressione Cre. Inoltre, non può applicarsi agli embrioni umani per ovvie questioni etiche.

Date queste limitazioni, abbiamo progettato una serie di nuovi protocols per iniettare una varietà di agenti di etichettatura cella come coloranti fluorescenti, virus, modulatori dell'espressione genica come shRNAs e vettori etichettatura cella basate sul DNA, o cellule nell'embrione mouse sul E9.5 e stadi di sviluppo in regioni oggetto della cuore.

Le iniezioni di DNA / cellulari utilizzano uno stereomicroscopio e un semplice dispositivo di microiniezione combinato con ex vivo coltura degli embrioni fino a 48 ore, o di cuore isolato o di cultura espianto embrionale per 48-72 ore. Segnaliamo anche un protocollo microiniezione ecografia-mediata in topo cuori embrionali in utero. Questa tecnica permette di monitorare lo sviluppo degli embrioni ¹³ e consente a lungo termine di follow-up dei injectates e / o cellule marcate.

Abbiamo trovato che questi approcci conservazione della funzione dell'organo e forniscono un ambiente più rappresentativo di test in vitro di cellule staminali potenziale. Esso prevede inoltre la possibilità di seguire la migrazionedi etichettatura e / o iniettato cellule per monitorare il loro destino. In definitiva, questo dovrebbe garantire una migliore comprensione di patterning tessuto regionale e processi biologici chiave.

Protocollo

1. Preparazione

Procedure sugli animali

Ottenere l'approvazione di un comitato etico animale e seguire le linee guida istituzionali per il lavoro con il virus, HuESC e / o iPSC (se applicabile), così come la gestione del mouse, l'ottenimento di embrioni di topo, ed eseguire un intervento chirurgico mouse. Per accoppiamenti temporizzati, il giorno della spina è considerato giorno embrionale (E) 0,5 / 0,5 giorni dopo coitum.

1. Aghi microiniezione:
   Per gli ex utero microiniezione, tirare pipette di vetro (tubi di diametro borosilicato capillari esterni 1,2 millimetri) con un estrattore pipetta / beveller per ottenere un micron di diametro punta interno 1 o 10 e una forma punta acuminata e conica per iniettare il DNA o le celle, rispettivamente. Per le iniezioni ultrasuoni-mediata, l'uso personalizzato aghi sterili, che hanno un diametro esterno / interno (OD / ID) di 1,14 mm/0.53 mm, con una punta di 50/35 micron OD / ID.
2. Piatti Silicon-riempite Petri:
   Preparare silicio come descritto nel manuale. Riempireuna capsula di Petri del diametro di vetro pulito 60 con uno strato di elastomero ~ 1 cm. Evitare bolle d'aria.
3. Strumenti:
   Tenere tutti gli strumenti chirurgici sterili, prima e durante la procedura.
4. Preparazione del DNA:
   Aggiungere 3 g DNA e 12 microlitri Opti-MEM in un tubo. Aggiungere 3 ml Lipofectamine 2000 e 12 microlitri Opti-MEM in un altro tubo. Incubare per 5 min a temperatura ambiente e mescolare entrambe le soluzioni. Utilizzare immediatamente.
5. Preparazione cellulare:
   Preparare una sospensione di 10 ⁶ cellule / ml DMEM (Dulbecco Eagle Medium, alte concentrazioni di glucosio e siero di ratto 50%). 50 microlitri di sospensione cellulare finale è sufficiente per 8-10 embrioni.
6. Dye preparazione:
   Utilizzare il verde fluorescente CDCFDA-SE a 25 mg / ml di DMSO. Preparare 20 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C. Diluire 1:100 / 1:200 in soluzione fisiologica sterile o PBS prima dell'uso.
7. Preparazione di virus:
   Utilizzare uno spot generazione 3 ^° PGK-GFP che esprimono lentivirus con un titolo di ~ 10 ⁹ -10 ¹⁰ TRAnsducing unità / ml DMEM. Per la preparazione dei lentivirus, vedere Tiscornia et al. ¹⁴ Indossare indumenti protettivi ed utilizzare in modo sicuro e smaltire virus.

