Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi

Riepilogo

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Abstract

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

Introduzione

Una delle sfide in corso in ingegneria dei tessuti neurali è la creazione di un condotto del nervo (NC) che imita la matrice extracellulare, dove i nervi crescono naturalmente. La ricerca ha dimostrato che le cellule rispondono a diversi fattori nel loro ambiente, tra cui meccanica, topografico, adesivi e segnali chimici ^1-3. Una delle sfide principali in questo settore sta determinando la combinazione appropriata di segnali e fabbricando un sistema in grado di mantenere spunti per un lungo periodo per sostenere la crescita delle cellule ^4. Neuroni periferici sono noti a preferire un substrato morbido, diretto da fibre allineate e rispondere agli fattore di crescita nervoso (NGF) ^5-7. NC che può fornire segnali chimici per settimane hanno dimostrato di fornire una migliore recupero funzionale più vicina a quella di allotrapianti, il gold standard attuale per la riparazione dei nervi ^8,9.

Materiali e metodi di produzione Diversi possono essere utilizzati per produrre meccanica e topograficoAl spunti ^10-13. Spunti meccanici sono inerenti al materiale scelto, rendendo la selezione del materiale appropriato per l'applicazione critica ^1,13. I metodi di produzione per il controllo spunti topografiche includono la separazione di fase, auto-assemblaggio e elettrospinning ^1,13. Per le applicazioni microscala, microfluidica, photopatterning, incisione, liscivie sale, o schiume a gas può essere utilizzato anche ^14-17. Electrospinning è emerso come il modo più popolare per progettare substrati fibrosi per coltura di tessuti grazie alla sua flessibilità e facilità di produzione ^13,18-23. Nanofibre elettrofilate sono fabbricati applicando una tensione elevata ad una soluzione polimerica inducendolo a respingere se stessa e si estendono attraverso una breve distanza per scaricare ^24. Un ponteggio allineato può essere creato raccogliendo le fibre su un mandrino rotante a terra e ponteggi non allineati sono raccolti su una piastra fissa ^25. Segnalazione di adesione può essere ottenuto rivestendo il ponteggio spirito fibrosoh fibronectina o coniugare un peptide adesione, come RGD, per la prima HA elettrospinning ^26.

Segnali chimici, come i fattori di crescita, sono i più difficili da mantenere per lunghi periodi perché hanno bisogno di una fonte per il rilascio controllato. Molti sistemi sono stati tentato di aggiungere rilascio controllato a reti fibrosi elettrofilate con vari livelli di successo. Questi metodi comprendono miscela elettrofilatura, emulsione elettrofilatura, core shell elettrofilatura e proteine ​​coniugazione ^27. Inoltre, elettrofilatura è tradizionalmente fatto in un solvente volatile, che può influenzare la vitalità della proteina ^28, quindi mantenendo bioattività delle proteine ​​deve essere considerato.

Questo approccio affronta specificamente che combina,, segnali chimici e adesivi topografici meccaniche per creare un'impalcatura sintonizzabile per la crescita dei nervi periferici. Meccanica impalcatura è controllata proprio dalla sintesimetacrilato acido ialuronico (HA). I siti methacrylation vengono utilizzati per collegare foto reticolanti reattivi. Il materiale reticolato non è solubile in acqua ed è suddiviso esclusivamente dagli enzimi ^29. La quantità di reticolazione cambia la velocità di degradazione, meccanica ed altre proprietà fisiche del materiale. Utilizzo di HA con il 30% methacrylation, che ha un modulo di elasticità di ~ 500 Pa, crea un substrato morbido che è vicino alla meccanica nativi di tessuto neurale ed è in genere preferito dai neuroni ^26,29. Electrospinning su un mandrino rotante viene utilizzato per creare fibre allineate per una stecca topografica. Utilizzando elettrofilatura con microsfere fornisce segnali chimici all'interno del ponteggio per periodi prolungati. Per supportare microsfere di crescita dei neuriti contenenti NGF sono utilizzati per creare il segnale chimico. Diversamente dalla maggior parte dei materiali elettrofilate HA è solubile in acqua in modo che il NGF non incontra solventi aggressivi durante la produzione. Per aggiungere un segnale di adesivo, la scaffold è rivestito con fibronectina. Il sistema completo contiene tutti e quattro i tipi di segnali sopra descritti: morbide (meccanici) allineati (topografiche) fibre con NGF rilascio microsfere (chimica) rivestito con fibronectina (adesivo). Produzione e collaudo di questo sistema è descritto in questo protocollo.

