Capture spettrometria di massa Compound - un potente strumento per identificare nuovi c-di-GMP effettori Proteine

Riepilogo

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Abstract

Sono stati compiuti notevoli progressi nel corso degli ultimi dieci anni verso l'identificazione e la caratterizzazione di enzimi coinvolti nella sintesi (ciclasi diguanylate) e di degradazione (fosfodiesterasi) del secondo messaggero c-di-GMP. Al contrario, sono disponibili poche informazioni sui meccanismi molecolari e componenti cellulari attraverso cui questa molecola di segnalazione regolamenta una vasta gamma di processi cellulari. La maggior parte delle proteine ​​effettrici noti appartengono alla famiglia Pilz o sono degenerati ciclasi diguanylate o fosfodiesterasi che hanno rinunciato a catalisi e hanno adottato la funzione effettrici. Così, per definire meglio la rete c-di-GMP cellulare in una vasta gamma di batteri metodi sperimentali sono necessari per identificare e convalidare nuovi effettori che affidabile e in silico previsioni FAIL.

Abbiamo recentemente sviluppato un nuovo Capture spettrometria di massa Compound (CCMS) tecnologia basata come un potente strumento perbiochimicamente identificare e caratterizzare le proteine ​​di legame c-di-GMP. Questa tecnica è stata precedentemente riportato di essere applicabile ad una vasta gamma di organismi ^1. Qui diamo una descrizione dettagliata del protocollo che utilizziamo per sondare tali componenti di segnalazione. Come esempio, si usa Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunista in cui c-di-GMP gioca un ruolo critico nella virulenza e biofilm controllo. CCMS ha identificato il 74% (38/51) dei componenti note o previste della rete c-di-GMP. Questo studio spiega la procedura CCMS in dettaglio, e stabilisce come uno strumento potente e versatile per identificare nuovi componenti coinvolti in piccola molecola di segnalazione.

Introduzione

c-di-GMP è una chiave secondo messaggero utilizzato dalla maggior parte dei batteri per controllare vari aspetti della loro crescita e il comportamento. Per esempio, c-di-GMP regola la progressione del ciclo cellulare, la motilità e l'espressione di esopolisaccaridi e adesine superficiali ^2-4. Attraverso il coordinamento di tali processi c-di-GMP promuove la formazione di biofilm, un processo che è associata con infezioni croniche di una gamma di batteri patogeni ^5. c-di-GMP è sintetizzato da enzimi chiamati ciclasi diguanylate (DGCS) che ospitano un dominio catalitico GGDEF ^4. Alcuni DGCS possiedono un sito inibitorio che regola le attività ciclasi su c-di-GMP vincolante. Il degrado di c-di-GMP è catalizzata da due classi distinte di fosfodiesterasi (PDE) che ospitano sia un EAL catalitico o HD-GYP dominio ^6,7.

La maggior parte delle proteine ​​effettrici noti che legano direttamente c-di-GMP appartengono a una delle tre classi di proteine: cataliticoGGDEF o EAL domini alleato inattivi e domini Pilz, piccoli interruttori molecolari che subiscono cambiamenti conformazionali su c-di-GMP vincolante ^8. DGCS, PDE e Pilz proteine ​​sono ben caratterizzati e loro domini possono essere previsti in silico relativamente sicuro. Un particolare interesse è ora focalizzata sulla identificazione di nuove classi di effettori c-di-GMP. Alcuni effettori c-di-GMP con diversi motivi di legame sono stati descritti recentemente come la CRP / FNR Bcam1349 famiglia di proteine ​​in Burkholderia cenocepacia o FleQ regolatore trascrizionale in P. aeruginosa ^9,10. Inoltre, riboswitches GMP-specifici c-di-stati recentemente identificati e indicati per controllare l'espressione genica in modo c-di-GMP-dipendente ^11. I motivi c-di-GMP vincolanti di diversi effettori solo sono mal conservati fare previsioni bioinformatici di tali proteine ​​difficile. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo biochimico, che si basa sull'utilizzo di una spe c-di-GMPfica Compound Capture combinata con spettrometria di massa ^1,12,13.

