Un metodo di Permeabilization di<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli embrioni per saggi di piccole molecole di attività

Riepilogo

Introduzione di piccole molecole, allo sviluppo di Drosophila embrione offre un grande potenziale per la caratterizzazione dell'attività biologica di nuovi composti, farmaci e tossine, nonché per sondare percorsi di sviluppo fondamentali. I metodi qui descritti delineano misure che superano le barriere naturali di questo approccio, ampliando l'utilità del modello di embrione di Drosophila.

Abstract

L'embrione di Drosophila è stato a lungo un potente modello di laboratorio per chiarire i meccanismi molecolari e genetici che controllano lo sviluppo. La facilità di manipolazioni genetiche con questo modello ha soppiantato approcci farmacologici che sono comuni in altri modelli animali e saggi cellulari. Qui descriviamo i recenti progressi in un protocollo che consente l'applicazione di piccole molecole per la mosca della frutta in via di sviluppo dell'embrione. Il metodo dettagli passi per superare l'impermeabilità del guscio, pur mantenendo la vitalità dell'embrione. Guscio d'uovo permeabilizzazione attraverso una vasta gamma di stadi di sviluppo si ottiene con l'applicazione di una precedentemente descritto d-limonene embrione permeabilizzazione solvente (EPS ¹⁾ e gli embrioni di invecchiamento a temperatura ridotta (18 ° C) prima di trattamenti. Inoltre, l'uso di un colorante rosso lontano (CY5) come indicatore di permeabilizzazione è descritto, che è compatibile con le diverse applicazioni che coinvolgono influenza rosso e verde di seriecoloranti orescent in preparazioni dal vivo e fissi. Questo protocollo è applicabile a studi utilizzando composti bioattivi per sondare meccanismi di sviluppo e per gli studi volti a valutare l'attività teratogena o farmacologica di uncharacterized piccole molecole.

Introduzione

L'embrione Drosophila continua ad essere un modello di primo ministro per studio dei meccanismi fondamentali dello sviluppo ^2. Questo potente modello è supportato da una vasta gamma di strumenti genetici molecolari che permettono manipolazioni essenzialmente qualsiasi gene in qualsiasi punto nel tempo e all'interno di qualsiasi organo in via di sviluppo. Le dimensioni ridotte, rapido sviluppo, e ampia caratterizzazione della morfogenesi di Drosophila ne fanno un modello di scelta per schermi genetici, molti dei quali hanno scoperto percorsi di sviluppo fondamentali ^3,4. Numerosi fenotipi in Drosophila sono stati caratterizzati e sono facilmente interpretabili, spesso fornendo un mezzo per identificare meccanismi genetici molecolari sottostanti responsabili di un tratto anormale.

Storicamente, una lacuna del modello embrione fly è stata la difficoltà di introdurre piccole molecole ai tessuti embrionali. Questo ostacolo ha posto limitazioni: 1) ciing conosciuti piccole molecole bioattive come sonde per interrogare meccanismi di sviluppo e 2) con questo modello istituito per valutare l'attività teratogena o farmacologica di non caratterizzate piccole molecole. Di conseguenza, il potenziale di screening della mosca embrione è stato sufficientemente sfruttato nella caratterizzazione di piccola attività molecola.

Consegna di piccole molecole per la mosca embrione può essere realizzato con due metodi: 1) permeabilizzazione del guscio e 2) microiniezione. Questo articolo presenta anticipi al metodo di permeabilizzazione che sono facili da eseguire nel contesto di un laboratorio tradizionale Drosophila. Va notato che i recenti progressi nei metodi microiniezione con tecnologia microfluidica contribuisce anche ai metodi di introdurre composti al ^5,6 embrione. Introducendo molecole per l'embrione è impedito da uno strato ceroso del guscio ^7. Il guscio Drosophila è costituito da cinque strati. Dal'esterno che sono: la membrana vitellina, lo strato ceroso, lo strato interno corionica, il endochorion e il exochorion ^8. I tre strati corionica esterni possono essere rimossi breve emersione dell'embrione in candeggina diluita, un passo indicato come dechorionation. Lo strato ceroso esposto può essere compromesso dall'esposizione ai solventi organici, come eptano e ottano ^7,9, rendendo l'embrione dechorionated permeabile, mentre rimane racchiusi nella membrana vitellina sottostante. Tuttavia, l'uso di tali solventi introduce complicazioni dovute alla loro tossicità e la difficoltà di regolare la loro forte azione permeabile, entrambi i quali hanno effetti negativi Stark vitalità dell'embrione ^9,10.