Il processo inizia con la produzione delle microsfere con acqua-in-olio-in-acqua doppia emulsione. L'emulsione è stabilizzato con un tensioattivo, alcool polivinilico (PVA). La fase acquosa interna contiene la proteina. Come è aggiunto alla fase olio, contenente il materiale delle coperture PLGA disciolto in diclorometano (DCM), il tensioattivo crea una barriera tra le fasi che proteggono la proteina dal DCM. Questa emulsione è più dispersa in un'altra fase acquosa contenente PVA per creare la superficie esterna delle microsfere. L'emulsione stabile viene agitata per consentire al DCM evaporare. Dopo il risciacquo e liofilizzazione si sono lasciati con la microsfere cont seccoaining proteina.

Dopo le microsfere sono completati sono pronti per essere elettrofilate in ponteggi. Per prima cosa preparate la soluzione electrospinning. La viscosità della soluzione è fondamentale per la formazione di fibre corretta. Soluzioni di puro HA non soddisfano questo requisito; PEO viene aggiunto come un polimero portante per consentire electrospinning. Le microsfere vengono aggiunti alla soluzione e elettrofilate conseguente un'impalcatura fibrosa con microsfere distribuiti.

Una volta che la produzione è completa, la proteina deve essere testato per verificarne la fattibilità. A tale scopo, una cellula primaria che risponde a NGF può essere utilizzato. Questo protocollo utilizza dei gangli dorsali (DRG) 8-10 giorni antichi embrioni di pollo. I fasci di cellule vengono seminate su scaffold contenenti microsfere riempite di NGF o quelli che sono vuoti. Se il NGF è ancora vitale si dovrebbe vedere una maggiore crescita dei neuriti sui ponteggi contenenti NGF. Se il NGF non è più praticabile lo faràNon promuovere neuriti per estendere e dovrebbe apparire simile al controllo.

La procedura esatta qui descritta è focalizzata sul sostegno neurale, però, con semplici modifiche al materiale, metodo elettrospinning e proteine ​​del sistema può essere ottimizzato per i vari tipi di cellule e tessuti.

Protocollo

1. Acqua / Olio / Acqua Doppia Emulsione microsfere di produzione

1. Prima preparare 2% e 0,5% w / v soluzioni di alcoli polivinilici (PVA) in acqua deionizzata. Mescolare le soluzioni a 50 ° C fino a chiaro, questo può richiedere diverse ore. Preparare una soluzione al 2% v / v alcool isopropilico in acqua deionizzata.
2. Preparare una soluzione acquosa di proteine ​​idrofila desiderato. La tabella seguente fornisce esempi di formulazioni.

Tabella 1:. Esempio proteine ​​Solutions Le seguenti soluzioni di proteine ​​sono stati inseriti con successo e elettrofilate utilizzando questo protocollo. Altre soluzioni proteiche idrofili possono essere utilizzati come necessario.

3. Mettere 40 ml di soluzione di PVA 0,5% in una provetta da centrifuga da 50 ml e mettere da parte.
4. In una provetta da centrifuga 15 ml sciogliere 300 mg di 65:35poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) in 3 ml di diclorometano. Un miscelatore a vortice può essere utilizzato per accelerare PLGA dissoluzione.
5. Unire 200 ml di soluzione proteica e 4 ml di soluzione di PVA 2%. Versare la miscela proteica nella soluzione PLGA (punto 1.4). Le soluzioni rimarranno per lo più separati.
6. Posizionare il tubo in un bicchiere di acqua ghiacciata. Utilizzando un sonicatore bacchetta a ~ 10 Watt (RMS), agitare la soluzione per alcuni secondi (5-10) fino a una crema uniforme emulsione bianco è creato.
7. Versare l'emulsione nella provetta da 50 ml contenente 0,5% di PVA (passo 1.3). Mescolare la soluzione ad alta velocità su un vortex per ~ 20 sec. La soluzione svilupperà un aspetto torbido.
8. Trasferire l'emulsione in un becher da 200 ml e posto su una piastra di agitazione a 350 rpm per 2 min. Aggiungere 50 ml di 2% di alcool isopropilico per il bicchiere sul piatto mescolare. Lasciare il composto per continuare a mescolare per un minimo di 1 ora per consentire al DCM evaporare e il PLGA per indurire.
9. Trasferimento tegli microsfere soluzione in provette da centrifuga.
10. Centrifugare a 425 xg per 3 min. Le microsfere si raccoglieranno nella parte inferiore del tubo e appaiono bianco. Rimuovere con attenzione il surnatante dal tubo, sopra le microsfere, e conservare in una bottiglia da 500 ml.
11. Sciacquare le microsfere con acqua deionizzata riempiendo il tubo di tre quarti pieno e scuotendola di ridistribuire le microsfere nel liquido.
12. Ripetere i punti 1.10 e 1.11 quattro volte.
13. Dopo l'ultimo risciacquo, rimuovere il supernatante di nuovo e posto in bottiglia da 500 ml con altri campioni. Congelare le microsfere raccolti nella provetta da centrifuga, poi liofilizzare per almeno 24 ore.
14. Visualizza le microsfere al microscopio ottico o con un microscopio elettronico a scansione. Microsfere non più grandi di 60 micron sono per electrospinning efficaci. Se microsfere sono troppo grandi, sonicating o vortexare tempi più lunghi possono essere richiesti al punto 1.6 o 1.7.
15. Conservare le microsfere secche in un -20 ° C freezer.
16. Opzionale: Utilizzare un saggio di proteine, per istruzioni del produttore, per testare la quantità di proteine ​​in bottiglia da 500 ml dal punto 1.10 ^30. Questo è utilizzato per calcolare la percentuale di proteine ​​incapsulato in microsfere, sottraendo la quantità di soluzione da ciò che è stato utilizzato nel processo di produzione.

