L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

Riepilogo

Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l'espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l'analisi dell'espressione genica e della cromatina.

Abstract

Tessuti embrionali e larvali Drosophila melanogaster spesso contengono una miscela altamente eterogeneo di tipi di cellule, che può complicare l'analisi di espressione genica in questi tessuti. Così, per analizzare profili di espressione genica specifica-cellulari da tessuti di Drosophila, potrebbe essere necessario isolare specifici tipi cellulari con elevata purezza e con rese sufficienti per applicazioni a valle come profiling trascrizionale e cromatina immunoprecipitazione. Tuttavia, la morfologia cellulare irregolare in tessuti come il sistema nervoso centrale, insieme con la rara popolazione di specifici tipi cellulari in questi tessuti, può porre problemi per i metodi tradizionali di isolamento cellulare come microdissezione laser e cella fluorescenza-attivato (FACS) . Qui, un approccio alternativo alla caratterizzazione dei profili di espressione genica specifica delle cellule utilizzando a base di affinità isolamento dei nuclei con tag, piuttosto che cellule intere, è descritto. Nuclei in c specificatipo ell di interesse sono geneticamente etichettati con un tag EGFP busta localizzato nucleare utilizzando il sistema di espressione binario Gal4/UAS. Questi nuclei EGFP-tag possono essere isolate utilizzando anticorpi contro GFP che sono accoppiati a biglie magnetiche. L'approccio descritto in questo protocollo consente un isolamento uniforme di nuclei di specifici tipi cellulari nel sistema nervoso centrale larvale Drosophila ad elevata purezza ed a livelli sufficienti per l'analisi di espressione, anche quando questi tipi cellulari rappresentano meno del 2% della popolazione totale di cellule nella tessuto. Questo approccio può essere utilizzato per isolare i nuclei da un'ampia varietà di Drosophila embrionale e tipi cellulari larvali utilizzando specifici driver di GAL4, e può essere utile per isolare i nuclei da tipi di cellule che non sono adatti per FACS o microdissezione laser.

Introduzione

Tessuti Drosophila come il sistema nervoso centrale contengono una miscela complessa di tipi cellulari. Così, per analizzare profili di espressione genica specifica-cellulari da tessuti di Drosophila, è prima necessario isolare una popolazione omogenea di cellule specifiche in quantità sufficienti per consentire applicazioni a valle. Metodi per isolare cellule da tessuti intatti includono microdissezione laser e cella fluorescenza-attivato (FACS) di cellule intere. Mentre FACS è stato usato per isolare cellule e nuclei da embrioni di Drosophila e da Caenorhabditis elegans per l'espressione genica e cromatina profiling ^1-3, FACS e microdissezione laser possono essere difficili da eseguire con successo nei tessuti che contengono tipi cellulari altamente mescolati tra loro o che le cellule contengono con morfologia irregolare, come i neuroni. Per superare questa difficoltà, nuclei piuttosto che cellule possono essere isolate da specifici tipi cellulari e utilizzati per la successiva generazionee profili di espressione. È importante sottolineare che, in base microarray-mRNA analisi di espressione utilizzando campioni di RNA nucleari mostra i risultati generalmente comparabili con quelli eseguiti utilizzando RNA totale ^{4, 5.} Inoltre, l'analisi di espressione genica utilizzando RNA nucleare è stato usato con successo per studiare l'espressione genica in organismi multipli compresi C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, e gli esseri umani ^{4, 5 2, 3.}