Un metodo di permeabilizzazione utilizzando una composizione definita embrione permeabilizzazione solvente (EPS) è stato descritto in precedenza ^1. Questo solvente costituito da d-limonene e tensioattivi di origine vegetale che consentono il solvente sia miscibldi e con tamponi acquosi. La bassa tossicità di d-limonene e la capacità di diluire il solvente a concentrazioni desiderate ha dato un metodo efficace per generare embrioni permeabili con alta vitalità ^1. Tuttavia, due fattori endogeni hanno continuato a portare limitazioni all'applicazione. In primo luogo, gli embrioni dimostrano l'eterogeneità della permeabilità dopo il trattamento EPS, anche se si ha cura di mantenere una stretta messa in scena dello sviluppo. In secondo luogo, gli embrioni più vecchio di circa otto ore hanno dimostrato difficile da permeabilize, coerente con un indurimento del guscio che si verifica dopo la deposizione delle uova ^11.

Descritto qui ci sono progressi nel metodo EPS che: 1) contribuire a individuare e analizzare gli embrioni quasi identico permeabilizzate, anche dopo il fissaggio e di immunoistochimica passi sono stati eseguiti e 2) consentire permeabilizzazione degli embrioni in punti ritardo dello sviluppo tempo (> 8 ore, palcoscenico 12 anni e più). In particolare, l'applicazione di un colorante rosso lontano,Acido carbossilico CY5, è descritto che funge da indicatore permeabilità, che persiste nell'embrione durante lo sviluppo e dopo fissazione con formaldeide. Inoltre, è dimostrato che l'allevamento embrioni a 18 ° C mantiene il guscio in uno stato sensibile EPS, consentendo permeabilizzazione di embrioni fase tardiva (fasi 12-16).

Questi progressi superare i limiti precedentemente menzionati alla metodologia EPS. Questa applicazione sarà quindi fornire agli investigatori un mezzo per introdurre piccole molecole di interesse per l'embrione in diversi momenti dello sviluppo, pur mantenendo la redditività.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Preparazione delle Culture Fly, soluzioni e dispositivi Embryo Handling

