Nel metodo in vitro per osservare le interazioni E-selectina-mediata Tra prostata cellule tumorali circolanti derivate da pazienti e Cellule endoteliali umane

Riepilogo

Il nostro rapporto descrive un metodo unico per visualizzare e analizzare le interazioni CTC / CE del cancro della prostata in condizioni di flusso fisiologiche.

Abstract

La metastasi è un processo in cui le cellule tumorali capannone dal tumore primario intravasate vascolare sangue e del sistema linfatico, in tal modo, l'accesso a estravasare e formare una nicchia secondaria. Il stravaso delle cellule tumorali dal sistema vascolare sanguigno può essere studiata utilizzando cellule endoteliali (EC) e cellule tumorali ottenute da linee cellulari differenti. Gli studi iniziali sono stati condotti utilizzando condizioni statiche, ma si è ben documentato che i CE si comportano in modo diverso in condizioni di flusso fisiologiche. Pertanto, diversi gruppi da camera di flusso sono attualmente utilizzate per studiare le interazioni delle cellule cancro con EC. Assemblee camera di flusso attuali offrono risultati riproducibili utilizzando sia linee cellulari diversi o fluido a differenti condizioni di stress di taglio. Tuttavia, per osservare e studiare le interazioni con cellule rare come cellule tumorali circolanti (CTC), sono necessarie alcune modifiche da apportare al gruppo di camera di flusso convenzionale. CTCsono una popolazione di cellule rare tra milioni di cellule del sangue. Di conseguenza, è difficile ottenere una popolazione pura di CTC. Contaminazione delle CTC con diversi tipi di cellule che normalmente si trovano in circolazione è inevitabile utilizzare presente arricchimento o tecniche di esaurimento. Nel presente rapporto, descriviamo un metodo unico per etichette circolanti cellule tumorali della prostata modo fluorescente e studiare le loro interazioni con EC in un sistema di camera di flusso auto-assemblati. Questa tecnica può essere ulteriormente applicato ad osservare le interazioni tra CTC prostata e qualsiasi proteina di interesse.

Introduzione

Metastasi è un complesso processo multi-step che rimane poco conosciuta. L'asse ligando E-selectin/selectin ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella metastasi del tumore promuovendo interazioni adesive principali tra l'endotelio vascolare e cellule tumorali ^1,2. Endoteliale (E)-selectina è una proteina transmembrana espressa dalle cellule endoteliali attivate, mentre differente ligando E-selectina (s) sono espressi dalle cellule tumorali ^3. Numerosi approcci in vitro sono stati impiegati con successo per modellare interazioni ligando E-selectin/selectin tra cellule tumorali e cellule endoteliali (EC) ^1. Per studiare queste interazioni, diversi sistemi di camera di flusso vengono impiegati per simulare sistema vascolare sanguigno. Tra assembly camera di flusso, a piatti paralleli camera di flusso (PPFC) in combinazione con EC è abitualmente utilizzato come modello in vitro simulando in condizioni di stress taglio vivo. In questometodo, EC sono coltivate su un piatto da 35 mm e dopo aver ottenuto un monostrato, EC sono attaccati alla PPFC e gli esperimenti shear stress sulla base vengono eseguite.

Tuttavia, PPFC e altri sistemi attuali presentano molte limitazioni per studiare le interazioni adesive tra cellule tumorali circolanti (CTC) derivate da pazienti e EC, in primo luogo, perché CTC sono una rara popolazione di cellule, versato dal tumore primario, che circola tra milioni di cellule del sangue (1 CTC per 10 ⁹ cellule ematiche) ^4. Quindi, a differenza di fornitura illimitata di linee cellulari in coltura, bassa conta CTC portare ad interazioni molto poche e rare CTC / CE, che richiede un'adeguata larghezza di canale di flusso per registrare le interazioni per l'analisi di riproduzione. Inoltre, dal momento che pazienti CTC derivati ​​sono una popolazione impura, quindi un marcatore di identificazione è necessaria per tenere traccia CTC in specifico. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per identificare il cancro alla prostata (PCA) CTCs approfittando del fatto che la quasi totalità di questi CTC esprimono prostatico specifico antigene di membrana (PSMA) sulla loro superficie cellulare ^5,6. In questa relazione, abbiamo utilizzato la linea di cellule di cancro alla prostata, MDA PCa2b (MDA), per dimostrare la potenziale utilità del nostro nuovo sistema per lo studio della prostata interazioni CTC con EC, alla fine di capire il meccanismo di metastasi.

