Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna

Riepilogo

Un vortice microfluidica piattaforma elettroporazione assistito è stato sviluppato per la consegna sequenziale di più molecole in popolazioni di cellule identiche, con un controllo preciso e indipendente il dosaggio. Formato basato fase di purificazione delle cellule bersaglio precedente elettroporazione del sistema aiutato a migliorare l'efficienza di consegna molecolare e la vitalità cellulare trasformati.

Abstract

Elettroporazione ha ricevuto crescente attenzione negli ultimi anni, perché è una tecnica molto potente per introdurre fisicamente non permeanti sonde molecolari esogeni in cellule. Questo lavoro riporta una piattaforma elettroporazione microfluidica in grado di effettuare la consegna molecola multiplo per cellule di mammifero con un controllo preciso e molecolare-dipendente parametro. La capacità del sistema di isolare le cellule con distribuzione di dimensione uniforme permette per meno variazione di efficienza elettroporazione per data intensità di campo elettrico; quindi una maggiore redditività del campione. Inoltre, la sua funzione di visualizzazione di processo consente di osservazione del processo di assorbimento molecolare fluorescente in tempo reale, che permette rapide regolazioni dei parametri consegna molecolari in situ per il miglioramento dell'efficienza. Per mostrare le vaste funzionalità della piattaforma segnalati, macromolecole con diverse dimensioni e cariche elettriche (ad esempio, Destrano con MW di 3.000 e 70.000 Da) sono staticonsegnato alle cellule del cancro al seno metastatico con elevate efficienze di consegna (> 70%) per tutte le molecole testate. La piattaforma sviluppata ha dimostrato il suo potenziale per l'uso nella espansione dei campi di ricerca in cui on-chip tecniche di elettroporazione può essere utile.

Introduzione

Negli ultimi anni, l'uso di impulsi elettrici per facilitare l'erogazione citosolico di molecole extracellulari è diventato un dispositivo interessante per manipolare cellule di mammifero. ¹ Questo processo, noto anche come elettroporazione, permeabilizes reversibilmente la membrana cellulare, permettendo membrana intrinsecamente molecole impermeabili per accedere di ambiente intracellulare delle cellule. Perché praticamente qualsiasi molecola può essere introdotto nel citoplasma tramite i pori temporanei creati nella membrana di qualsiasi tipo di celle utilizzando elettroporazione, la tecnica è stata segnalata come più riproducibile, universalmente applicabile, e più efficiente rispetto ad altri metodi, tra cui virus-mediata, chimica e gli approcci ottici. ^2-3 Questa tecnica è stata utilizzata per introdurre molecole fluorescenti, ⁴ farmaci ⁵ e acidi nucleici ^6-7, mantenendo le cellule vitali e intatto. Alla luce di questi vantaggi, l'elettroporazione è stato adottato come un lavoro comunetorio tecnica per la trasfezione del DNA, in vivo terapia genica ⁸ e studi di vaccinazione cella. E ', tuttavia, ancora difficile per i sistemi di elettroporazione convenzionali per ottenere contemporaneamente l'efficienza pratica e la redditività per i campioni con grande eterogeneità in termini di dimensioni, perché la forza del campo elettrico necessario per l'elettroporazione di successo è strettamente correlata con il diametro della cellula. Inoltre, tali sistemi non consentono un controllo preciso delle somme molecolari multipli consegnato a causa di affidamento sulle bulk processo stocastico consegna molecolare. ⁹ Al fine di risolvere questi problemi, molti gruppi hanno sviluppato piattaforme di elettroporazione microfluidica, offrendo il vantaggio di tensioni poration inferiori, migliore efficienza di trasfezione, una forte riduzione della mortalità delle cellule, e la capacità di fornire più molecole. ^10-13 Tali vantaggi sono stati resi possibili grazie alle piccole orme dei sistemi di elettroporazione microscala il cui elettrodo passolunghezze sono sub-millimetri, drammaticamente diminuendo le tensioni necessarie per la consegna di successo. Inoltre, questi sistemi di elettroporazione microscala possono raggiungere una distribuzione uniforme del campo elettrico e rapidamente dissipare il calore generato, producendo una ridotta mortalità cellulare, migliorando l'efficienza di consegna. L'utilizzo di materiali trasparenti per questi microchip ulteriori permette osservazione in situ del processo di elettroporazione per la modifica dei parametri del prompt. ^2,12 Tuttavia, il controllo preciso dosaggio e controllo molecular- e cellulare-dipendenti dei parametri, necessari per la ricerca e le applicazioni terapeutiche, ^{6 emergenti, 14-16} rimangono ancora irrisolti.

