Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

Riepilogo

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

Gli studi condotti in Drosophila melanogaster embrioni e larve forniscono informazioni cruciali nei processi di sviluppo, come specifica il destino delle cellule e organogenesi. Immunocolorazione permette la visualizzazione di sviluppare tessuti e organi. Tuttavia, una cuticola protettiva che si forma al termine della embriogenesi impedisce permeazione di anticorpi in embrioni in fase avanzata e larve. Mentre dissezione prima della colorazione viene regolarmente utilizzato per analizzare i tessuti di Drosophila larvali, si rivela inefficiente per alcune analisi, perché i piccoli tessuti possono essere difficili da individuare e isolare. Sonicazione fornisce un'alternativa alla dissezione nei protocolli di immunoistochimica Drosophila larvali. Esso consente una rapida, l'elaborazione simultanea di un gran numero di embrioni in fase avanzata e le larve e mantiene nella morfologia situ. Dopo fissazione in formaldeide, un campione viene sonicato. Campione viene quindi sottoposto ad immunocolorazione con antigene-specifica formica primariaibodies e anticorpi secondari fluorescente di visualizzare tipi di cellule bersaglio e proteine ​​specifiche mediante microscopia a fluorescenza. Durante il processo di sonicazione, il corretto posizionamento di una sonda sonicating sopra il campione, nonché la durata e l'intensità della sonicazione, è critica. Additonal piccole modifiche ai protocolli di immunoistochimica standard possono essere richiesti per le macchie di alta qualità. Per gli anticorpi con basso rapporto segnale rumore, tempi di incubazione più lunghi sono in genere necessari. Come un proof of concept per questo protocollo sonicazione-facilitato, mostriamo immunoistochimiche su tre tipi di tessuto (testicoli, ovaie, e tessuti neurali) ad una serie di stadi di sviluppo.

Introduzione

Embrioni di Drosophila e larve forniscono un ottimo modello per lo studio dei processi di sviluppo in molti organi e tessuti. Imaging delle singole cellule è spesso necessario in questi studi per verificare gli ambienti complessi in cui le cellule si sviluppano. Visualizzazione di cellule nei tessuti può essere realizzato attraverso immunostaining. Ben descritti immunoistochimica esistono protocolli per i tessuti embrionali di Drosophila <17 ore dopo la deposizione delle uova (AEL) ^1-3. Tuttavia, un protettivo forme cuticola verso la fine dell'embriogenesi, impedendo efficace permeazione anticorpo. Così, questi protocolli immunostaining sono inefficienti per l'analisi dei tessuti in embrioni in ritardo-fase e nelle successive fasi di sviluppo larvale (1 ^° instar (L1), 2 ^° instar (L2), e 3 ^° instar (L3)). Questa inefficienza impone un ostacolo alla nostra comprensione dei processi dinamici che si verificano durante il periodo di sviluppo prolungato ^4. Tissue dissezione è una tecnica largamente impiegato per aggirare questa barriera ^5-7. Tuttavia, dissezione può rivelarsi inefficiente. L'estrazione può essere gravato da difficoltà nel trovare o isolare embrionale e tessuti larvali. Inoltre, la rimozione fisica dei tessuti bersaglio può causare danni da loro rottura o omettendo di estrarli nella loro interezza.

La sonicazione è un metodo che impiega onde sonore disturbare interazioni intermolecolari. È stato usato per disturbare l'integrità della cuticola larvale Drosophila per immunostain sviluppare tipi di cellule neurali ^6. Questo protocollo è stato adattato per immunostain ritardo-fase embrionale e larvale gonadi, che può essere piccolo come 50 micron di diametro ^8-10. Attraverso tali studi, il processo di maschio di cellule staminali germinali (GSC) formazione di nicchia è stata caratterizzata nell'ultima fase embrioni di Drosophila ^8-10 e meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule staminali e difdifferenzia- nell'ultima fase gonadi embrionali e le larve sono stati chiariti ^9-12. Così, sonicazione fornisce un'alternativa efficiente per la dissezione dei tessuti che può essere difficile a causa delle dimensioni del tessuto. Inoltre, esso consente immunocolorazione di tessuti di Drosophila in situ, lasciando le cellule nel contesto dell'intero organismo e mantenuto in situ morfologia. Qui, descriviamo un protocollo step-by-step per fluorescenza immunoistochimica di ritardo-fase embrionale attraverso primi tessuti / mid-L3 in situ. Analisi di Drosophila gonadica e neurale tessuto è mostrato nelle Rappresentante dei risultati per dimostrare l'efficacia di questo protocollo. Inoltre, questo protocollo immunostaining può essere adattato ad analizzare altri tessuti di Drosophila così come i tessuti in altri organismi con una cuticola esterna.