La nostra metodologia può essere applicata per vari esperimenti di taglio basato simulano nel sistema di vivo vascolare ^7-9. Oltre ad esaminare le interazioni PCa CTC / CE, l'attuale sistema di camera di flusso potrebbe essere facilmente adattato per l'analisi di cellule mononucleari del sangue periferico o interazioni cellule tumorali "con EC. La facilità di smontaggio e rimontaggio della camera di flusso, un MicroSlide III ^(0,1) (in appresso MicroSlide), permette la coltura EC sotto perfusione e stimolante EC con differenti citochine di indurre protein espressione. Inoltre, colta EC, proteine ​​ricombinanti come la P-selectina-E e possono essere rivestiti sul MicroSlide e le interazioni con le cellule tumorali possano essere rispettati in condizioni di flusso laminare ^10.

Protocollo

1. Coltura HUVECs su Microslides per interazioni Observing CTC-endoteliali

1. Sotto il cofano di coltura tissutale, prima sciacquare la MicroSlide, larghezza del canale di 1 mm con PBS. Cappotto delicatamente il MicroSlide con 200 ml di 50 mg / ml fibronectina (sciolto in PBS) usando una siringa Luer-lock da 1 ml.
2. Coprire il MicroSlide con il coperchio e tenerlo all'interno della cappa coltura tissutale per 30 min. Erogazione lenta del liquido nel MicroSlide impedisce la formazione di bolle nel canale.
3. Profumato 200 ml di acqua calda (37 ° C) HUVEC mezzo di crescita (M199 media, 1M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml di eparina, 100 pg / ml di fattore di crescita delle cellule endoteliali, e L-glutammina) sul MicroSlide e incubare per 20 min a RT. Durante la perfusione, preparare la sospensione di cellule HUVEC.
4. Risciacquare HUVECs con PBS e aggiungere 0,05% tripsina-EDTA per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare HUVEC in 2 ml di mezzo di crescita a 180 xg per 5 min.
5. Misurare la concentrazione cellulare utilizzando un neubaUER emocitometro e preparare 10 ⁷ HUVEC cells/100 microlitri mezzo di crescita. Poi, rimuovere con attenzione il mezzo dall'ingresso della MicroSlide utilizzando un puntale di 200 microlitri.
6. Portare il MicroSlide a livello degli occhi e l'utilizzo di un 1 ml siringa Luer-lock, profumato delicatamente 200 ml di concentrazione preparata del HUVECs nel canale. Si richiede cautela in questa fase per evitare la formazione di bolle. Se compaiono le bolle, tenere perfusione per un tempo leggermente più lungo finché le bolle entrano nel canale di uscita.
7. Mettere un volume uguale (~ 80 microlitri) di supporto HUVEC sia l'ingresso e l'uscita del MicroSlide. Ciò impedisce il flusso di celle in entrambe le direzioni.
8. Coprire il vetrino e tenerlo in incubatore (37 ° C) per 1,5 ore.