Questo lavoro presenta un sistema di elettroporazione microfluidica vortice assistita, in grado di erogare più molecole sequenzialmente in una popolazione preselezionata identica di cellule bersaglio. Celle con distribuzione granulometrica uniforme sono isolati prima di elettroporazione utilizzando riportato in precedenza SImeccanismo ze-selettivi di cattura. ^17-18 Avendo una distribuzione uniforme dimensioni, meno variazione di efficienza elettroporazione e una maggiore redditività per data intensità di campo elettrico sono stati raggiunti. ¹⁹ Inoltre, agitando continuamente cellule intrappolate utilizzando vortici microscala permesso per la consegna uniforme di molecole attraverso la intero citosol, in accordo con i risultati riportati in precedenza con un'altra piattaforma elettroporazione vortice-assistita. ²⁰ Per dimostrare che questo sistema sarebbe applicabile a una vasta gamma di molecole comunemente utilizzati in applicazioni biologiche, macromolecole con una vasta gamma di pesi molecolari sono state consegnate a cellule del carcinoma mammario metastatico. Inoltre, con l'aiuto di monitoraggio del processo in tempo reale, questo lavoro fornisce ulteriori prove per mettere fine al lungo dibattito in piedi per quanto riguarda il meccanismo di consegna molecolare durante electrporation, essendo prevalentemente elettroforesi-mediata contro la diffusione mediata. ¹⁴ A differenza di altri sistemi di elettroporazione, questa piattaforma offre unicamente i vantaggi combinati di preciso consegna multi-molecola, ad alta efficienza di consegna molecolare, mortalità cellulare minimale, per un'ampia gamma di dimensioni e accuse di molecole consegnato, così come la visualizzazione in tempo reale della elettroporazione processo. Date queste funzionalità, il sistema di elettroporazione sviluppato ha un potenziale pratico come uno strumento versatile per gli studi di riprogrammazione cellulare, applicazioni di consegna della droga ^{6,14,21-22 10,19} e le applicazioni che richiedono per la comprensione approfondita dei meccanismi di erogazione di elettroporazione molecolari.

Protocollo

1 Cella Preparazione

1. Tavola 1 × 10 ⁵ cellule / ml di metastatico linea di cellule di cancro al seno MDA-MB-231 in un volume di 10 ml per tessuti pallone di coltura T75 a Leibovitz L-15 Medium supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 1 % di penicillina-streptomicina.
2. Incubare MDA-MB-231 cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C con 0% di CO ₂ ambiente.
3. Celle di raccolta per esperimenti di 2 giorni dopo la semina trattando le cellule con il 0,25% tripsina-EDTA per 2 min e inattivano l'attività enzimatica di tripsina con l'aggiunta di 8 ml di terreno di coltura.
4. Cellule pellet di centrifugazione per 5 minuti a 200 × g e risospendere in tampone fosfato di Dulbecco (DPBS, 1x senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} ad una concentrazione finale di 5 × 10 ⁵ cellule / ml.

2. Dispositivo progettazione e fabbricazione

NOTA: La maschera, invenzioni stampo master e ilprocesso di inclusione a microcanali devono essere condotte all'interno di una stanza pulita mentre il polidimetilsilossano (PDMS) processo di fusione a microcanali può essere eseguito su un normale banco di laboratorio.