1. Preparare una cultura gabbia di Drosophila. Mettere 500 + accoppiamento in linea del ceppo desiderato in una gabbia di popolazione dotata di una piastra di uva-agar 10 centimetri e un po 'di lievito in pasta. Mantenere la cultura in un incubatore controllata di 25 ° C umidità. Nota:   Culture Cage richiedono un giorno o due di condizionamento per ottenere modelli di embrione posa coerenti. Piastre di uva con lievito in pasta vengono cambiati una volta al mattino e una la sera durante il condizionamento.
2. Preparare EPS. Le soluzioni caldi di tensioattivi (cocamide DEA e alcool etossilati) a 37 ° C. Pipettare 18 ml di d-limonene ad una fiala di scintillazione in vetro munito di una piccola ancoretta. Pipettare 1 ml ciascuno dei due tensioattivi (concentrazione finale 5% di ciascuna) al d-limonene. Mescolare accuratamente e rimuovere ancoretta. NOTA: Questa soluzione stock di EPS è un bene per circa 2 mesi a temperatura ambiente. La soluzionedeve essere riscaldato a 37 ° C e agitato in modo da solubilizzare completamente tensioattivi prima dell'uso. EPS e d-limonene devono essere conservati in un contenitore di vetro in quanto saranno sciogliere alcune plastiche nel tempo.
3. Preparare una soluzione embrione dechorionation, medium di incubazione, tintura e soluzioni di droga. Miscelare 25 ml di candeggina con 25 ml di H ₂ O e mettere in un piatto poco profondo. Preparare mezzo modificato di base di incubazione (MBIM) e MBIM-T secondo la prima ricetta ^1,12. Preparare Shields e Sang M3 terreno di coltura cellulare e PBS secondo il protocollo del produttore (vedi Materials List). Preparare soluzione stock di permeabilizzazione colorante a 10 mM di concentramento in DMSO.
4. Montare dispositivi embrione di gestione e forniture:
   1. Preparare dechorionation e cestino trattamento EPS (vedi Figura 1A). Tagliare una sezione di tre centimetri di un usa e getta polipropilene da 50 ml centrifuga / provetta di coltura con una sega a denti fini. Rendere la superficie a filo di saldatura strofinando la sezione del tubo su carta vetrata aderitoad una superficie da banco. Saldare la sezione del tubo di maglia di nylon Nitex fondendo il bordo della sezione di tubo a fuoco e premendo a maglia su una lastra di vetro. Lasciate raffreddare e tagliare a rete supplementare. NOTA: I lati a strapiombo e inferiore consentono un rapido e completo risciacquo di candeggina residua e EPS alle rispettive fasi. Le fasi di saldatura devono essere effettuate sotto una cappa aspirante.
   2. Preparare un cesto di sviluppo. Tagliare porzione superiore di una centrifuga da 50 ml / provetta di coltura a filo con il bordo del tappo. Rimuovere e modificare il tappo tagliando un'apertura centrale e tacche lungo il bordo come mostrato nella Figura 1B. Avvitare il tappo sulla maglia e sui fili della sezione del tubo tagliato e tagliare maglia supplementare. NOTA: Il tappo contiene tacche nel bordo che consente al mezzo di diffusione di massa quando posizionato nel piatto serbatoio 60 mm (Figura 1B ').
   3. Preparare componenti di una camera di scorrimento. Tagliare un quadrato di membrana DO che è maggiore dil'apertura camera di scorrimento. Applicare uno strato molto sottile di grasso per vuoto al labbro interno dell'apertura. Fissare la membrana DO nell'apertura tenuta contro il grasso con l'anello di fermo. Tagliare l'eccesso di membrana DO tagliando di nuovo vicino al l'anello di fermo. NOTA:. Specifiche per la camera di scorrimento si possono trovare in Kiehart et al ¹³ Questa camera non è disponibile in commercio e richiede fabbricazione su misura da un negozio di macchina.