Protocollo

1 Preparazione di una gabbia Collection

1. Anestetizzare giovani, mosche fertili con CO _2. Trasferimento mosche anestetizzati ad una gabbia. Per ottenere il rendimento ottimale, utilizzare 100-120 mosche adulte che vanno da 2-7 giorni di età in un rapporto 4: 1 di femmine ai maschi. Consenti mosche un adeguato periodo di acclimatazione, ~ 24 ore prima di ottenere il campione per il fissaggio. Se la gabbia è stato istituito con femmine vergini accoppiato ai maschi, un uso un 36 - periodo di acclimatazione ore 48.
2. Sulla estremità aperta della gabbia, mettere una piastra di agar succo di mela pre-preparata con una goccia monetina imprese di lievito in pasta al centro sopra l'apertura della gabbia. Quindi, fissare con nastro adesivo. Sigillare la giunzione tra la piastra di agar succo di mela e la gabbia con Parafilm.
3. Posizionare la gabbia in un contenitore secondario con succo di mela piastra di agar come la base e consentire in linea di riprodurre ad una temperatura definita per un adeguato periodo di tempo determinato dall'esperimento.
   Nota: i tempi di prelievo dei campioni will variare. Ad esempio, quando si raccolgono fase embrioni fine / inizio larve L1 (17-24 ore), permettono di mosche depongono le uova su piastre di agar succo di mela per 7 ore a 25 ° C prima della maturazione del campione per 17 ore a 25 ° C. Allo stesso modo, per una collezione di metà-fine primo larve instar (36 - 48 ore) permettono le mosche a deporre le uova per 12 ore a 25 ° C prima della maturazione del campione per 36 ore a 25 ° C.
4. Una volta che il periodo di tempo è completa, toccare la gabbia su un tavolo in modo che le mosche cadono lontano dalla piastra di agar succo di mela senza anestesia. Sostituire velocemente la piastra utilizzata con una nuova contenente una goccia di lievito in pasta. Fissare la piastra fresca con nastro adesivo e parafilm e conservare la gabbia con succo di mela piastra di agar come base.
5. Rimuovere con cautela la goccia lievito dalla piastra utilizzato con una spatola metallica. Mettere il coperchio sulla piastra utilizzato succo di mela e consentono di cui gli embrioni di età, se necessario, sperimentalmente.
   Nota: Durante l'invecchiamento dei campioni, le piastre possono essere conservati a 25 ° C a meno che temperature più alte sono Experimentally richiesta. Esempi di come invecchiare embrioni per la raccolta sono descritti in precedenza (vedi nota per la fase 1.3). Rimozione di lievito pasta prima di assaggiare l'invecchiamento viene eseguita per evitare che le larve di eseguire la scansione nel lievito e rompere l'agar sotto. Il restante succo di mela agar e incolla lievito residuo fornire sostanze nutritive per la crescita delle larve. Mentre gli embrioni di cui direttamente nella pasta lievito sono persi attraverso la rimozione lievito in pasta, questa perdita è preferibile lievito e residui di agar nel campione che può ridurre l'efficienza colorazione. Se uno sceglie di non rimuovere la pasta di lievito, lievito può essere liquefatto con tampone fosfato Triton X-100 (PBTx), mescolato con un pennello, e poi rimosso dal campione con un colino cella prima della fissazione.