2. Insieme di E9.5 e E10.5 embrioni per Ex vivo iniezione

1. Euthanize un topo gravide al giorno embrionale 9.5 o 10.5.
2. Sterilizzare il torace e l'addome del mouse con il 70% di etanolo.
3. Effettuare una incisione mediana ventrale per aprire l'addome e recuperare il corno uterino a temperatura ambiente in PBS e trasferirlo dopo due lavaggi PBS ad un piatto di silicone riempito di Petri con M16 medie.
4. Pin il corno uterino con perni insetti allo strato di silicone in modo che il lato vascolarizzata dell'utero è in basso.
5. Tagliare la superficie dell'utero con una pinza sottile, e un tappo del decidua a 1 mm sotto la superficie.
6. Richiamare delicatamente l'embrione nel sacco vitellino, diffondendo le pareti della decidua.
7. Conservare gli embrioni a 37 °; C in M16 mezzo prima iniezione di cellule. Per l'iniezione, ogni embrione viene trasferito al piatto di silicone riempito con M16 medio pre-riscaldato a 37 ° C.

3. DNA o l'iniezione di cellule allo stereomicroscopio

1. Riempire la pipetta di vetro dal retro con una siringa Hamilton e scuotere la pipetta per rimuovere le bolle sulla punta.
2. Impostare la pipetta sul supporto microiniezione; impostare la pressione di mantenimento di 50 (DNA) o 30 (celle) hPa, e la pressione di iniezione di 150 (DNA) a 300 (cellule) hPa. Impostare il tempo di iniezione di 0,2 sec (DNA) o 0,5 sec (celle). Queste impostazioni potrebbero variare leggermente a seconda del tipo di microinjector e pipetta.
3. Pin l'embrione al fondo silicone attraverso il sacco vitellino senza toccare l'embrione corretta. Guarda la regione del cuore e aprire la sacca appena sopra questa regione.
4. Aggiungere 4 pin in tutto l'embrione per evitare qualsiasi movimento durante l'iniezione di cellule.
5. Utilizzando il micromanipolatore (impostato su manuale), slowly posizionare la punta della pipetta con un angolo di 45 ° al di sopra del pericardio, appena sopra la regione del cuore che deve essere iniettato (Figura 1).
6. Spostare la pipetta nella regione di interesse e attivare l'iniezione. Estrarre la pipetta il più rapidamente possibile. Assicurarsi che il cuore sta battendo correttamente dopo l'iniezione di DNA / cellula.

4. Embryo, isolato Cuore, e Espianto Cultura

1. Coltura gli embrioni E9.5 a 25% M2 medio e siero di ratto 75%, addizionato con penicillina / streptomicina, pre-riscaldato a 37 ° C e ossigenata con 40% O _2.
2. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura in una provetta di vetro da 25 ml, aggiungere delicatamente l'embrione, e ossigenato con il 40% O _2, prima di avvitare il tappo sul tubo. Incubare fino a 36 ore a 37 ° C durante la rotazione o agitazione (30 giri / min).
3. Al punto di tempo desiderato (ad esempio 24 ore), sezionare i cuori accuratamente con una pinza sottile, senza toccare i cuori, per prima decapitating gli embrioni; il cuore è facile da accise estraendolo con il tratto di efflusso distale.
4. Cultura cuore isolato per un altro 36-48 ore in DMEM con 50% FCS su un inserto Matrigel rivestite ambientato in un 12-pozzetti. Per un protocollo di miglioramento della cultura del cuore ¹⁵ Vedi Dyer e Patterson (2013).
5. Fare qualsiasi espianto della regione di interesse. Come esempio, sezionare il canale atrio-ventricolare (AVC) e coltura per 48 ore a collagene di tipo 1 gel ^16.