2. Staging, Dechorionation, e trattamento EPS di embrioni

1. Messa in scena embrioni per collezione temporizzata. Impostare un piatto d'uva / lievito fresco alla gabbia cultura mosca al mattino. Consentire embrioni da posare per 1 ora a 25 ° C. Scartare questa piastra e sostituirla con una piastra uva / lievito fresco per una successiva posa embrione di 2 ore a 25 ° C. Raccogliere questa piastra e il luogo in 18 ° C incubatore per ulteriore messa in scena dello sviluppo. NOTA: 1 h di sviluppo a 25 ° C è pari a 2 ore di sviluppoa 18 ° C. L'effetto di invecchiamento a 18 ° C rispetto a 25 ° C sul mantenimento EPS permeabilizzazione embrioni in fase avanzata può essere visto in Figura 2.
2. Dechorionation. Lavare delicatamente gli embrioni fuori del piatto uva nel paniere mesh con 25 ° C acqua di rubinetto e un pennello. Sciacquare lievito in eccesso dagli embrioni nel cestino sotto una leggera corrente di acqua del rubinetto. Immergere il cestello nel 50% di candeggina per 2 min. Lavare gli embrioni accuratamente sotto un getto di acqua del rubinetto. NOTA: spruzzare delicatamente soluzione di candeggina sulle embrioni intermittenza con una pipetta di plastica. Mentre 2 min è solitamente sufficiente per una completa dechorionation, questo tempo di incubazione deve essere controllato da un esame diretto e adeguato di conseguenza. Mantenere gli embrioni dechorionated nel paniere immerso in acqua di rubinetto e procedere immediatamente alla fase EPS.
3. Trattamento EPS
   1. Preparare sei piatti 60 millimetri con circa 10 ml di PBS in ciascuna. Preparare la diluizione EPS sciogliendo 75 microlitri EPS a 2.925 ml MBIM (01:40) in un bicchiere da 50 ml in vetro con vorticoso. Nota: Una forma di emulsione bianchi di questa miscela.
   2. Tamponare l'acqua in eccesso dal fondo del cestello in rete con un laboratorio pulire. Immergere basket in EPS diluiti in coppa e immediatamente agitare per disperdere gli embrioni nella soluzione EPS nel fondo del cestello. Continua vorticoso movimento per 30 sec. NOTA: EPS diluizioni e tempi di esposizione possono essere variate per controllare la permeabilità. Si raccomanda che ottimali EPS diluizioni e tempi di trattamento stabiliti empiricamente con i ceppi di mosche in uso. Aumentare il tempo di esposizione di 60-90 secondi è favorevole per la fase 12 ed embrioni anziani.
   3. Rimuovere cestino, asciugare lontano eccesso EPS con un laboratorio pulire. Procedere con sei lavaggi sequenziali in 10 ml di PBS nei piatti 60 millimetri. Utilizzare una pipetta di plastica a schizzare delicatamente gli embrioni con PBS in ciascuna delle sei lavaggi. Procedere per tingere e fasi di trattamento della droga. Nota: EPS possono essere smaltiti nel lavandino.