Diversi approcci sono stati recentemente descritto per l'isolamento di specifiche popolazioni di nuclei etichettati da tessuti di Drosophila che sono adatti per l'analisi di espressione genica e / o immunoprecipitazione della cromatina. L'isolamento lotto di cromatina tessuto-specifico per il metodo di immunoprecipitazione (bit-Chip) utilizza FACS per isolare nuclei fissati sulla base di cellula-tipo particolare espressione di GFP nucleare localizzata ^2. Questo approccio è stato successfully utilizzato per analizzare la distribuzione delle modificazioni degli istoni e fattori di trascrizione con cromatina immunoprecipitazione di nuclei isolati dal mesoderma di Drosophila embrioni ^2. Tuttavia, gli approcci basati FACS possono essere meno adatti per isolare nuclei etichettati che costituiscono solo una piccola parte di una popolazione mista a causa della maggiore tempo liste necessario avere numeri adatti per applicazioni a valle. Per superare queste limitazioni, diversi gruppi hanno utilizzato tecniche di isolamento a base di affinità per purificare nuclei che sono etichettati con un epitopo specifico in un particolare tipo di cellula. L'isolamento dei nuclei contrassegnati in tipi cellulari specifici metodi (intatto) sviluppati per l'utilizzo in Arabidopsis thaliana ^{6, 7} è stato recentemente adattato per l'uso in Drosophila ^8. In questo metodo, una proteina dell'involucro fusione nucleare che è un substrato per in vivo biotinylation è coexpressed con l'Escherichia coli biotina ligasi Bira in tipi cellulari specifici. Nuclei marcati con biotina possono essere successivamente purificati da popolazioni miste che utilizzano basato streptavidina-isolamento affinità. Usando questo approccio, i nuclei sono stati etichettati con successo e isolato dal mesoderma di embrioni di Drosophila in cui una proteina dell'involucro fusione nucleare è stato espresso sotto il controllo di un potenziatore specifico mesoderma ^8. Gli autori hanno anche generate proteine ​​dell'involucro di fusione nucleare che possono essere espressi in qualsiasi tipo di cellula sotto il controllo della sequenza regolatrice GAL4, UAS ^9. Questo approccio è in grado di isolare rapidamente sottoinsiemi di nuclei etichettati da popolazioni miste, ma richiede tre costrutti transgenici separati e può quindi essere inadatto per applicazioni particolari genetici. Recentemente, un approccio è stato descritto in cui SUN (S AD1 e C-84 ONU)-dominio contenente proteine ​​che localizzano alla membrana interna dell'involucro nucleare sono stati contrassegnati conproteine ​​fluorescenti ed espresso sotto il controllo del sistema Gal4/UAS ^10. I nuclei sono stati isolati in presenza di detergente non ionico per rimuovere la membrana esterna della membrana nucleare, e purificati per affinità utilizzando biglie magnetiche accoppiate ad anticorpi anti-GFP. Questo approccio è stato utilizzato con successo per isolare piccole popolazioni di nuclei etichettati da specifici sottotipi neuronali all'interno del cervello adulto di Drosophila ^10.

Qui, un protocollo per l'isolamento di nuclei etichettati da una popolazione mista di cellule di Drosophila tessuto larvale è descritto. Questo metodo è stato sviluppato in modo indipendente, ma è simile a quello descritto da Henry et al. ¹⁰ In primo luogo, i nuclei sono stati etichettati con un tag fluorescente che viene espresso solo in specifici tipi cellulari in Drosophila melanogaster per facilitare il successivo isolamento di nuclei contrassegnate da popolazioni miste utilizzando un approccio basato affinità. Per etichettare nuclei,il dominio KASH (K larsicht / A nc-1 / S ino h omologia) è stato utilizzato. Il dominio KASH è un dominio transmembrana che localizza alla membrana esterna della busta nucleare, in parte attraverso le interazioni con SUN-dominio contenenti proteine ​​all'interno dello spazio perinucleare ^11. Il dominio KASH C-terminale delle proteine ​​come Drosophila Msp-300 e Klarsicht ancore queste proteine ​​alla membrana nucleare esterno, mentre i loro domini N-terminale interagiscono con proteine ​​del citoscheletro actina o come microtubuli nel citoplasma ^12-14. Costrutti sono stati generati in cui il dominio KASH di Drosophila Msp-300 è stata fusa al C-terminale della EGFP, sotto il controllo della sequenza regolatrice GAL4, UAS nel vettore pUAST-attB ^{15, 16.} Utilizzando integrazione sito-specifica phiC31, sono stati generati moscerini transgenici in cui le UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH transgene è stato inserito nel attP2 loci sul cromosoma3L ^17. Il UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH aria può essere attraversato con le mosche che esprimono il conducente GAL4 in un particolare tipo di cellula, con conseguente espressione mirata di EGFP sulla membrana nucleare esterno nel tipo cellulare di interesse. Nuclei etichetta possono essere purificati da popolazioni di cellule miste che utilizzano anticorpi contro GFP accoppiati a sfere magnetiche. In questo approccio, l'uso di detergente non ionico non è necessaria perché il tag EGFP è localizzato sul lato citoplasmatico della membrana nucleare esterno, ed è quindi accessibile agli anticorpi.