1. Progettare un dispositivo di microfluidica, come illustrato nella figura 1 con AutoCAD. Il dispositivo deve essere composto da un ingresso con porte multiple di iniezione, filtri grossolani e due inerziali concentrandosi canali rettangolari parallele (L = 7 mm, L = 40 micron, e H = 70 micron). Canale rettilineo individuale si compone di 5 camere di elettroporazione, che sono posti a 800 micron a parte (W _C = 400 micron), con due fori per il tramite elettrodi di alluminio. Due camere elettroporazione trasversalmente adiacenti condividono il foro per l'elettrodo negativo. Due canali semplici si fondono in una presa a valle della regione elettroporazione.
2. Convertire il file CAD con micro-modelli in un file GDSII utilizzando LinkCAD. Scrivere le micro-pattern su un 5 "x 5" fotomaschera vuotoutilizzando uno scrittore maschera laser. Sviluppare la maschera seguendo il protocollo del produttore. NOTA: Il processo di sviluppo di fotoresist maschera comprende sviluppo, cromo incisione e resistere rimozione. In alternativa, micro-disegni stampati su una elevata trasparenza risoluzione (> 20.000 dpi) può essere acquistato da un produttore di terze parti e utilizzato come fotomaschera. Caratteristiche microscala finale su una fotomaschera devono essere trasparenti per abbinare la polarità di un photoresist negativo.
3. Realizzare lo stampo colata del disegno dispositivo utilizzando tecniche di litografia soffice standard di ²³ con un cappotto photoresist negativo filata su un wafer di silicio da 4 pollici a 2.000 giri per avere lo spessore finale di 70 micron.
4. Precottura il wafer con photoresist negativo per 20 min a 95 ° C.
5. Contatta l'maschera con la cialda ed esporre ad una sorgente UV (17,4 mJ / cm ²⁾ per 80 secondi usando un allineatore maschera.
6. Sviluppare il wafer esposto per 4 min in uno sviluppatore SU-8.
7. Misurare ilspessore fotoresist sviluppato utilizzando un profilometro di superficie.
8. Rigorosamente mescolare un rapporto 10: 1 di elastomero di agente (kit elastomero di silicone) curare e versare il composto nello stampo di fusione per generare repliche PDMS. Degasare il elastomero casting per 30 min e curare lo stampo di colata con elastomero degasata in stufa a 70 ° C per 2 ore.
9. Sfalda curato replica PDMS con modelli a microcanali dallo stampo e punzonatura fori per insenature, outlet e elettrodi inserimenti utilizzando una morsa pin. NOTA: Il normale diametro tagliente della morsa perno dovrebbe essere 0,76 millimetri, sufficiente per ben tenendo tubo PEEK (OD di 1/32 ") ed elettrodi di alluminio (OD di 0,029") al posto.
10. Creare canali microfluidici racchiuso da incollaggio PDMS repliche di un vetrino trattato in un pulitore di ossigeno-plasma per 7 secondi ad una frequenza radio di potenza e pressione parziale di ossigeno di 75 W e 500 mTorr rispettivamente.