3. Dye and Drug trattamento di permeabilizzate embrioni

1. Dye Trattamento
   1. Aggiungere 5 ml di 10 mM CY5 carbossilico acido colorante * a 1 ml di MBIM-T (50 mM concentrazione finale) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e agitare per miscelare. NOTA: * La scelta di colorante dipende l'analisi a valle. L'acido carbossilico CY5 è efficace per le successive analisi che utilizzano la fissazione e immunoistochimica. Rodamina B è utile per l'analisi di embrioni viventi. L'emissione rossa di rodamina B, e l'emissione verde dei suoi metaboliti ^1, possono presentare alcune complicazioni con applicazioni a valle che utilizzano la fluorescenza. Farmaco o tossina possono essere aggiunti alla soluzione colorante di iniziare il trattamento, in questa fase, o limitare il trattamento farmaco / tossina di un impulso in questa fase. Si deve prestare attenzione per gestire e smaltire farmaci e tossine in base alle scheda di sicurezza e gli standard di sicurezza ambientale.
   2. Trasferire embrioni dal cestello a rete per la soluzione colorante con un pennello. Chiudere la provetta e invertire ripetutamente per assicurare laembrioni fluttuare liberamente in sospensione nella soluzione colorante. Mettere tubo su una sedia a dondolo oscillante per 15 minuti a temperatura ambiente.
   3. Rimuovere il tubo da nutator e lasciare che gli embrioni si depositano. Rimuovere la soluzione colorante con un bel pipetta e sostituirlo con 1 ml di MBIM-T da lavare. Capovolgere il tubo di ri-sospendere completamente embrioni. Lasciate embrioni stabilirsi e ripetere con più di tre lavaggi MBIM-T. Rimuovere tutti MBIM-T da risciacquo finale e procedere alla fase di incubazione.
2. Incubazione per lo sviluppo dell'embrione
   1. Trasferire embrioni ad una delle due camere: Il cestino sviluppo o della camera di scorrimento. NOTA: Il cestino di sviluppo è preferito per lunghi periodi di sviluppo, ed è necessaria se le successive fasi di fissazione e di immunoistochimica devono essere eseguiti. La camera di scorrimento è ottimale per una maggiore risoluzione time-lapse imaging ed è più efficace per brevi periodi di sviluppo (ad esempio, gli eventi precoci embrionali). Farmaco o tossina possono essere aggiunti al mezzo a varie concentrazioni e embrione dviluppo può essere monitorato in tempo reale con embrioni vivi o su un endpoint mediante fissaggio standard ed immunoistochimica protocolli.
   2. Sviluppo in cestini
      1. Pulire un cesto di sviluppo spruzzando con il 70% di etanolo, sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata e asciugare con il laboratorio pulire. Preparare 6 ml di medium di incubazione con concentrazione desiderata di farmaco o tossina. Posizionare il cestello sviluppo in media 60 millimetri di presa piatto attenzione a non intrappolare bolle d'aria sotto la base della maglia. NOTA: Due supporti sono comunemente utilizzati: solo MBIM, o MBIM/M3 in una miscela 50:50, quest'ultimo è più efficace per periodi più lunghi di sviluppo.
      2. Trasferire gli embrioni permeabilizzate ad ingranare superficie di base del paniere con un pennello. Spruzzare delicatamente gli embrioni con i media dal serbatoio circostante. Disperdere gli embrioni con il pennello in modo che siano in un monostrato sulla mesh. Nota: Procedere con immagini di microscopia e valutare permeabilizzazione e vitalità caratteristiche del preparation (vedi punto 4).
   3. Sviluppo alla Camera diapositive
      1. Invertire camera di scorrimento e applicare una piccola quantità di grasso per vuoto sul perimetro dell'apertura. Porre 150 ml di terreno con la quantità desiderata di farmaco o tossina sulla superficie della membrana DO all'interno dell'apertura. NOTA: Due supporti sono comunemente utilizzati: solo MBIM, o MBIM/M3 in una miscela 50:50, quest'ultimo è più efficace per periodi più lunghi di sviluppo.
      2. Trasferire gli embrioni permeabilizzate al calo di media con un pennello. Disperdere gli embrioni che li depositano sulla membrana all'interno della goccia.
      3. Coprire delicatamente un coprioggetto circolare di 25 mm l'apertura appiattendo così il mezzo. Premere delicatamente verso il basso lungo il perimetro del vetrino per formare un sigillo con il grasso. Nota: Procedere alla microscopia imaging per valutare la permeabilizzazione e vitalità caratteristiche della preparazione (vedi punto 4).