Nota: Per visualizzare la posizione proteina nel microsfere aggiungere Rodamina 2 mg / ml per la soluzione di PLGA ³¹ e incapsulare una proteina coniugato con FITC Figura 1 mostra un esempio..

2 Electrospinning con microsfere

1. Prima di preparare la soluzione elettrospinning, creare un 0,5% w / v soluzione di fotoiniziatore, in acqua deionizzata sciogliendo a 37 ° C. Questo processo può richiedere diverse ore.
2. Creare un 2% w / v metacrilato acido ialuronico (Meha) (vedi Burdick et al. Per la sintesi) ^{il 29,} 3%w / v 900 kD poli (ossido di etilene) (PEO) e 0.05% w / v soluzione fotoiniziatore in acqua deionizzata.
   1. Calcolare la quantità corretta di Meha e PEO per il volume desiderato. Per esempio, 10 ml di soluzione richiede elettrospinning 200 mg di Meha e 300 mg di PEO.
   2. Sciogliere il PEO in acqua deionizzata al 90% del volume finale desiderato (9 ml per questo esempio). Questo può richiedere diverse ore, un piatto mescolare riscaldato o bagnomaria a 37 ° C possono essere utilizzati per accelerare il processo.
   3. Successivamente aggiungere il Meha e utilizzare un miscelatore vortex per mescolare la soluzione fino a chiaro. Questo richiederà solo pochi minuti.
   4. Infine aggiungere la soluzione fotoiniziatore 0,5% ad occupare il restante 10% del volume (1 ml per questo esempio).
3. Aggiungere microsfere alla concentrazione desiderata fino a 400 mg / ml. Miscelare la soluzione su un vortex fino a quando le microsfere sono distribuiti uniformemente nella soluzione.
4. Trasferire la soluzione in una siringa e attaccare un 6 pollici bl 18 gaugeunt ago punta.
5. Posizionare la siringa in una pompa a siringa e impostarlo per dispensare a 1,2 ml / h.
6. Nastro uno strato di foglio di alluminio sul piatto di raccolta o mandrino. Questo permette una facile pulizia e conservazione del patibolo finito. Un mandrino rotante viene utilizzato per creare fibre allineate. Una lastra piana o mandrino fermo si tradurrà in fibre disposte in modo casuale.
7. Collegare il filo di terra da una fonte di alimentazione ad alta tensione per l'apparato di raccolta. Collegare il conduttore positivo al ago.
8. Regolare la superficie della pompa siringa e la raccolta in modo che vi è di 15 cm tra la punta dell'ago e la superficie di raccolta.
9. Avviare il pompaggio polimero, quando la soluzione è visibile alla fine della siringa, attivare il generatore di tensione e impostare la tensione di 24 kV. ATTENZIONE: Quando la tensione è acceso non toccare alcuna parte metallica del sistema. Carica può anche saltare brevi distanze dalle parti elettrificate per la pelle.
10. Eseguire la soluzione fino a dspessore impalcatura esired è raggiunto. Al termine spegnere fonte di tensione e pompa a siringa.
11. Rimuovere la pellicola con ponteggio allegato. Ponteggi completate contenenti proteine ​​vengono memorizzati in una -20 ° C freezer.