Abbiamo recentemente abbiamo progettato un nuovo trivalente c-di-GMP Compound Capture (CDG-CC, Figura 1) ^1. Questo scaffold chimica è composto da: 1) un residuo c-di-GMP utilizzata come esca per catturare proteine ​​leganti c-di-GMP, 2) un gruppo reattivo UV-fotoattivabile utilizzato per attraversare link CDG-CC alle proteine ​​legate e 3) un biotina per isolare le proteine ​​catturate utilizzando sfere magnetiche rivestite di streptavidina. CDG-CC può essere usato per catturare direttamente e specificamente effettori c-di-GMP dalla miscela complessa di macromolecole come lisati cellulari. Compound Capture basano e approcci proteomica basati chimici sono stati precedentemente segnalati per essere applicabile ad una vasta gamma di organismi, ad esempio Caulobacter crescentus, Salmonella enterica sierotipo typhimurium e P. aeruginosa ^1,14.

In questo documento metodologico,forniamo una descrizione in profondità della procedura CCMS utilizzando estratti di P. aeruginosa come esempio. Questo studio stabilisce CCMS come uno strumento potente e versatile per identificare biochimicamente nuovi componenti che praticano la piccola molecola di segnalazione.

Protocollo

1. Preparazione del lisato

1. Grow P. cellule aeruginosa in LB alla OD desiderata.
   NOTA: Per la guida: usare ≈ 100 ml cultura / campione per le culture di fase stazionaria e ≈ 500 ml cultur / campione per le culture di fase log (OD _600nm = 0.5).
2. Pellet mediante centrifugazione per 20 min a 5000 x g.
3. Risospendere 0.5-1 g di pellet in 1 ml di tampone di lisi (MES 6,7 mm, 6,7 mM Hepes, NaCl 200 mm, 6,7 mM Kac, DDT 1 mM, pH 7,5) e aggiungere inibitore della proteasi (completo mini, senza EDTA) e come DNaseI.
4. Lyse le cellule 3 passaggi attraverso una cella di pressione francese, a 20.000 psi (vedi Materiali List).
5. Ultra-centrifuga il lisato cellulare a 100.000 xg per 1 ora a 4 ° C.
6. Salvare il surnatante (passare al punto 2).
7. Lavare il pellet con 1 ml di tampone di lisi 1x pipettando su e giù.
8. Ultracentrifuga a 100.000 x g per 1 ora a 4 ° C.
9. Flash-congelare il pellet inazoto liquido e conservare a -20 ° C fino utilizzato per la cattura di proteine ​​di membrana (vedi punto 3).

2. Rimozione dei nucleotidi liberi c-di-GMP e altri (frazione solubile Only)

1. Lavare una colonna PD10 dissalazione (vedi Materiali List) con 10 ml di tampone di lisi freddo.
2. Versare il supernatante (≈ 1 ml) sul PD10 per rimuovere nucleotidi.
3. Eluire con 4 ml di tampone di lisi freddo (500 gradini microlitri).
4. Selezionare le frazioni più concentrati, come determinato dal saggio Bradford, e piscina.

(Solo Frazione Membrane) 3. Pellet Resuspension e solubilizzazione

1. Risospendere il pellet in 500 a 1.000 ml di buffer di acquisizione 1x (senza detersivo) (vedi tabella 1).
   NOTA: Il pellet è difficile da riportare in sospensione. Si consiglia di prima pipetta su e giù con una pipetta per risospendere il pellet circa, poi utilizzare una siringa 27 G per omogeneizzare bene la soluzione.
2. Aggiungere 1% (w / v) di n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).
3. Incubare a 4 ° C per almeno 2 ore (o O / N) su una ruota girevole.
4. Ultracentrifuga a 100.000 x g per 1 ora a 4 ° C.
5. Raccogliere il surnatante.

4. Protein misura della concentrazione

1. Misurare la concentrazione di proteine ​​mediante saggio Bradford (mediante saggio BCA per la frazione di membrana).
2. Impostare la concentrazione totale di proteine ​​a 10 mg / ml.

