Ultrasound-guided transtoracica intramiocardico iniezione nei topi

Riepilogo

Iniezione percutanea intramiocardico ecocardiografia-guida rappresenta una modalità efficiente, affidabile, e il targeting per la fornitura di agenti di trasferimento di geni o cellule nel cuore murino. Seguendo la procedura descritta in questo protocollo, l'operatore può rapidamente diventare competente in questa versatile tecnica, mini-invasiva.

Abstract

Modelli murini di malattie cardiovascolari sono importanti per lo studio dei meccanismi fisiopatologici e di esplorare potenziali terapie rigenerative. Gli esperimenti che coinvolgono l'iniezione infarto sono attualmente svolte da accesso chirurgico diretto attraverso una toracotomia. Mentre conveniente quando eseguita al momento di un'altra manipolazione sperimentale come legatura dell'arteria coronaria, la necessità di una procedura invasiva consegna intramiocardico limita potenziali disegni sperimentali. Con la sempre migliore risoluzione ultrasuoni e modalità di imaging non invasive avanzate, è ora fattibile per eseguire di routine, iniezione intramiocardico percutanea ecoguidata. Questa modalità efficiente e affidabile fornisce agenti ad una zona mirata di miocardio. I vantaggi di questa tecnica includono la prevenzione di morbilità chirurgica, la possibilità di indirizzare le regioni del miocardio selettivo sotto guida ecografica, e la possibilità di esprimere iniettato al myocardium in più intervalli di tempo predeterminati. Con la tecnica praticata, complicanze da iniezione intramiocardico sono rari, e topi tornare rapidamente alla normale attività sul recupero da anestetico. Seguendo la procedura descritta in questo protocollo, l'operatore con esperienza di base ecocardiografia può rapidamente diventare competente in questa versatile tecnica, mini-invasiva.

Introduzione

Le malattie cardiache sono la principale causa di morte per uomini e donne negli Stati Uniti, che rappresentano 600.000 decessi ogni anno ^1. Modelli murini di malattie cardiovascolari sono di fondamentale importanza per lo studio dei meccanismi fisiopatologici e per esplorare potenziali terapie. Consegna miocardico di vettori di terapia genica, cellule staminali, RNA modificati, e altri agenti terapeutici permessi indagine del loro potenziale terapeutico per le malattie cardiache ^2-7. Attualmente, ci sono opzioni limitate per la consegna del miocardio di agenti terapeutici in modelli murini ^6. Iniezione intramiocardico sotto visualizzazione diretta è comunemente usato, ma richiede una sternotomia o toracotomia ed è limitata alla regione esposta del cuore. Mentre conveniente quando eseguita al momento di un'altra manipolazione sperimentale come LAD legatura, la necessità di una procedura invasiva consegna intramiocardico limita potenziali disegni sperimentali e introduce uneffetti SUPPLEMENTARI dalla procedura (ad esempio, la fibrosi a causa di toracotomia). Consegna pericardico percutanea di vettori virali è stato segnalato, ma il sito e la distribuzione di agente terapeutico non è omogeneo ed è difficile da controllare ^8. Percutanea risultati iniezione coronarici in distribuzione più omogenea del materiale iniettato, ma la consegna coronarica efficiente e riproducibile impugna in modelli murini.

Qui, descriviamo una cassa tecnica di iniezione intramiocardico chiuso che permette minimamente invasiva, operatore controllato il targeting di agenti terapeutici sotto guida ecografica. La tecnica è facile da imparare, evita la necessità di toracotomia o sternotomia e le loro concomitanti complicazioni sperimentali, e offre una maggiore flessibilità sui tempi e siti di iniezione intramiocardico. Così, l'iniezione intramiocardico ecocardiografia assistita rappresenta un metodo tecnicamente semplice e molto efficace di manipolare ilmiocardio in modelli sperimentali murini.

Protocollo

Tutte le operazioni descritte sono state eseguite secondo protocolli approvati dalla cura e l'uso di animali Comitato Istituzionale di Hospital di Boston per bambini.