3. proteine ​​Bioattività Testing

1. Preparare delle cellule di coltura. Aggiungere 10% v / v siero fetale bovino, 1% v / v L-glutammina, e 1% v / v penicillina-streptomicina per mezzo di Eagle modificato di Dulbecco.
2. Selezionare i vetrini che si adattano completamente in una piastra ben.
3. Utilizzare 3 (Trimethoxysilyl) propil metacrilato per trattare i coprioggetti come descritto dal produttore. Methacrylation migliora patibolo aderenza ai coprioggetti.
4. Fissare coprioggetti metacrilato alla zona di raccolta del electrospinner con nastro biadesivo rimovibile prima elettrospinning. Spinning sui coprioggetti facilita la gestione e la visualizzazione.
5. Electrospin di spessore desiderato come descritto sopra.
6. Laopo Electrospinning rimuovere con attenzione coprioggetto da mandrino. Posizionare il patibolo vetrini rivestiti in una camera di azoto chiaro e assicurarsi che tutto l'ossigeno viene eliminato.
7. Posizionare la camera e il patibolo sotto di 10 mW / cm ² 365 nm luce per 15 min. Dopo la reticolazione posto in pozzetti di dimensioni appropriate. Assicurarsi che il lato impalcatura è rivolto verso l'alto.
8. Luogo ponteggi sotto una lampada germicida per 30 minuti per sterilizzare. Se fibronectina desiderato o altra proteina viene utilizzato come rivestimento per migliorare l'adesione cellulare. Seguire le istruzioni del produttore per ponteggi cappotto.
9. Raccolta dei gangli dorsali (DRG) come precedentemente descritto da Hollenbeck ^32. Sarà necessario One DRG per ogni ponteggio coperto coprioggetto testato.
10. Mettere 100-200 ml di media su ogni patibolo nella piastra ben. Posizionare con cura un DRG su ogni patibolo nel droplet media. Per ponteggio di spessore possono essere necessari più mezzi di comunicazione; DRG devono essere completamente sommerse e non FLOATing.
11. Incubare l'impalcatura e DRG a 37 ° C per 4 ore per permettere alla cellula di aderire al ponteggio.
12. Riempire i media a livello appropriato per il bene e mettere di nuovo in incubatrice. Continuare l'incubazione per 4-6 giorni.
13. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere con attenzione i media di ogni bene e lavare delicatamente una volta con PBS. Fissare le cellule per 30 minuti con 4% w / v paraformaldeide.
14. Cellule macchia con una macchia anticorpo per neurofilamenti. Questo permetterà la visualizzazione di crescita dei neuriti per la quantificazione. DAPI può anche essere utilizzato per visualizzare nuclei delle cellule. Un esempio di protocollo di colorazione è stato descritto da Sundararaghavan e colleghi ^14.
15. Visualizza le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza.
    1. Posizionare pozzetti sul palco del microscopio.
    2. Individuare la massa cellulare utilizzando le impostazioni del filtro e di eccitazione per DAPI.
    3. Una volta che la cellula è passare il filtro FITC per visualizzare le neuriti estesi. Ucantare la funzione di punto sul microscopio raccogliere e combinare le immagini che necessario per vedere l'intera struttura. Ripetere l'operazione per DAPI, FITC e campo chiaro.

Risultati

Microsfere 50 ± 14 micron di diametro, con un incapsulamento di proteine ​​oltre l'85% sono stati costantemente prodotto e elettrofilate in ponteggi. Dimensione è stata determinata mediante l'imaging campioni di microsfere da tre lotti di produzione separate. Le immagini catturate in cui su un microscopio ottico e lunghezze dove misurata utilizzando software laboratorio commerciale. Figura 1 mostra un istogramma della distribuzione dimensionale. Tasso di incapsulamento è stato testato anc...

Discussione

Molti studi hanno dimostrato che le cellule nervose possono essere diretti da stimoli topografici (allineamento della fibra) e segnali chimici (fattori di crescita) ^{1,2,10,11,35.} Electrospinning è un metodo facile per creare fibre allineate. I fattori di crescita favoriscono la crescita dei nervi, ma al fine di includerli in condotti nervose (NC), è necessario un metodo per rilascio prolungato. Per creare un sistema più robusto con entrambi i segnali, questi due segnali devono essere combinati. Diversi met...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Invitrogen	D1306
Irgacure 2959	BASF	24650-42-8	Protect from light
PEO 900 kDa	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Syringe Pump	KD Scientific	KDS100
Power Source	Gamma High Voltage	ES30P-5W
Motor	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	EXFO	S1000
Needles	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-81
Polyvinyl Alcohol	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Isoporopyl Alcohol	Sigma-Aldrich	I9030-500mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9703-100
BSA-FITC	Sigma-Aldrich	080M7400
β-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	1156-NG
65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)	Sigma-Aldrich	1001554270
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	34856-2L
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientific	1856209
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma-Aldrich	1001558456
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
DMEM	Lonza	12-604F
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Hyclone	SH30256.01
Glutamine	Fisher Scientific	G7513
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4333
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313