5. Capture

1. Miscelare 300 mg di proteina con 1 mM di PIL, GTP, ATP, CTP, e 20 microlitri di tampone 5x cattura (HEPES 100 mM, 250 mM KAC, 50 MgAc mM, 5% glicerolo, pH 7,5) (Tabella 1). Regolare il volume di reazione di 100 microlitri con H ₂ O.
   NOTA: il volume totale comprende il volume del CDG-CC e c-di-GMP nel caso della concorrenza controllo (vedere fase 5.3 e tabella 2).
   NOTA: tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in 200 &# 181; l strisce PCR 12-tubo (Thermo Scientific).
   NOTA: per la frazione di membrana, assicurarsi di mantenere sempre la concentrazione DDM sopra della concentrazione micellare critica (0,01% w / v) fino alla fase solubilizzazione delle proteine ​​in 8 M Urea (punto 7.1).
2. Incubare a 4 ° C per 30 minuti su una ruota girevole.
3. Aggiungere 10 mM CDG-CC (concentrazione finale).
   NOTA: includere un controllo senza CDG-CC (indicato come "controllo tallone"), e un controllo integrato con 1 mM c-di-GMP ("controllo della concorrenza") (vedi tabella 2).
   NOTA: la concentrazione di CDG-CC può essere regolato da 1 a 10 micron.
4. Incubare a 4 ° C per almeno 2 ore (/ N per la frazione di membrana O) su una ruota girevole, al buio.
5. Dopo un breve giro, cross-link per l'attivazione della porzione reattiva della CDG-CC con la luce UV per 4 minuti, utilizzando un CaproBox (vedi lista materiali, λ = 310 nm, Irradiance ≥10 mW / cm², distanza dalla sorgente = 2 centimetri). NOTA: rimuovere il coperchio delle strisce prima cross-linking.
6. Aggiungere 25 ml 5x tampone di lavaggio (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7.5) e 50 ml di ben risospesa sfere magnetiche streptavidina, omogenizzare delicatamente.
7. Incubare a 4 ° C per 1 ora su una ruota girevole.

6. lavaggio Steps

NOTA: (Magnet: vedi Materiali List). Iniziare con una cattura delle sfere magnetiche nel coperchio strip PCR, con il magnete. Quindi sostituire la striscia PCR con uno nuovo contenente la soluzione di lavaggio successivo. Rimuovere il magnete e risospendere le sfere, e incubare 2 min. Spin giù e sostituire il coperchio da un coperchio fresco.

1. Fasi di lavaggio (frazione solubile solo)
   1. Lavare 6 volte in 200 microlitri tampone di lavaggio 1x.
   2. Lavare una volta in 200 ml HPLC H ₂ O.
   3. Lavare 6 volte in 200 ml 80% acetonitrile.
   4. Lavare 2 volte in 200 microlitri HPLC H ₂ O.
2. Fasi di lavaggio (membraFrazione ne solo)
   1. Lavare 5 volte in 200 microlitri 1x tampone di lavaggio + 0,1% DDM.
   2. Lavare 2 volte in 200 microlitri 1x tampone di lavaggio + 0,05% DDM.
   3. Lavare una volta in 200 microlitri 1x tampone di lavaggio + 0,025% DDM.
   4. Lavare una volta in 200 microlitri 1x tampone di lavaggio + 0,0125% DDM.
   5. Lavare 3 volte in 200 ml di ABC 100 mm (di bicarbonato di ammonio, NH ₄ CO ₃₎ + 2 M Urea.