Il protocollo descritto di seguito può essere utilizzata per isolare / arricchire nuclei EGFP-etichettata specifici tipi cellulari in Drosophila tessuti larvali, per quantificare la purezza e resa di nuclei isolati, e per estrarre RNA nucleare adatto per trascrizione inversa reazione polimerasica a catena quantitativa (qRT -PCR) analisi di espressione genica. L'isolamento e l'affinità purificazione dei nuclei (esclusi Tissue dissezione) può essere eseguito in meno di un'ora. I risultati sono presentati mostrando che i nuclei gliali possono essere isolati con successo dal lobo ottica larvale e occhio disco immaginale, e utilizzati per la successiva analisi di espressione genica. Si prevede che questo approccio possa essere utile per l'isolamento / arricchimento di nuclei etichettati da tessuti embrionali e larvali in cui le cellule bersaglio costituiscono meno del 5% della popolazione totale. Tutte le scorte Drosophila e plasmidi ottenuti da questo studio sono disponibili su richiesta degli autori.

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Protocollo

1. Generazione e caratterizzazione di EGFP :: KASH Drosophila

1. Autista Croce Gal4 vola UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH vola. In alternativa, mosche ricombinanti che portano sia il driver GAL4 e il transgene UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH possono essere generati utilizzando tecniche genetiche standard. Questo secondo approccio è vantaggioso se sono necessarie grandi quantità di progenie.
2. Caratterizzare l'espressione del marcatore EGFP :: KASH utilizzando tecniche di microscopia standard. Nota: espressione EGFP può essere osservato mediante tecniche di microscopia normali in sezionati, fissi tessuti di Drosophila, o in tutta larve, e non richiede l'uso di un anticorpo.
   1. Determinare il modello di espressione della EGFP :: marcatore KASH in tutto l'organismo sotto un microscopio a fluorescenza dissezione (vedi Materiali PDF). Nota: Molti piloti GAL4, compreso il conducente repo-GAL4 illustrato nella figura 1, mostra nmodelli onspecific di espressione in altri tessuti larvali come la ghiandola salivare (vedi risultati).
   2. Analizzare il pattern di espressione EGFP :: KASH nel tessuto sezionato di interesse utilizzando la microscopia confocale.
      1. Fissare il tessuto di interesse utilizzando formaldeide ad una concentrazione finale del 4%, e macchia DNA utilizzando DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml di visualizzare la localizzazione della EGFP :: KASH tag rispetto al DNA.
      2. Acquisire immagini utilizzando un obiettivo 40X / 1,30 olio per immersione o un obiettivo 20X / 0,75 olio di immersione, a seconda delle dimensioni del tessuto di interesse. Le seguenti condizioni di eccitazione / emissione possono essere usate per l'acquisizione delle immagini: 408 nm/425-475 nm (DAPI); 488 nm / 525-550 nm (GFP).