2 Fissazione

1. Una volta che gli embrioni di cui alla piastra di succo di mela agar sono invecchiati al punto di tempo desiderato, utilizzare un piccolo pennello bagnato con la soluzione tampone fosfato Triton X-100 (PBTx) per rimuovere con attenzione campione dal the piastra.
   Nota: le larve più vecchie sono mobili e possono strisciare sulla parte interna del coperchio. Tale campione può essere raccolto in modo simile con asportazione con un pennello.
2. Pulire il pennello campione di carichi contro la cresta rivolta verso l'interno di un colino cella. Poi, lavare le pareti del filtro e il pennello con un flacone con spruzzatore contenente soluzione PBTx. Mettere un coperchio capsula di Petri sotto il filtro per catturare la soluzione PBTx.
3. Dopo tutto il campione è stato trasferito al colino, versare abbastanza PBTx nel filtro per sollevare il campione fuori dalla rete. Quindi, sollevare il colino e versare il contenuto della capsula di Petri in un contenitore di rifiuti liquidi.
4. Ripetere il punto 2.3 tre volte per rimuovere il lievito e volano rifiuti che possono essere stati trasferiti con il campione.
5. Versare abbastanza 50% di candeggina (ipoclorito di sodio) / acqua (DDH ₂ O) soluzione nel filtro per sollevare le larve fuori dalla rete. Lasciare le larve di sedersi in soluzione per 5 min. Quindi, sollevare il filtro e versare tegli contenuto della capsula di Petri in un contenitore di rifiuti liquidi.
   Nota: Bleach è richiesto solo nei campioni embrionali di età compresa tra 0-22 ore, al fine di rimuovere la membrana coriale. L'applicazione di candeggina per campioni anziani può essere omesso, ma la sua inclusione non è dannosa. Se omissione si desidera, sostituire la candeggina in questa fase con PBTx. Candeggina diluita deve essere utilizzato entro 24 ore di preparazione della soluzione.
6. Lavare campione nel colino con PBTx versando abbastanza PBTx nel filtro per sollevare il campione fuori dalla rete. Lasciare campione di sedersi in soluzione per 3 min. Quindi, sollevare il colino e versare il contenuto della capsula di Petri in un contenitore di rifiuti liquidi.
7. Ripetere il punto 2.6 cinque volte.
8. Tamponare la parte inferiore del filtro cella a secco, poi trasferire campione in una fiala di scintillazione contenente 1,75 ml di soluzione PEMS con un pennello.
9. Lavorare sotto cappa ventilata, aggiungere 250 ml di formaldeide al 37% e 8 ml di eptano grado reagente alla fiala di scintillazione.
   Nota: Formaldeide e eptano sono pericolosi. Per motivi di sicurezza, continuare a lavorare in una cappa ventilata e indossare guanti appropriati per passaggi 2,9-3,3.
10. Lasciare che il flaconcino a scuotere a 200 rpm o una simile velocità moderata per 20 minuti.
11. Aggiungere 10 ml di metanolo a scintillazione fiala senza rimuovere la fase acquosa precedente e consentire il flaconcino a scuotere vigorosamente a 500 rpm per 1 min.
    Nota: Il metanolo è pericoloso. Continuare a lavorare in una cappa ventilata e indossare guanti adeguati.
12. Rimuovere fiala da shaker e versare immediatamente il contenuto in un colino cellule sopra un contenitore di rifiuti liquidi nella cappa. Aggiungi metanolo in più per il flaconcino e correre attraverso il filtro, se necessario, delle cellule al fine di garantire tutti i campioni è stato rimosso.
    Nota: filtri cellula può defluire lentamente. Per ovviare a questo, toccare un tessuto laboratorio al fondo del filtro cella per disegnare la soluzione attraverso il filtro più rapidamente. Metanolo, formaldeide, e eptano dovrebbe essereimmagazzinato in appositi contenitori per rifiuti fino a corretto smaltimento secondo le linee guida istituzionali.
13. Fondo secco di filtro cella utilizzando un tessuto di laboratorio, quindi utilizzare un pennello per il trasferimento del campione catturato nel filtro in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 0,5 ml di metanolo.
    Nota: Se più fiale di scintillazione sono in uso, completare i passaggi 2.12 e 2.13 una fiala alla volta per evitare che si secchi campione su filtri cellulari.
14. Una volta che il campione è stato aggiunto alla provetta, eliminare il metanolo con una pipetta. Garantire campione è depositata sul fondo della provetta.
15. Sciacquare campione nella provetta con l'aggiunta di circa 0,5 ml di metanolo al tubo. Attendere per il campione di risolvere quindi rimuovere il metanolo con una pipetta.
16. Ripetere il passaggio 15 tre volte.
17. Aggiungere 0,5 ml di metanolo al tubo, e poi conservare in freezer a -20 ° C per un uso successivo.