1 Preparazione

1. Eseguire basale cardiaca valutazione anatomica e funzionale da ecocardiografia prima di iniziare la procedura di iniezione, come il trasduttore di posizione fissa ottimale per l'iniezione intramiocardico non può cedere le viste standard ottimali per delineare l'anatomia e la valutazione della funzione.
2. La messa a punto di iniezione è mostrata nelle figure 1A-1C. Inserire una siringa vuota con un ago inguainato, conici orientato verso l'alto, nel morsetto della siringa (vedere Figura 1C) e fissare la sonda ad ultrasuoni trasduttore nel morsetto scan-testa (vedi Figura 1B). Allentare la scansione testa di bloccaggio della sfera serraggio del giunto (Figura 1B) e modificare l'orientamento del trasduttore in modo che sia allineato parallelamente all'asse dell'ago. Fissare il scan-posizione della testa serrando la palla blocco pinza giunto scan-testa.
   NOTA: Per l'iniezione in topi adulti, un ago da 30 G con un 1 in / 2,5 cm di lunghezza è ottimale. Una siringa da 1 ml può essere utilizzato per volumi maggiori, mentre una siringa a tenuta di gas può essere utilizzato per un controllo più preciso della quantità minori (5-10 microlitri).
3. Applicare il gel per ultrasuoni liberamente alla punta del trasduttore con una spatola per coprire la testa lungo la sua interezza. Sfoderare con attenzione l'ago e utilizzare l'ago di montaggio controlli per far avanzare l'ago direttamente sotto il trasduttore e all'interno del gel per ultrasuoni per la visualizzazione. Fare piccoli aggiustamenti uso del supporto dell'ago in modo che l'ago è visualizzato chiaramente lungo la sua lunghezza l'immagine ad ultrasuoni su. Se il trasduttore è stato correttamente allineato parallelamente l'ago al punto 1.4, quindi l'ago deve rimanere all'interno del piano di imaging come è avanzata e ritirata con la manopola di comando dell'iniezione (Figura 1C).
4. In fasi successive, non disturbare la necessitàle / trasduttore allineamento orizzontale mediante il movimento lungo l'asse orizzontale. Piuttosto, indirizzare specifiche aree del cuore per iniezione modificando l'(asse y) posizione verticale dell'ago montare e spostando la piattaforma animale.
5. Spostare il trasduttore superiormente dalla piattaforma animale con il controllo dell'altezza di scansione (Figura 1B) per consentire la successiva collocazione del topo anestetizzato sulla piattaforma animali. Questo non perturbare l'allineamento asse x del trasduttore all'asse lungo dell'ago.
6. Rimuovere la siringa utilizzata per l'allineamento dal morsetto della siringa e scartare con cura. Caricare il nuovo ago e siringa con l'iniettato al volume di destinazione finale, consentendo spazio morto nella punta della siringa. Fate attenzione a rimuovere le bolle d'aria. Posizionare la siringa nel morsetto della siringa senza regolare l'allineamento asse x. Rientrare completamente la siringa con il controllo dell'iniezione.
   NOTA: Ai fini della formazione iniziale, l'uso di blu di Evancolorante (1%), Trypan macchia blu (0,4%) o una sospensione di microsfere fluorescenti come l'iniettato può aiutare l'operatore a confermare la competenza e il successo di iniezione mirati.