5. Iniezione Ultrasound-guida nel Cuore I n utero

1. Impostazione della macchina ad ultrasuoni e microinjector:
   1. Utilizzare il sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione con un trasduttore 40 MHz e la configurazione microiniezione su un binario.
   2. Impostare il volume di iniezione sul microinjector a 69 nl per iniezione. Consultare il manuale microiniezione del produttore per la programmazione microinjector.
2. Preparazione del microiinstallazione njection ed iniezione:
   1. Posizionare una micropipetta di vetro nel microinjector. Per assicurare un efficiente iniezione, prima mano il lato interno della pipetta con olio minerale aspirando fino al volume massimo. Quindi espellere nuovamente l'olio, lasciando 1-2 mm di olio all'interno dell'ago.
   2. Aspirare l'iniettato fino a raggiungere il volume massimo. Fare attenzione a non toccare le superfici con la punta dell'ago come questo smussare la punta e rendere più difficile l'iniezione.
   3. Per stabilizzare il corno uterino contenente gli embrioni durante l'iniezione, utilizzare un piatto Petri modificato con un foro nel mezzo (diametro 2,5 cm), coperto da una membrana di silicone sottile con una piccola fessura tagliata al centro, e posizionarlo sopra il sito di incisione . Stabilizzare il piatto Petri sul tavolo gestione del mouse posizionando 3-4 ciuffi di argilla sotto i bordi del piatto.
3. Procedura di iniezione:
   1. Radere l'addome di un topo in stato di gravidanza (allo stadio embrionale desiderato) prima di anestesiaSia per eliminare i peli. Trattare l'addome con un agente depilazione chimica per rimuovere capelli residuo e sterilizzare con il 70% di etanolo.
   2. Anestetizzare un mouse incinta con ossigeno / isoflurano tramite una maschera. Utilizzare 3-5% isoflurano in ossigeno al 100% per anestesia, seguita da 1-1,5% durante il resto della procedura. Assicurarsi che il mouse sia adeguatamente anestetizzato da pizzicando delicatamente le zampe e / o coda.
   3. Posizionare il supina mouse sulla tabella gestione del mouse (impostato per riscaldare a 37 ° C) e coprire gli occhi con lubrificante per prevenire la disidratazione della cornea.
   4. Applicare il gel per elettrodi sugli elettrodi e nastro le zampe agli elettrodi per monitorare la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, e l'ECG. Posizionare un termometro rettale per controllare la temperatura corporea.
   5. Verificare prima che il mouse è incinta visualizzando e contando gli embrioni con l'ecografia. Applicare il gel per ultrasuoni sull'addome e posizionare la testina di scansione sopra la vescica. Per coerenza, visualizzare la vescica prima,e contare embrioni in fianco e corna uterine destra, a partire dalla posizione della vescica. Assicurarsi che i cuori embrionali battono normalmente.
   6. Se il mouse è incinta, posizionare la capsula di Petri sopra il futuro sito di incisione con l'argilla. Premere il piatto leggermente sul ventre in modo che il piatto è in contatto diretto.
   7. Rimuovere il piatto e sterilizzare nuovamente l'addome. Fare un 1,5-2 cm linea mediana ventrale incisione, a circa 0,75-1 cm al di sopra della vagina, per aprire l'addome e del peritoneo. Evitare lesioni agli organi interni.
   8. Esteriorizzare sinistra o corno uterino destra con le pinze, tirare delicatamente attraverso la membrana di silicone del piatto, e stabilizzare nuovamente il piatto in argilla. Prevenire vasta tirare o manipolazione, in quanto ciò potrebbe causare sanguinamento dei vasi uterini e la morte prematura del femminile e / o embrioni.
   9. Contare di nuovo gli embrioni per garantire un'adeguata tenuta dei registri di cui embrioni sono stati iniettati.
   10. Applicare il gel per ultrasuoni sulla ucorni terine per l'immagine del cuore e per prevenire la disidratazione.
   11. Immagine il primo embrione da iniettare. Controllare il normale battito del cuore embrionale e tenere un registro di orientamento cranio-caudale e sinistra-destra dell'embrione. Se necessario, riposizionare il corno uterino leggermente per assicurare il corretto orientamento. Se questo risulta difficile, passare al successivo dell'embrione.
   12. Perforare l'utero accuratamente con l'ago microiniezione per posizionare l'ago in un angolo di 45 ° sopra l'embrione, leggermente al di fuori del pericardio (Figura 3). Per l'etichettatura di cellule epicardico immagine cuore in quattro camere e posizionare l'ago in modo che punti verso il solco atrio-ventricolare (Figura 3). Se l'angolo deve essere regolato, estrarre l'ago e riposizionare. Non regolare l'angolazione con l'ago all'interno dell'utero, dal momento che questo potrebbe rompere l'ago. Evitare la puntura altri tessuti, come arti o placenta.
   13. Spostare l'agosulla parete pericardica e forare con un movimento delicato, ma veloce. In generale, ci sarà una certa resistenza, ma spostando l'ago troppo veloce può causare la punta dell'ago per perforare il cuore stesso. La punta dovrebbe finire nello spazio pericardico del solco atrio-ventricolare. In caso di sanguinamento pericardico, globuli saranno visibili come un modello neve come bianco. Se questo è il caso, fermare iniettando l'embrione e passare ad un altro embrione.
   14. Iniettare l'iniettato. Iniettare al massimo 700 nl nello spazio pericardico per evitare effetti negativi sullo sviluppo cuori. Monitorare l'iniezione corretta da lieve, gonfiore temporale del sacco pericardico.
   15. Dopo iniezione, estrarre l'ago e confermare che iniettato può ancora essere espulso per assicurare che l'ago non è ostruito da frammenti di tessuto.
   16. Riposizionare la tabella di gestione per l'immagine e iniettare il prossimo embrione. Mantenere il numero di embrioni iniettati ad un massimo di 3-4 (in un corno uterino) per impedireanestesia esteso, per consentire embrioni di controllo nel corno uterino opposto, e per assicurare che la procedura non disturbare sviluppo embrionale.
   17. Dopo aver iniettato il numero desiderato di embrioni, rimuovere gel ultrasuoni eccesso e posizionare delicatamente il corno uterino nuovamente dentro l'addome nella posizione corretta.
   18. Chiudere dell'addome materno, utilizzando uno strato di sutura per peritoneo e muscoli addominali, e un secondo strato di sutura per la pelle.
   19. Iniettare il mouse con la prima dose di farmaci antidolorifici. Utilizzare una iniezione di 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfina 15 minuti prima di terminare anestesia e tre iniezioni supplementari con intervalli di 12 ore.
   20. Interrompere l'anestesia e monitorare il mouse per un adeguato recupero dalla procedura. Casa il mouse incinta in una gabbia individuale per la durata desiderata di follow-up.