2. Isolare Nuclei di Drosophila larvali tessuti

1. Preparare attrezzature per la dissezione dei tessuti larvale e successivo isolamento nuclei. Si noti cheinteri embrioni dechorionated potrebbero anche essere utilizzati come materiale di partenza se desiderato. Si raccomanda di usare tessuti larvali parzialmente sezionato anziché intero larve se il tipo cellulare di interesse è presente in un tessuto specifico quale il disco immaginale. Questo riduce il legame non specifico, ed elimina anche i problemi che possono essere causati da espressione di alcuni driver GAL4 nelle cellule non bersaglio.
   1. Preparare due paia di pinze taglienti (vedi Materiali PDF), una lastra di vetro siliconato 9-bene (vedi Materiali PDF) e PBT (1x PBS, pH 7.4, 0.1% Tween-20).
   2. Prebind l'anticorpo GFP alle biglie magnetiche. Questo passaggio deve essere avviato prima di iniziare la dissezione. Aggiungere 10 ml di biglie magnetiche (Invitrogen, vedere Materiali PDF) e 2 mg di anticorpo GFP (Roche, vedi Materiali PDF) a 400 ml di tampone di lavaggio (1x PBS, pH 7,4; 2,5 mM MgCl ₂₎ in una provetta da 1,5 ml . La quantità di perline e anticorpo utilizzato può essere ottimizzato se necessario, in base alla quantità di destinazione nel samPLE e l'affinità di legame dell'anticorpo ai talloni.
   3. Incubare le perline e anticorpo con rotazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
   4. Posizionare il tubo da 1,5 ml contenente le perline e anticorpi nel rack magnetico (vedi Materiali PDF) e permettere le perle di legarsi magnetico per circa 1-2 min. Rimuovere il surnatante contenente l'anticorpo non legato e tampone di lavaggio usando una pipetta 1 ml. Le perle resteranno vincolati alla parete della provetta da 1,5 ml sul lato adiacente al magnete.
   5. Sciacquare le perle due volte con 1 ml di soluzione di lavaggio ogni volta come descritto nella sezione 2.1.4. Rimuovere la provetta da 1,5 ml dal rack magnetico e invertire brevemente per mescolare le perline e tampone di lavaggio durante ogni fase di lavaggio.
   6. Conservare le perle anticorpo legato a tampone di lavaggio fino al momento di continuare con la fase 2.7. Le perle non dovrebbe essere permesso di asciugare in qualsiasi fase del protocollo.
2. Sezionare tessuti larvali in PBT e trasferire i tessuti dissezionati diun pozzetto del piatto 9-bene. Tipicamente, la dissezione del lobo ottico e l'occhio disco immaginale da 100 larve terzo instar fornisce materiale sufficiente per downstream analisi di espressione genica in seguito isolamento nuclei.
3. Risciacquare il tessuto isolato in tampone di estrazione nucleare (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5; 2,5 mM MgCl _2; KCl 10 mM) in una provetta da 1,5 ml. Trasferire isolati tessuti larvali a un 1 ml Dounce Omogenizzatore (vedi Materiali PDF) sul ghiaccio che contiene 1 ml di tampone di estrazione nucleare fresco. Incubare in ghiaccio per 5 min. Non è necessario aggiungere inibitori della proteasi se RNA deve essere estratto dopo isolamento nuclei.
4. Distruggere il tessuto da 20 colpi con il pestello sciolto e poi incubare il campione in ghiaccio per 10 minuti per consentire alle cellule a gonfiarsi. Estrarre i nuclei delle cellule utilizzando 15 colpi con il pestello stretto. Il numero di colpi con i pestelli allentato e stretto deve essere ottimizzato per diversi tessuti e tipi di cellule; eccesso omogeneizzazione può provocarenuclei tosata, mentre omogeneizzazione insufficiente non estrarrà tutti i nuclei dal tessuto.
5. Filtrare l'omogeneizzato, che contiene i nuclei e detriti cellulari, attraverso una dimensione dei pori del filtro 40 micron (vedi Materiali PDF) che è stato prerinsed con tampone di omogeneizzazione nucleare. Raccogliere il omogenato filtrato in una nuova provetta.