7. MS Preparazione del campione

1. Risospendere le perline (direttamente nel coperchio) in 20 microlitri di ABC 100 mm (ABC 100 mm + 8 M Urea per la frazione di membrana) e trasferire in provette da 1,5 ml.
2. Frazione di membrana solo: incubare a 60 ° C per 5 min, agitando a 500 rpm.
3. Aggiungere 0,5 microlitri TCEP 200 mm (tris (2-carbossietil) fosfina) e incubare a 60 ° C per 1 ora, agitando a 500 rpm. Raffreddare a 25 ° C.
4. Aggiungere 0,5 ml di preparati al momento 400 mm iodoacetamide e incubare a 25 ° C per 30 minuti, agitando unT 500 rpm e al buio.
5. Aggiungere 0,5 ml di 0,5 M N-acetil cisteina e incubare a 25 ° C per 10 min agitando a 500 rpm.
6. Soltanto frazione membrana: aggiungere 1 ml Lys-C e incubare a 37 ° C, O / N.
7. Aggiungere 2 mg tripsina e incubare O / N a 37 ° C, agitando a 500 rpm (involucro in Parafilm per evitare l'essiccazione).
   NOTA: i campioni possono essere conservati a -20 ° C in questa fase.
   NOTA: frazione di membrana solo: aggiungi ABC 100 mM per regolare la concentrazione di urea per <2 M prima aggiunta di tripsina.
8. Brevemente centrifugare le provette e raccogliere perle con il magnete.
9. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo di 1,5 ml (ripetere questo passaggio se perle sono lasciati).
10. Aggiungere 5 microlitri 5% TFA (acido trifluoroacetico) + 1 ml 2 M HCl (15 microlitri 5% TFA + 5 microlitri 2 M HCl per la frazione di membrana).
11. Colonne Condizione C18 MicroSpin (Il Gruppo Nest, MA, USA) con 150 microlitri acetonitrile (spin 20 sec a 2.400 rpm).
12. EquiLibrate le colonne C18 2 volte con 150 microlitri 0,1% TFA (spin 20 sec, 2.400 rpm).
13. Caricare il campione e spin 2 min, 2.000 giri.
14. Ricaricare il flow-through nella colonna e ripetere la fase di centrifuga (2 min, 2.000 rpm).
15. Lavare 3 volte con 150 microlitri 0,1% TFA, 5% acetonitrile (20 sec, 2.400 rpm).
16. Prendere una nuova provetta e eluire due volte con 150 microlitri 0,1% TFA, 50% acetonitrile (2 min, 2.000 rpm).
17. Asciugare i peptidi in una velocità-vac.
18. Risospendere in 40 microlitri 98% H ₂ O, 2% acetonitrile, 0,15% di acido formico.
19. Sonicare 20 sec (ciclo impulso 0.5, l'ampiezza del 100%, vedi Lista dei materiali) e spin down 5 sec, 12.000 rpm (da banco centrifuga). Vortex 10 sec, e spin down 5 sec, 12.000 rpm. Trasferire in un flaconcino HPLC per l'analisi LC-MS / MS.
20. Congelare a -20 ° C.
    NOTA: i campioni possono essere conservati a -20 ° C in questa fase.

8. LC-MS / MS Analysis

1. Eseguire un nano-LC (sistemi nano-LC) equipped con una colonna RP-HPLC (75 um x 37 cm) imballato con resina C18 (Magic C18 AQ 3 micron) usando un gradiente lineare dal 95% di solvente A (acido formico al 0,15%, 2% acetonitrile) e 5% di solvente B ( 98% acetonitrile, 0,15% di acido formico) al 35% di solvente B oltre 60 minuti ad una portata di 0,2 ml / min.
2. Analizzare i peptidi con LC-MS / MS (doppia pressione LTQ-Orbitrap Velos spettrometro di massa, collegato ad una sorgente ionica electrospray).
   NOTA: La modalità di acquisizione dei dati è stato impostato per ottenere una alta risoluzione MS scansione nella parte FT dello spettrometro di massa ad una risoluzione di 60.000 FWHM seguita da scansioni MS / MS nella trappola ionica lineare delle 20 ioni più intensi. Per aumentare l'efficienza dei tentativi MS / MS, la carica dello stato di screening modus è stata attivata per escludere non assegnato e oneri singolarmente ioni. Collusione dissociazione indotta è stata innescata quando il precursore superato 100 conteggi ioni. La durata esclusione dinamico è stato impostato a 30 sec. Il tempo di accumulo di ioni è stato fissato a 300 msec (MS) e 50msec (MS / MS).