Risultati

Utilizzando i protocolli di iniezione sopra descritti, le cellule possono essere etichettati e / o iniettati nel cuore embrionale mouse. Come prova di concetto, alcuni esempi sono riportati in cui il protocollo di iniezione e la ex vivo AVC espianto, isolato cuore, o tutta la cultura embrioni sono stati combinati (Figura 1).

La Figura 1 mostra la preparazione dell'embrione prima dell'iniezione delle cellule. L'embrione E9.5 viene estratt...

Discussione

I protocolli intra-cardiaca ex vivo di iniezione sopra descritti sono stati concepiti per preservare la funzione miocardica per almeno 48 ore in mid-stage (E9.5-E11.5) embrioni di topo. Questi approcci iniezione consentire l'iniezione spazialmente mirato di DNA o cellule. I pochi esempi riportati nelle figure 1-3 forniscono la prova di concetto per delineare ex vivo e in vivo dei meccanismi molecolari dei processi di sviluppo che si svolgono in regioni ristrette cardiaci, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			required to pressurize the injector
Rail system	VisualSonics
rotator			to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μm external diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection needles	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes
Petri dishes			10-cm diameter
Mineral oil	Sigma	M8410
Silicon membrane	Visualsonics		4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
hair removal agent	Nair
Eye lubricant	Optixcare	31779
Electrode gel (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasound gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 184
Glass petridishes	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	high glucose and 50% rat serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rat serum	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycin	Life Technologies	15140-12
oxygen 40%	Air liquid		required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagen type I	BD	354236	to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus			~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019