2 Iniezione

1. Accendere la più calda integrato della piattaforma riscaldamento e set per 37 ° C. Posizionare la piattaforma animale 180 ° dal solito orientamento delle immagini, con la fascetta anestesia e testa dell'animale più vicino all'operatore. Questo permette al cuore (nella parte sinistra del torace) sia ipsilaterale al morsetto della siringa e l'ago. Nota: minor senso orario ulteriori aggiustamenti rotazione alla piattaforma animale possono essere necessari per orientare il cuore correttamente per il piano parasternale asse corto di imaging che verrà utilizzato per l'iniezione (Figura 2A).
2. Preparare topi per ecocardiografia come riportato in precedenza ^9. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione con il 2% isoflurano. Rimuovere peli del torace con i capelli crema di rimozione di unD Applicare lubrificante gel per entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione della sclera.
3. Sollevare il trasduttore mediante la scansione di controllo altezza della testa (Figura 1B). Posizionare il mouse supina anestetizzato in cima alla piattaforma animale riscaldato con il muso di un cono consegna 1-3% isoflurano (Figure 2A-2B). Inserire delicatamente una sonda rettale e nastro le quattro zampe agli elettrodi ECG, applicazione di gel per elettrodi per contatto elettrico.
   NOTA: un livello adeguato di anestesia deve essere garantita per il trattamento umano degli animali. Non ci dovrebbe essere alcun cambiamento nella frequenza cardiaca e nessuna risposta per il posizionamento dell'ago attraverso la parete toracica. Controlli di temperatura omeostatici integrati della piattaforma degli animali dovrebbero essere utilizzati per mantenere la normotermia (37 ± 0,5 ° C), come ipotermia si tradurrà in bradicardia relativa, dilatazione ventricolare, ed eventuale disagio.
4. Una volta che il mouse è sicuro sulla piattaforma animali, abbassare il trasduttore sul depilated torace utilizzando la scansione di controllo altezza della testa (Figura 1B). La configurazione ottimale ultrasuoni per l'iniezione è per il cuore di essere visualizzata con l'orientamento asse corto parasternale, secondo la tecnica ecocardiografica standard. Ruotare la piattaforma animale 20-30 ° in senso orario per ottenere la finestra acustica ottimale per l'iniezione nel piano di imaging asse corto (figure 2A-2B). Nota: Alternativamente, l'iniezione può essere eseguita da un orientamento asse lungo parasternale dalla rotazione in senso antiorario della piattaforma animale (Figura 2C).
5. Utilizzare i comandi di regolazione della piattaforma di animali per regolare il campo di vista e di indirizzare ogni sito di iniezione desiderato nel miocardio ventricolare sinistro. Pan avanti e indietro dall'apice alla base del cuore per indirizzare la posizione di iniezione desiderata nel ventricolo sinistro del miocardio (Figure 3A-3C). Nota: La papilla media parasternale asse corto (figura 3A) offre reproduciblE punti di riferimento che permettono followup l'imaging del sito di iniezione. Nota: In alternativa, la vista lunga parasternale asse può essere utilizzato per indirizzare un sito di iniezione predefinito (Figura 3D).
6. Partendo con la siringa nel morsetto della siringa completamente retratto, far avanzare lentamente la siringa verso il petto dell'animale ruotando il comando in senso orario iniezione (Figura 4A). Per consentire la visualizzazione chiara ecografia sia del cuore e la punta dell'ago mentre si avvicina al petto, utilizzare un sacco di gel per ultrasuoni sul lato sinistro del petto e ottimizzare la finestra acustica impostando un ampio campo di vista sui controlli ecocardiografia. Impostare il punto / zona focale presso il sito di destinazione per l'iniezione. Piccoli aggiustamenti al montaggio ago controlli possono ottimizzare l'immagine dell'ago lungo la sua lunghezza.
   NOTA: Alcune macchine ad ultrasuoni hanno una funzione software ago guida per estendere digitalmente una linea lungo l'asse dell'ago attraverso al miocardio bersaglio(Figura 4B). Tale software può essere utile ma non è indispensabile.
7. Con l'animale opportunamente sedato (1-3% isoflurano miscelato con 0,5-0,8 L / min 100% di ossigeno), avanzare l'ago attraverso la parete toracica del mouse e nel miocardio, osservando attentamente la posizione della punta dell'ago smussato affatto volte. Smettere di avanzare quando la punta dell'ago è all'interno del miocardio bersaglio (Figura 4C). Tutta la punta smussata deve essere saldamente all'interno del miocardio, per evitare perdite iniettato nello spazio pericardico.
8. Quando la punta è nella posizione desiderata, consegnare il iniettato spingendo lo stantuffo della siringa. Consegnare l'iniettato lentamente, nell'arco di 5-30 secondi (a seconda del volume di essere consegnati). Fino a 50 ml di dell'iniettato possono essere forniti senza compromettere la funzione ventricolare. Un aspetto echobright transitoria alla regione miocardica iniettata può essere evidente dopo l'iniezione di successo. A breve (secondi) periodo di relativa bradycardia è occasionalmente osservato con iniezione nel miocardio e rapidamente si risolve.
9. Una volta che l'iniettato è stato somministrato, prontamente ritirare l'ago con rotazione in senso antiorario della manopola iniezione. Il mouse deve essere tenuto sotto anestesia per parecchi minuti di osservazione ecocardiografico per confermare la funzione ventricolare preservata e senza complicazioni iatrogeni. Se indicato, più regioni di miocardio possono essere serialmente iniettati riposizionando dell'angolo dell'ago di approccio mediante regolazione della piattaforma animale. Dopo l'iniezione intramiocardico, il mouse viene posizionato in una gabbia da sola e ha permesso di recuperare da anestesia sotto osservazione.
10. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito l'iniezione intramiocardico alla compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. La gabbia deve essere collocato su un blocco termoregolato con ridisposizione ady di acqua e mouse dieta. Disagio iatrogeni non è previsto e il fallimento di riprendere in modo appropriato comportamento normale poco dopo l'intervento suggerisce una potenziale complicazione (vedi discussione).
11. Eliminare attentamente l'ago immediatamente dopo il completamento dell'iniezione intramiocardico per ridurre al minimo il rischio di lesioni diesis all'operatore o agli astanti. Riutilizzo di un ago può provocare ottundimento della punta che rende più difficile per perforare il miocardio e risultante in un più alto rischio di complicanze.

Risultati

Murino iniezione intramiocardico di blu tipo e microsfere fluorescenti

Iniezione di colorante blu di Evan è utile per scopi di formazione. Subito dopo l'iniezione, eutanasia il mouse e rimuovere il cuore per visualizzare la posizione del colorante blu iniettato. Figura 5 mostra un esempio di una iniezione di successo, con colorante blu infiltrante il miocardio a livello muscolare metà papillari (Figura 5A, regione racchiusa dalla linea tratteggiata). Evan...

Discussione

Biologics possono essere consegnati al miocardio mediante iniezione diretta intramiocardico, iniezione intrapericardica, o l'amministrazione indiretta attraverso il flusso sanguigno. Cellulari basato recenti sperimentazioni di terapia in modelli con infarto miocardico hanno descritto un approccio toracotomia aperta per la fornitura di iniettato ^12-14. Un fattore importante per il successo di un intervento terapeutico infarto dipende dalla scelta del percorso di consegna. La dose massima locale del biologi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 ultrasound imaging system	Visualsonics
Vevo Integrated Rail System III	Visualsonics
Microscan MS400 transducer	Visualsonics
Microscan MS550D transducer	Visualsonics
PrecisionGlide needles	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc slip tip syringe	Exel International	26048	or equivalent
Gastight 50 μl glass syringes	Hamilton	1705
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250	or equivalent
Isoflurane	Baxter	AHN3640	or equivalent
Aquasonic 100	Parker Laboratories	(01-08)	or equivalent
Polystyrene microspheres (red fluorescent)	Life Technologies	F-8842	or equivalent