2. Preparazione della camera di flusso dell'Assemblea per Overnight cultura HUVEC su un MicroSlide

1. Inserire una siringa sterile da 20 ml, connettori maschio e femmina Luer, tubi e una pompa a siringa in incubatrice per 15 kmn.
2. Per volume morto minimo, utilizzare il tubo con diametro interno di 0,04 pollici. Più piccolo diametro del tubo impedisce la formazione di bolle.
3. Riempite la siringa da 20 ml con acqua calda (37 ° C) HUVEC supporto (12 ml). Fissare il tubo con i connettori sulla siringa. Rimuovere le bolle. Collegare questo gruppo alla MicroSlide.
4. Riempire completamente l'ingresso della MicroSlide con i media HUVEC. Portare la siringa preriempita da 20 ml collegata al connettore vicino al MicroSlide. Applicare delicatamente il connettore al MicroSlide.
5. Portare il set-up in incubatrice e collegarlo alla pompa siringa, fissato a 10 ml / min velocità di taglio. Lasciare le cellule O / N in incubatrice a 37 ° C.
6. Il giorno dopo, smontare il set-up rimuovendo il connettore collegato all'ingresso del MicroSlide.
7. Per aumentare l'espressione E-selectina sulle cellule endoteliali, preparare il terreno di coltura fresco contenente IL-1β a 10 ng / ml in 4 ml di media. Aspirare i media in una siringa da 10 ml. Rimuovere tegli materiale dal ingresso del MicroSlide e collegare la siringa al vetrino.
8. Impostare la pompa a siringa 10 ml / min velocità di taglio per 4 ore in incubatrice.

3. Preparazione di Anti-PSMA (J591-488) con etichetta cellule tumorali della prostata

1. Durante l'IL-1β incubazione di HUVECs, preparare anti-PSMA J591-alexa488 etichettati cellule APC. Aggiungere 0,05% tripsina-EDTA a cellule MDA per 1 min. Non esporre le cellule di tripsina per tempi più lunghi in quanto può influenzare i glicopeptidi presenti sulla superficie cellulare. Enzima reagente dissociazione cellulare libero può anche essere usato al posto di tripsina. Centrifugare a 200 xg per 5 min.
2. Risospendere il pellet di cellule MDA in 1 ml di H / H tampone (Hanks salina bilanciata solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl _2). Aggiungi anticorpo J591-alexa488 anti-PSMA a 20 mg / ml per 30 min a RT in un luogo buio. Risospendere le cellule durante l'incubazione.
3. Dopo 30 minuti, centrifugare la soluzione di cellule a 800 xg per 5 min. Aspivotare e risospendere il pellet in 1 ml di tampone H / H. Contare le cellule MDA etichettati e per portare la concentrazione finale di 1x10 ⁶ cellule / ml. Riempire una siringa da 5 ml con J591-488 cellule MDA etichettati e rimuovere le bolle.

4. Preparazione di Anti-PSMA (J591-488) etichetta CTC arricchito da PCa pazienti

1. Raccogliere 7,5 ml di sangue da pazienti affetti da cancro della prostata in un tubo tappo blu (contenente sodio citrato). Diluire delicatamente 1:01 sangue nel 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
2. Aggiungere 5.3 ml di Ficoll-Paque più in una provetta da 50 ml. Strato diluito sangue sopra il Ficoll-Paque. Centrifugare a 400 xg per 30 min.
3. Pre-coat tutti i tubi o punte entrano in contatto con CTC con 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl _2/4 mM MgCl ₂ (buffer R / S) per prevenire il legame non specifico delle CTC alle superfici. Mantenere 4 ° C di temperatura dei media e tamponi che vengono a contatto con CTC.
4. Raccogliere il cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) frazionecontenente CTC dall'interfaccia in un'altra provetta conica da 50 ml contenente 30 ml di tampone di R / S. Centrifugare a 400 xg per 8 min.
5. Risospendere il pellet e lavare di nuovo nel buffer di R / S a 400 xg per 8 min. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in tampone H / H. Aggiungere anti-PSMA J591-488 anticorpo a 20 ug / ml per 30 min a temperatura ambiente in un luogo buio.
6. Dopo 30 minuti, centrifugare le PBMC contenenti J591-488 CTC etichettati a 800 xg per 5 min. Risospendere in tampone H / H. Riempire una siringa da 1 ml (pre-rivestite con tampone R / S) con il campione.