3. Esperimenti di flusso

1. Inseriscielettrodi di alluminio (0.029 "OD) e di un tubo di uscita PEEK (1/32" OD) in luoghi designati attraverso fori nei microcanali (vedi Figura 3B).
2. Collegare l'apparecchiatura elettrica ¹⁸ responsabili per la generazione di alta tensione impulsi di breve onda quadra agli elettrodi di alluminio (vedi Figura 3C) che sono a contatto con soluzioni che scorre nello stampo PDMS. NOTA: L'apparecchiatura deve essere costituito da un generatore di impulsi e di un amplificatore ad alta tensione in-casa costruita ^18.
3. Preparare quattro 50 ml provette contenenti singolarmente DPBS, soluzioni con le cellule e biomolecole, e collegare ogni tubo al suo rispettivo titolare flaconcino collegato al sistema di controllo di flusso pneumatico (Figura 3A). ¹⁸
4. Collegare il tubo PEEK ingresso dai titolari delle fiale nei rispettivi fori di ingresso del dispositivo di microfluidica.
5. Impostare l'ampiezza di impulsi ad onda quadra, V a 100 V per avere la fie elettricoforza ld, E = V / L _e, attraverso la camera di elettroporazione essere equivalente a 0,7 kV / cm. NOTA: Qui, L _e è la distanza tra due punti in cui gli elettrodi positivi e negativi sono in contatto con la soluzione scorrevole (vedi Figura 1).
6. Impostare il regolatore di pressione a 40 psi. NOTA:. Una singola fonte di azoto regolabile manualmente viene utilizzata per pressurizzare in modo uniforme tutti i vial di campioni e di un collettore ad alta velocità è utilizzata per attivare tempestivamente porte di soluzioni individuali utilizzando il software LabVIEW custom-built ¹⁸
7. Per il controllo della valvola, aprire il software LabVIEW custom-built marcato Valve Runner, e fare clic su Esegui dal menu a discesa dal titolo operano.
8. Attivare le valvole facendo clic su ciascuna icona valvola corrispondente. NOTA: L'icona valvola dovrebbe diventare verde quando viene attivata. Facendo clic sull'icona attiva si disattiva e chiudere la valvola. L'icona valvola chiusa dovrebbe diventare grigio.
9. Aprire la valvola per il serbatoio DPBS (cioè., soluzione di lavaggio) per innescare la velocità di flusso necessario per la generazione di vortice cella-trapping stabile per 1,5 min.
10. Passare il porto soluzione attiva dalla soluzione di lavaggio alla soluzione cella per intrappolare le cellule nella camera di elettroporazione per 30 sec (cioè, la fase cellula-trapping).
11. Flusso entrambe le soluzioni di lavaggio e di cella attraverso il dispositivo contemporaneamente per 10 secondi prima della fase cellula-trapping per garantire flusso undisrupted durante la fase di soluzione di commutazione. NOTA: Questa breve fase di co-flusso dovrebbe essere ripetuto ad ogni passo-soluzione di commutazione.
12. Accendere il porto di lavaggio e lavare il dispositivo per 20 secondi al fine di rimuovere le cellule contaminanti non intrappolati.
13. Iniettare la soluzione contenente la prima molecola di interesse (0,2 mg / ml di 3.000 Da molecole di destrano neutro e anionico o 1,5 mg / ml di 70.000 Da molecola destrano neutro) nel dispositivo.
14. Applicare cinque impulsi brevi (Dt = 30 msec, con intervalli di 2 sec) subito dopo l'iniezione delsoluzione molecolare e monitorare l'entità e la durata degli impulsi elettrici applicati in tempo reale con un oscilloscopio.
15. Ripetere passo 3.10 tante volte quanto il numero di molecole aggiuntive da consegnare. Per ogni consegna molecolare, incubare le cellule per 100 s nella soluzione molecolare poi sciacquare il dispositivo con la soluzione di lavaggio per 100 s per rimuovere le molecole in eccesso.
16. Rilasciare le cellule in una piastra a 96 pozzetti per l'analisi a valle abbassando la pressione di esercizio inferiore a 5 psi. NOTA: Circa 100 ml di soluzione con 100 cellule sono raccolti da ogni release.
17. Eseguire sperimentale passi 3.9 tramite 3.16 tre volte a raccogliere abbastanza cellule per citometria a flusso.
18. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti contenenti cellule lavorati per 5 min a 228 × g.
19. Rimuovere il surnatante che contiene molecole fluorescenti in eccesso.
20. Risospendere le cellule in DPBS per citometria a flusso.
21. Le celle di carico nel citometro a flusso per u molecolareptake analisi di efficienza.

Risultati

Il elettroporatore microfluidica parallelo sviluppato consegnato macromolecole con dimensioni diverse e cariche elettriche nelle cellule viventi con carcinoma mammario metastatico. Consegna molecolare di successo è stato qualitativamente determinata monitorando i cambiamenti di intensità di fluorescenza delle cellule orbitanti elettroporate in situ e confermato da misurazioni quantitative mediante citometria a flusso. Figura 4A mostra che il 90% delle cellule trattate uptake 70.000 Da destran...

Discussione

Con la nuova piattaforma elettroporazione parallelizzati, aumento di 10 volte in velocità e l'efficienza della consegna multi-molecola è stata ottenuta in aggiunta a tutti i meriti che il sistema monocamerale precedentemente sviluppato fornisce. Meriti ¹⁸ Precedentemente disponibili includono (i) pre-purificazione della colpire le cellule con distribuzione uniforme di formato per la valorizzazione vitalità, (ii) un controllo preciso e individuale dosaggio molecolare, e (iii) a bassa corrente elettrica ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 cancer cell line	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz’s L-15 Medium	Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Trypsin	Gibco, Life Technologies	25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Oxygen Plasma Cleaner	Technics Micro-RIE
Dektak 6M surface profiler	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning
Compressed Nitrogen gas	Airgas	NI 300
High Pressure Regulator	McMaster-Carr	6162K22
Downstream regulator	McMaster-Carr	4000K563
High-speed 3/2way-8 valve manifold	Festo
Inline Check Valve	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK tubings	Festo	P1533
1/32" PEEK tubings	Idex Health and Science	P1569
PEEK tubing unions	Idex Health and Science	P881
Pulse Generator	HP	8110A
Aluminum Wire	Bob Martin Company	6061 ALUM
Oscilloscope	Agilent	DSO3062A
50 ml centrifuge tubes	VWR	21008-178
15 ml centrifuge tube	VWR	21008-216
T75 culture flask	VWR	82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic	Gibco, Life Technologies	D3307
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D3329