4. Identizione di permeabilizzate embrioni vitali

1. Identificare gli embrioni permeabilizzate. Osservare gli embrioni sotto epifluorescenza con un microscopio equipaggiato con una fotocamera digitale. Acquisire le immagini (in lunghezza d'onda blu per determinare il profilo tuorlo autofluorescenza) di diversi campi utilizzando microscopio fisso e le impostazioni della fotocamera.
2. Determinare permeabilizzazione di embrioni basato sull'intensità di fluorescenza relativa. Utilizzare uno stereomicroscopio con una grande distanza di lavoro per accogliere il carrello e consentire manipolazioni degli embrioni. Il microscopio deve essere dotato di una fase programmabile XYZ, illuminazione epifluorescenza e una fotocamera digitale. Immagine embrioni avendo cura di registrare l'esposizione e parametri di posizione fase di ogni immagine embrione per consentire la rivalutazione degli stessi embrioni in un punto secondo momento (vedi risultato rappresentativo in figura 3). Nota: Modelli di colorante assorbimento varieranno a seconda del colorante usato, durata dell'esposizione e dell'età embrione. Una vasta gammadell'assorbimento colorante attraverso una singola preparazione è tipica e riflette la variazione nel grado di permeabilizzazione.
3. Identificare gli embrioni vitali. Dopo posizione di embrioni permeabilizzate marcatura, proseguire con lo sviluppo dell'embrione a temperatura ambiente oa 25 ° C. Ritorno cestino o camera diapositiva per il microscopio. Osservare in fluorescenza blu canale e acquisire l'immagine di tuorlo autofluorescenza in embrioni permeabilizzate precedentemente identificati. Valutare la vitalità secondo la normale progressione di distribuzione tuorlo (vedi Rand et al. ¹ e risultati rappresentativi in Figura 3). Nota: Altre caratteristiche morfologiche dell'embrione osservato con microscopia brightfield possono essere usate per valutare la vitalità. Si raccomanda di stabilire il livello di permeabilità che è compatibile con la redditività essere determinata empiricamente con ciascun colorante e lo sforzo di volare utilizzato.
4. Valutare droga o tossina effetti embrioni vitali permeabilizzate.
5. EMBRIONI proceduressed con il protocollo di cui sopra sono pronti per un numero di convenzionali analisi successive esposizione ai farmaci o tossine. Molti dei vari tipi di analisi sono considerati nella discussione qui sotto e comprendono l'osservazione diretta della morfogenesi in embrioni vivi, così come le analisi post-fissazione immunoistochimica. Entrambi questi approcci sono arricchiti con l'uso di coloranti vitali (ad esempio, GFP) che rivelano pattern di espressione genica e la linea cellulare e profili morfologia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Dispositivi di manipolazione degli embrioni sono raffigurati nella figura 1 per aiutare a visualizzare i dispositivi "fatti in casa" per la manipolazione nei protocolli di cui sopra. Risultati visto in Figura 2 illustrano l'effetto robusto di allevamento embrioni a 18 ° C sulla loro capacità di essere permeabilizzate da EPS in fase avanzata di sviluppo. Questa condizione è applicata nella fase protocollo 2.1. Efficacia dell'acido carbossilico colorante CY5 per rivel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Il metodo di cui sopra delinea un mezzo per ottenere embrioni di Drosophila vitali che sono accessibili ai piccoli trattamenti molecola attraverso una vasta gamma di sviluppo. Questo metodo presenta il romanzo e semplice constatazione che l'invecchiamento embrioni a 18 ° C permette di permeabilizzazione di embrioni in fase avanzata con la stessa efficacia, come visto in precedenza solo negli embrioni in fase iniziale. Inoltre, l'uso del colorante CY5 acido carbossilico lontano rosso come indicatore di ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Cage	Flystuff.com	59-101	http://flystuff.com/general.php
Cocamide DEA [Ninol 11-CM]	Stepan Chemical	call for special order	http://www.stepan.com/
Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]	Stepan Chemical	call for special order	http://www.stepan.com/
d-limonene (Ultra high purity grade)	Florida Chemical Co.	call for special order	http://www.floridachemical.com/
Sodium hypochlorite	Fisher	SS290-4	http://www.fishersci.com/
Tween-20	Fisher	BP337	http://www.fishersci.com/
PBS powder	Sigma	56064C	http://www.sigmaaldrich.com/
Rhodamine B	Sigma	R6626	http://www.sigmaaldrich.com/
CY5 carboxylic acid	Lumiprobe	#23090	http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid
DMSO	Sigma	472310-100	http://www.sigmaaldrich.com/
Shields and Sang M3 medium	Sigma	S8398	http://www.sigmaaldrich.com/
Nitex Nylon mesh	Flystuff.com	57-102	http://flystuff.com/misc.php
Dissolved oxygen (DO) membrane	YSI	#5793	http://www.ysireagents.com/search.php
25 mm circular no.1 cover slip	VWR	48380-080	https://us.vwr.com/
Grape-agar plate mix	Flystuff.com	47-102	http://flystuff.com/media.php
Nutator	VWR	82007-202	https://us.vwr.com/