9. Database Search

1. Scarica il P. aeruginosa NCBI database tramite la homepage NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
2. Convertire gli spettri MS raw in file generici mascotte (MGF) utilizzando lo strumento di conversione MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
3. Cerca questo file mgf utilizzando MASCOTTE versione 2.3 contro il P. aeruginosa NCBI database contenente in avanti e le voci di proteine ​​reverse-esca.
4. Eseguire un in silico tripsina digestione dopo lisina ed arginina (meno seguito da prolina) tollerando due spaccature nella peptidi completamente triptici perse.
5. Impostare i parametri di ricerca database per consentire metionine ossidato (15,99491 Da) come modifiche variabile e carboxyamidomethylation (57,021464 Da) di residui di cisteina come modifica fisso. Per mascotte ci scrutaing scansioni ad alta risoluzione, impostare la tolleranza di massa precursore di 15 ppm e impostare la tolleranza di massa frammento di 0.6 Da. Infine, impostare la proteina FDR al 1%.
6. Importare le ricerche mascotte di P. Esperimenti aeruginosa CCMS in Scaffold (Proteomesoftware, versione 3), impostare i parametri per ottenere una proteina FDR vicino a 1%, ed estrarre il totale conta spettrali.
7. Per i risultati rappresentativi presentati in questo documento, abbiamo usato un test T accoppiato per confrontare l'esperimento con il controllo della concorrenza, e solo considerato colpi con un valore di p inferiore a 0,1, e un rapporto di conteggio spettrale sopra 2 (sperimentare conteggi spettrali / controllo della concorrenza spettrale conta).
8. I dati possono essere esportati in qualsiasi software di foglio di calcolo per ulteriori analisi.

10. La quantificazione senza etichetta

1. Importare i file raw in software progenesi LC-MS (Nonlinear Dynamics, versione 4.0).
2. Eseguire l'allineamento LC-MS e la rilevazione in funzione Setti predefinitongs.
3. Esportare i dati in formato mgf da progenesi LC-MS.
4. Cerca gli spettri MS / MS con la mascotte contro il NCBI P. banca dati contenente aeruginosa in avanti e le voci di proteine ​​reverse-esca.
5. Importare i risultati di ricerca di database in progenesi LC-MS e mappare i peptidi identificazioni alle funzioni MS1.
6. Per la valutazione dei dati (calcolo dei livelli di significatività, rapporti fold-change) è stato utilizzato lo script ProteinSQAnalysis di SafeQuant (soglia: valore q inferiore a 0,1, il rapporto di conteggio spettrale sopra 2).

Risultati

Per identificare nuovi c-di-GMP effettori in P. aeruginosa abbiamo usato sistematicamente CCMS per analizzare le frazioni solubili e di membrana di P. aeruginosa ceppo PAO1 da una cultura fase di log (OD ₆₀₀ = 0,5). Qui riassumiamo e discutere i risultati rappresentativi di questa pesca. Sono stati utilizzati quattro repliche biologiche indipendenti. Per ogni esperimento sono stati utilizzati due differenti concentrazioni CDG-CC (5 micron e 10 micron). Per rilevare se la specificità, esperi...

Discussione

Particolare attenzione dovrebbe essere presa in diverse fasi del protocollo. La concentrazione proteica è un parametro critico con una concentrazione di 10 mg / ml di essere difficile da raggiungere quando le cellule vengono coltivate in condizioni di crescita specifici (ad esempio biofilm o piccole varianti colonia). Così, la risospensione pellet deve essere eseguita in un basso volume di tampone di lisi. Le concentrazioni di proteine ​​possono essere diminuiti di 8 mg / ml. Rispetto al metodo pubblicato...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
caproBox	caprotec bioanalytics	1-5010-001 (220 V)	UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMag	caprotec bioanalytics	included in the CCMS Starter Kit	For easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKit	caprotec bioanalytics	upon request	The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01
12-tube PCR strips	Thermo Scientific	AB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeter	Hielscher ultrasound technology	UIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure Cell	Thermo Electron Corporation	FA-003