6. Raccogliere campioni di pre-isolamento per successive analisi per determinare la resa nuclei, l'integrità nuclei, e di determinare livelli di trascrizione dei geni bersaglio prima di nuclei isolamento.
   1. Trasferire 50 ml di omogenato filtrata in una fiala da 1,5 ml con una pipetta. Questo è il campione pre-isolamento. Aggiungere 500 ml di Trizol reagente (vedi Materiali PDF, ATTENZIONE), miscelare e conservare a -20 ° C per il successivo isolamento di RNA (punto 3.1).
   2. Trasferire 20 ml di omogenato filtrata in una fiala da 1,5 ml.
      1. Aggiungere DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml, e inccampione Ubate in ghiaccio per 10 min.
      2. Trasferimento nuclei DAPI colorati con un coprioggetto rivestito poli-lisina, e mettere su un vetrino da microscopio. Sigillare il coprioggetto con smalto trasparente.
      3. Verificare l'integrità nuclei, e la presenza di nuclei GFP-tagged di interesse utilizzando microscopio a fluorescenza. Nota: Non è necessario fissare i nuclei, o colorare per GFP se queste diapositive sono analizzate in tempi ragionevolmente rapidi dopo la preparazione (entro 24 ore).
   3. Trasferimento 10 ml di omogenato filtrata in una fiala da 1,5 ml e aggiungere 90 ml di tampone di lavaggio (PBS 1x, pH 7,4; 2,5 mM MgCl _2). Aggiungere DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml, e incubare in ghiaccio per 10 min. Determinare la resa nuclei nel campione pre-isolamento con un emocitometro per contare i nuclei DAPI-positivi con epifluorescenza sotto un obiettivo 10X aria.
7. Posizionare il tubo da 1,5 ml contenente le perline anticorpo-bound (preparati nella sezione 2.1.6) in un rack magnetico,e consentire alle sfere magnetiche di legarsi magnete per almeno 2 minuti come descritto nella sezione 2.1.4. Rimuovere il tampone di lavaggio dai branelli legata all'anticorpo usando una pipetta 1 ml, e aggiungere l'omogenato filtrato dal punto 2.5 al provetta da 1,5 ml con una pipetta 1 ml.
8. Capovolgere delicatamente la provetta diverse volte per mescolare e incubare a 4 ° C per 30 minuti con end-over-end agitazione. Evitare bolle nel tubo se possibile, in quanto questi possono causare aggregazione dei nuclei.
9. Posizionare il tubo da 1,5 ml contenente le perline anticorpo-bound e omogenato in un rack magnetica, e permettono le sfere magnetiche di legarsi al magnete per almeno 2 minuti come descritto nella sezione 2.1.4. Rimuovere l'omogeneizzato contenente la frazione non legata nuclei con una pipetta 1 ml.
10. Lavare il campione 3x con 1 ml di soluzione di lavaggio ogni volta. Rimuovere il tubo da 1,5 ml contenente le perline, nuclei legati e lavare tampone dal rack e miscelare diverse volte, quindi inserire il tubo nel rack magnetico come descrittonel passo 2.9 e rimuovere il surnatante con una pipetta 1 ml.
11. Aggiungere 150 ml di tampone di lavaggio per le perline, che dovrebbero essere legati ai nuclei bersaglio. Questo è il campione post-isolamento. Preparare i campioni per le analisi di microscopia e di estrazione di RNA successiva.
    1. Trasferire 20 ml di campione post-isolamento per una nuova provetta da 1,5 ml e macchia con DAPI e analizzare come descritto nella sezione 2.6.2. Contare il GFP + / DAPI + e + GFP-/DAPI nuclei catturate da perline magnetiche per determinare la purezza della GFP + arricchito nuclei nel campione post-isolamento.
    2. Aggiungere 1 ml di Trizol reagente al resto del campione post-isolamento, miscelare, e conservare a -20 ° C per il successivo isolamento dell'RNA (passo 3.1). Nota: I campioni in Trizol possono essere conservati per diverse settimane, se necessario, a -20 ° C. Non è necessario per eluire i nuclei dalle perline magnetiche prima estrazione di RNA utilizzando Trizol reagente, because le perline non interferiscano con il successivo isolamento dell'RNA.