3. reidratazione e preparazione di campioni per Immunostaining

1. Rimuovere metanolo dalla provetta con una pipetta, lasciando il campione nel tubo. Conservare rifiuti metanolo al contenitore rifiuti appropriato fino al momento corretto smaltimento.
   Nota: Per migliorare l'efficienza sonicazione, utilizzano non più di 3 mm di campione stabilirono sul fondo della provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Campione in eccesso può essere trasferita in un tubo separato con una pipetta prima di iniziare la fase di reidratazione sopra. Tagliare la punta della pipetta con una lama di rasoio pulito può essere usato per prevenire l'intasamento della punta della pipetta.
2. Aggiungere 1,0 ml di una soluzione al 50% di metanolo / tampone fosfato Tween (PBTw) al tubo e rock per 3 min.
3. Rimuovere la soluzione di metanolo al contenitore dei rifiuti corretto e risciacquare con 1,0 ml di PBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare il campione di stabilirsi prima svinatura il PBTw con una pipetta.
4. Aggiungere 1,0 ml di albumina sierica bovina / Tampone fosfato Tween (BBTw) mescolare al flaconcino e rock. Dopo 3 minuti su una sedia a dondolo, consentire la sample di stabilirsi e rimuovere il BBTw con pipetta.
5. Ripetere il punto 3.4 due volte avendo cura di rimuovere quanto più BBTw possibile senza perdere campione dopo l'ultimo lavaggio.
6. Aggiungere 0,5 ml di BBTw al tubo e posizionare il tubo in ghiaccio.

4 Sonicazione di Campione

1. Impostare il sonicatore al 10% dell'ampiezza massima e designare un tempo di funzionamento di 2 sec costante sonicazione.
   Nota: Queste impostazioni sono specifiche del sonicatore indicato nei Materiali e attrezzature Tavolo e possono richiedere l'ottimizzazione per i diversi sonicatori.
2. Prima di sonicazione di campione, pulire la sonda sonicatore posizionando la punta della sonda in un tubo da 50 ml riempita con acqua deionizzata e corsa di sonicazione per pulire la sonda. Sonda sonicatore secco con tessuto in laboratorio dopo l'esecuzione.
3. Immergere la sonda nella provetta contenente campione in modo che sia posizionato a circa 3-4 mm sopra il campione e iniziare a sonicazione.
4. Rimuovere il mtubo icrocentrifuge e metterlo in ghiaccio per almeno 30 secondi per dissipare il calore da sonicazione e permettere campione di stabilirsi sul fondo della provetta.
5. Ripetere i punti 4.3 e 4.4, come necessario in base all'età di campione in fase di elaborazione.
   Nota: Per ottimizzare il volume del campione sonicazione, gli embrioni più giovani di 17 ore non richiedono sonicazione, ma quelli tra 17 e 24 ore (fase 17 / early-L1) richiedono due sonications. Larve tra 24 - 36 (inizio / metà-L1), 36 - 48 (metà / fine-L1), 48 - 60 (inizio / metà-L2), 60-72 (metà / fine-L2), 72-84 ( early-L3), 84-96 (inizio / metà-L3), 96-108 (metà / fine-L3) hr richiedono 5, 9, 11, 13, 15, 18, e 22 sonications rispettivamente. Vedere di discussione per ulteriori elaborazioni sui tempi di sonicazione.
6. Sciacquare con 1,0 ml BBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare il campione di stabilirsi prima di trarre fuori BBTw con una pipetta.
7. Aggiungere 1,0 ml di BBTw nel flacone e rock. Dopo 3 minuti a bilanciere, permettono il campione di stabilirsi e rimuovere il BBTw con pipetta.
8. Ripetere il punto 4.7 due volte.