5. Preparazione del microscopio, pompa a siringa e della Camera di flusso Assembly

1. Accendere il microscopio invertito e impostare l'illuminazione Kohler a 10X obiettivo. Portare la pompa a siringa allo stesso livello della fase del campione del microscopio e impostarlo a 1 dyn / cm ² shear stress (~ 10 microlitri / min).
2. Aprire il software Zeiss AxioVision. Selezionare l'obiettivo sullo schermo del computer. Creare un nuovocartella sotto l'opzione strumenti nel software.
3. Aprire l'opzione esperimenti intelligenti in AxioVision e regolare le impostazioni di registrare brevi video di 30 secondi per 30 minuti.
4. Per il video fluorescente dal vivo, impostare le opzioni-12 msec immagine di esposizione, 2 x 2 bin, 5 Gain. Questi parametri aiutano a raggiungere i video vicino al frame rate video (~ 23 fotogrammi al secondo) con la fotocamera Zeiss MRM.
5. Per visualizzare tutta la larghezza del canale di flusso a 10 X obiettivo sullo schermo del computer, utilizzare un adattatore C-mount (0.63 xf/60 mm Interface).
6. Accendere la lampada a mercurio.
7. Porre la siringa e il connettore contenente le cellule sulla pompa siringa.
8. Portare IL-1β stimolato HUVECs dal termostato. Collegare il connettore al canale di ingresso pieno della MicroSlide contenente HUVECs.
9. Collegare il canale di uscita con il connettore collegato al tubo. Mettere il tubo in un piatto o tubo 15 ml conica per raccogliere il flusso attraverso.
10. Avviare il Infusiattraverso il MicroSlide a 10 microlitri / min. Osservare le interazioni tra cellule endoteliali e cellule MDA etichettati o etichettati CTC derivati ​​da pazienti al di sotto del filtro 488 nm sul microscopio a epifluorescenza.
11. Avviare la registrazione l'esperimento come 30 sec brevi video. Durante l'analisi riproduzione, misurare la velocità di rotazione. Velocità di rotazione si misura dividendo la distanza percorsa dalle cellule nel tempo.

6. Immunocolorazione del MicroSlide

1. Rimuovere il supporto dal ingresso e l'uscita del MicroSlide dopo perfusione cellule MDA su IL-1β-stimolata HUVEC per 10 min.
2. Utilizzando una punta di 200 microlitri, mettere calda (37 ° C) PBS contenente calcio e magnesio nella presa del MicroSlide per 5 min. Inclinare il MicroSlide usando il coperchio come un puntello in panchina. Mantenere la MicroSlide in una posizione inclinata per tutte le incubazioni durante immunocolorazione.
3. Fissare HUVECs mediante perfusione caldo 2% di formaldeide in ingresso
4. incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
5. Aggiungere triton X-100 (0,1%) in 5% BSA in PBS per 10 minuti a RT.
6. Risciacquare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Blocco con 5% BSA in PBS per 30 min.
7. Incubare con anticorpo primario di capra anti-VE-caderina (1:100) nel 2,5% BSA O / N a 4 ° C.
8. Il giorno dopo, lavare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Aggiungi asino secondario anti-goat 647 anticorpo per 45 min. Lavare due volte con PBS per 5 min ciascuno.
9. Incubare a RT con umanizzato anticorpo coniugato J591-alexa488 per 1 ora.
10. Lavare due volte con PBS per 5 min ciascuno. Aggiungere DAPI per 5 min. Lavare con acqua distillata per 5 minuti.
11. Aggiungi PBS (o Mowiol per la conservazione a lungo termine). Visualizza la MicroSlide sotto il microscopio confocale.

Risultati

La Figura 1 mostra una cultura O / N di un monostrato di cellule endoteliali sulla MicroSlide. I valori di scala sulla figura 1A mostra che il 100% del MicroSlide è visibile usando obiettivo 5X mentre il 70% è visibile usando un obiettivo 10X (Figura 1B). Per interazioni E-selectina mediata, cellule rotolamento ai bordi non sono considerati che rende più del 70% del MicroSlide disponibile per il video-registrazione e analisi riproduzione. Nella nostra esperienza, ini...

Discussione

A causa del basso numero di CTC tra cellule del sangue, è difficile isolare CTC come una popolazione pura di cellule. Al fine di studiare le interazioni CTC / CE, la popolazione rara e impura delle CTC pone due sfide importanti: a) identificazione di CTC tra le cellule del sangue; b) Osservazione delle interazioni CTC / CE.

Per superare la prima limitazione di identificare CTC prostata tra le cellule del sangue, abbiamo approfittato del fatto che praticamente tut...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02