3. Determinare livelli di trascrizione nei nuclei isolati da tessuti larvali

1. Isolare l'RNA dai campioni pre-e post-isolamento isolamento preparati in sezioni 2.6.1 e 2.11.2 utilizzando il protocollo standard descritto per l'estrazione di RNA-based Trizol (vedi Materiali PDF) con le seguenti modifiche:
   1. Dopo precipitazione del pellet di RNA, aggiungere 19,2 ml di acqua priva di RNasi e 0,8 ml di reagente RNASecure (vedi Materiali PDF) al pellet e incubare a 60 ° C per 20 minuti per inattivare RNasi.
2. Determinare la concentrazione di RNA con un colorante fluorescente vincolante-RNA, come il kit Qubit saggio RNA (vedi Materiali PDF) usando l'2.0 Fluorometro QubitR seguendo il protocollo del produttore.
3. Sintetizzare cDNA utilizzando una trascrittasi inversa amplificando come il EpiScript Reverse kit trascrittasi e primer oligodT seguendo le istruzioni del produttore. Nota: in genere, 50 a 100 ng di RNA genera cDNA sufficiente per eseguire le analisi di espressione genica aerei. Quantità equivalenti di pre-isolamento e post-isolamento dell'RNA dovrebbero essere usati per generare cDNA.
4. Aggiungere 180 ml di acqua priva di nucleasi al campione di cDNA 20 microlitri per diluire questo 10 volte prima di real-time PCR quantitativa (qPCR) analisi. Questa diluizione è un passo importante, perché campioni di cDNA non diluiti possono inibire la qPCR.
5. Preparare una master mix qPCR con polimerasi e dNTP, 4 pmoli ciascuno di avanti e indietro innesco, fatta con acqua sterile al volume finale di reazione di 20 microlitri.
   1. Disegnare primer qPCR per indirizzare geni suscettibili di essere espresso nel tipo cellulare di interesse, e allo stadio di sviluppo in cui il tessuto viene raccolto. Primer design per attraversare un introne, se possibile, in modo che genomica eprodotti cDNA PCR possono essere distinti. Nota: Se il profilo di espressione genica del tipo di cellula bersaglio non è noto, primers contro eGFP, che deve essere espressa specificamente nella popolazione nuclei targhetta, possono essere usati per ottimizzare il protocollo per un tipo particolare e tessuti (Tabella 1) cellule.
6. Determinare i livelli di trascrizione relative di ciascun gene di interesse nei campioni pre-e post-isolamento isolamento rispetto ad una serie di diluizioni di cDNA preparato da tutto il tessuto. Livelli di trascrizione dei geni bersaglio dovrebbero essere normalizzati a un gene di riferimento, come Rpl32 (o, preferibilmente, più geni di riferimento).

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Risultati

Il driver repo-GAL4 (Bloomington archivio numero 7415) è specificamente espresso in cellule gliali del sistema nervoso Drosophila, a diversi stadi di sviluppo ^18. Le mosche sono stati generati che esprimono stabilmente UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH sotto il controllo del guidatore repo-GAL4 utilizzando tecniche genetiche standard. Per caratterizzare il profilo di espressione del transgene EGFP :: KASH in queste mosche, il pattern di espressione GFP nel lobo ottica se...

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Discussione

Questo protocollo può essere utilizzato per isolare o altamente arricchire specificamente nuclei contrassegnati da popolazioni di cellule miste in Drosophila embrionale o tessuti larvali. Usando questo protocollo, i nuclei possono essere isolate dai tessuti sezionati in circa 1 ora. La purezza e resa dei nuclei isolati devono essere determinati sperimentalmente per ogni tipo di cellula. Può essere difficile quantificare i nuclei del tallone con associazione nella fase post-isolamento del protocollo utilizzand...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9-well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L