5. Immunostaining

1. Blocco campione con l'aggiunta di 5% di siero normale diluito in BBTw alla provetta. Rimuovere blocco dopo dondolo per 1 ora.
   Nota: Utilizzare siero normale dalla specie in cui si generano gli anticorpi secondari.
2. Diluire gli anticorpi primari di appropriarsi concentrazione di lavoro in 5% di siero normale soluzione / BBTw.
3. Campione di roccia in soluzione anticorpo primario O / N a 4 ° C o per almeno 3 ore a temperatura ambiente (circa 22 ° C.
   Nota: i tempi di incubazione dell'anticorpo e le temperature possono variare. O / N di incubazione a 4 ° C o 3 ore a temperatura ambiente è tipicamente sufficiente. Tuttavia, un periodo di incubazione di due giorni può migliorare la qualità della colorazione, soprattutto con i campioni più grandi o quando si utilizzano anticorpi primari a bassa affinità. Incubazioni più lunghe sono in genere eseguite a 4 ° C. Analoghe considerazioni devono essere effettuate quando si utilizza anticorpi secondari (vedi 5.10).
4. Lasciare che il campione di stabilirsi afondo della provetta per microcentrifuga. Aspirare anticorpi primari con pipetta. Salvare gli anticorpi per il riutilizzo, se desiderato.
5. Sciacquare con 1,0 ml di BBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare campione di stabilirsi prima di trarre fuori BBTw con una pipetta.
6. Aggiungere 1,0 ml di BBTw nel flacone e rock. Dopo 3 minuti sul bilanciere, permettono campione di stabilirsi e rimuovere BBTw con pipetta.
7. Ripetere il punto 5.6 cinque volte.
8. Campione Block con l'aggiunta di 5% di siero normale soluzione / BBTw alla provetta. Rimuovere blocco dopo dondolo per 30 minuti a 1 ora.
   Nota: Questo passaggio di bloccaggio supplementare non è necessario, ma può migliorare la qualità della colorazione degli anticorpi specifici.
9. Diluire anticorpi secondari di appropriarsi concentrazione di lavoro in 5% di siero normale soluzione / BBTw.
10. Avvolgere provetta in un foglio di alluminio per ridurre il deterioramento causato da esposizione alla luce. Campione di roccia in soluzione di anticorpo secondario per 12-48 ore a 4 ° C o per almeno 3 ore a temperatura ambiente (circa 22 ° C.
11. Lasciare campione a stabilirsi al fondo della provetta da microcentrifuga. Aspirare anticorpi secondari con pipetta.
12. Sciacquare con 1,0 ml di PBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare campione di stabilirsi prima svinatura il PBTw con una pipetta.
13. Aggiungere 1,0 ml di PBTw nel flacone e rock. Dopo 5 min a bilanciere, permettono il campione di stabilirsi e rimuovere il PBTw con pipetta.
14. Ripetere il punto 5.13 tre volte.
15. OPTIONAL: Aggiungi DAPI diluito 1: 1000 in PBTw. Campione di roccia avvolta in un foglio di alluminio per 3 min; quindi rimuovere soluzione DAPI con una pipetta. Sciacquare cinque volte con 1,0 ml di PBTw, permettendo campione di stabilirsi prima di rimuovere PBTw con pipetta.
16. Aggiungi 80-100 ml di 1,4-diazabiciclo soluzione [2.2.2] ottano (DABCO) per provetta e conservare a -20 ° C.
    Nota: un altro agente anti-fade base di glicerolo-può essere sostituito.

6 Analisi

1. Prima del campione di montaggio su vetrini, aggiungere un extra di 5-10 ml di DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade soluzione provetta.
   Nota: Il campione può essere aggiunto alle diapositive senza dissezione. Volume del campione aggiunto a una diapositiva varia con le dimensioni coprioggetto. Quando pipettaggio del campione sul vetrino, la punta della pipetta può essere tagliato con una lama di rasoio per evitare campione di taglio. Spesso è utile per allineare campione in file per l'analisi facile. L'aggiunta di PPD come agente antifade aggiuntivo potrebbe non essere necessaria, ma può impedire photobleaching se i campioni vengono conservati a lungo termine.
2. Posizionare delicatamente antiscivolo copertura in vetro sopra del campione. Poi, polizza di copertura sicura in posizione con smalto.
3. Visualizza montato campione utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Risultati

Per dimostrare l'efficacia di immunoistochimica basata sonicazione-analisi di ritardo-fase embrionale e tessuti larvali in situ, wild-type embrioni e larve sono stati trattati per immunoistochimica dei testicoli, ovaie e tessuto neurale. I campioni sono stati ripresi tramite microscopia confocale e risultati rappresentativi sono mostrati (Figura 1 e Figura 2). I risultati rivelano che il protocollo descritto è efficace per la visualizzazione di caratteri morfologici, nonch...

Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo per indirizzare correttamente immunostain Drosophila embrionale e tessuti larvali in situ, eliminando così la necessità di dissezione. Come per i protocolli precedenti per la colorazione embrioni precoci ^1,2,3, la membrana corionica viene rimossa con il 50% di candeggina (NaOCl). I campioni sono fissati in formaldeide e metanolo. Poiché la cuticola larvale provoca campione più vecchio a stare a galla, l'intero campione viene fatto passare attraver...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter