Cell Analyzer a base di impedenza in tempo reale come strumento per delineare molecolari meccanismi coinvolti nella neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale

Riepilogo

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Abstract

Molti disturbi cerebrali connesse sono morte delle cellule neuronali coinvolti nella loro fisiopatologia. Migliorata in modelli in vitro per studiare gli effetti neuroprotettivi o neurotossici di farmaci e vie a valle coinvolti aiuterebbe ottenere informazioni sui meccanismi molecolari di neuroprotezione / neurotossicità e potrebbe potenzialmente facilitare lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, molti saggi di tossicità esistenti in vitro hanno importanti limitazioni - più valutare neurotossicità e neuroprotezione in un unico punto di tempo, non permettendo di osservare il tempo-corso e cinetica dell'effetto. Inoltre, la possibilità di raccogliere informazioni sulle vie di segnalazione a valle coinvolti nella neuroprotezione in tempo reale sarebbe di grande importanza. Nel protocollo corrente viene descritto l'uso di un analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale per determinare gli effetti neuroprotettivi di serotonina 2A (5-HT _2A) agonisti dei recettori in una linea cellulare neuronale sotto senza etichetta e in tempo reale Conditioni che utilizzano misure di impedenza. Inoltre, abbiamo dimostrato che gli inibitori di secondi messaggeri percorsi possono essere usate per delineare molecole a valle che l'effetto neuroprotettivo. Noi descriviamo anche l'utilità di questa tecnica per determinare se un effetto sulla proliferazione cellulare contribuisce ad un effetto neuroprotettivo osservato. Il sistema utilizza piastre microelettronici speciali denominati E-tavole che contengono alternati matrici di microelettrodi d'oro sulla superficie inferiore dei pozzetti, che servono come sensori cellulari. La lettura impedenza viene modificato dal numero delle cellule aderenti, la vitalità cellulare, morfologia e adesione. Un parametro adimensionale chiamato cella indice è derivato dalle misure di impedenza elettrica e viene utilizzato per rappresentare lo stato delle cellule. Nel complesso, l'analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale permette in tempo reale, la valutazione libero-label di neuroprotezione e neurotossicità, e la valutazione dei percorsi di coinvolgimento secondo messaggero, contribuendo a piùvalutazione dettagliata e high-throughput di potenziali composti neuroprotettivi in vitro, per la selezione dei candidati terapeutici.

Introduzione

Morte cellulare neuronale svolge un ruolo critico nella fisiopatologia di molti disturbi cerebrali correlati ^1. La disponibilità di throughput elevato e affidabile nelle prove di tossicità in vitro è fondamentale per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi di neurotossicità e per contribuire a selezionare le molecole neuroprotettive come candidati terapeutici in sviluppo dei farmaci ^2. Tuttavia, ci sono molte limitazioni per più utilizzato in vitro neurotossicità assays.They valutare neurotossicità / neuroprotezione in una sola volta punto di non consentire la risoluzione cinetica; spesso utilizzare l'etichetta o la sonda che può interferire con le vie di segnalazione e limitare ulteriori studi nella stessa popolazione di cellule, e sono spesso ad alta intensità di manodopera, e in molti casi non forniscono informazioni meccanicistica. Nel presente studio abbiamo dimostrato l'utilità di un analizzatore di cellule di impedenza-based in tempo reale per determinare neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale in tempo reale e sotto libero-labelcondizioni e forniscono informazioni sui meccanismi a valle attraverso l'analisi delle seconde vie messaggeri coinvolti nell'effetto.

Precedenti studi hanno confermato la validità dell'analizzatore cella in tempo reale per determinare la citotossicità nonché effetti sulla proliferazione cellulare in linee cellulari in confronto con tecniche standard ^3,4,5,6. Ad esempio, una buona correlazione è stata osservata tra le letture della norma vitalità cellulare WST-1 test e cellulari valori dell'Indice in diversi punti del tempo in condizioni di proliferazione basali e dopo due diversi paradigmi tossici nelle cellule HeLa ^3. In A549 e MDA-MB-231 cellule proliferazione e citotossicità provocato con il paclitaxel stabilizzatore microtubuli hanno mostrato valori molto simili quando valutati da misurazioni dell'indice cellulare e il modo standard utilizzato solforodamina B (SRB) test ^4. Nella linea cellulare neuronale dei neuroni dell'ippocampo immortalati HT-22 cellule Indice misurazioni sono stati convalidati per la loro capacità to rilevare la proliferazione cellulare, glutammato citotossicità e citoprotezione contro il diffuso 3 (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium-bromuro (MTT) ^5. Nello stesso studio i risultati del test MTT e misurazioni Indice cellulare anche correlati bene in misura neuronale cellule progenitrici proliferazione, citotossicità dopo fattori di crescita deprivazione e salvataggio di citotossicità dal pan-caspasi inibitore QVD ^5. Citotossicità indotta in cellule NIH 3T3 da Vandetanib (vascular endothelial growth factor recettore e inibitore del recettore del fattore di crescita epidermico) ha mostrato risultati simili misurati con i valori dell'Indice cellulare o neutro saggio di uptake rosso ^6.

Abbiamo recentemente usato il sistema analizzatore di cellule in tempo reale per valutare gli effetti neuroprotettivi della 2A della serotonina (5-HT _2A) agonista del recettore cloridrato (±) -2,5-dimetossi-4-iodoamphetamine (DOI) in una linea cellulare neuronale ( cellule SK-N-SH) e screening per il coinvolgimento di second percorsi Messenger tramite il monitoraggio dell'effetto della loro inibizione chimica sulla neuroprotezione osservata ^7. È interessante notare che il recettore 5-HT _2A ha agonisti sia allucinogeni e nonhallucinogenic (come il DOI e lisuride, rispettivamente), che possono attivare sia secondo percorsi comuni e distinte Messenger ^8.

I vantaggi della tecnica sono presentati che permette di raccogliere informazioni in tempo reale sulla sopravvivenza cellulare nel corso dei giorni, per delineare percorsi di secondo messaggero coinvolti, per valutare il possibile contributo degli effetti proliferazione a neuroprotezione, e per selezionare un tempo ottimale per ulteriori studi end-point sulla stessa popolazione cellulare. Un diagramma schematico del flusso di lavoro nel protocollo attuale è presentato in figura 1.

Protocollo

1 Preparazione

1. Posizionare la stazione analizzatore cella in tempo reale di un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e con il 5% di CO _2. Effettuare tutte movimentazione coltura cellulare e trattamenti farmacologici in una cappa coltura tissutale in condizioni sterili.
2. NOTA: neuronale linee cellulari che richiedono diverse impostazioni di temperatura rispetto alle condizioni standard per la cultura, dovrebbero essere adeguati di conseguenza. Per le linee di cellule debolmente aderenti, usare agenti di rivestimento per facilitare l'interazione delle cellule con i microelettrodi d'oro nel fondo dei pozzetti della E-Plate 96.
3. Preparare soluzioni 1,000X azionari dei composti farmacologici per il trattamento delle colture cellulari (agenti neuroprotettivi o inibitori di seconda percorsi messaggero nel solvente appropriato - dimetilsolfossido o acqua sterile) e conservarli a -20 ° C. Utilizzare il solvente come veicolo per i seguenti trattamenti.
4. Cellule di neuroblastoma umano SK Cultura-N-SH in DMEM / F12 media integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) (media proliferazione) in fiasche di coltura cellulare con 175 centimetri ² superficie densità di circa il 75%. Mantenere numero di cellulare di passaggio all'interno di un intervallo (di circa 10 passaggi) per verificare la coerenza tra le esperienze in termini di tasso di proliferazione cellulare e la risposta alla citotossicità. Numeri passaggio più bassi sono preferiti.
5. Lavare lo strato di cellule SK-N-SH aderente con PBS, e trypsinize con soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per 5 min a 37 ° C. Centrifugare le cellule a 170 × g per 5 minuti per rimuovere tripsina. Risospendere le cellule in 10 ml di mezzo proliferazione. Contare le cellule con contatore di cellule Scettro e regolare il numero di cellule a 300.000 cellule / ml diluendo cellule con terreno di proliferazione.

2 placcatura e la proliferazione delle cellule SK-N-SH

1. Aggiungere 100 microlitri di media proliferazione a ciascun pozzetto della piastra E-96 e lasciarlo per 30 minuti nella cappa coltura tissutale a temperatura ambiente per equilibrare. Inserire la E-PlaTE 96 nella stazione analizzatore cella in tempo reale in CO ₂ incubatore a 37 ° C.
2. Avviare il software analizzatore di cellule in tempo reale. Nella pagina di layout selezionare i pozzi inclusi nell'esperimento ed entrano nelle caselle di modifica delle informazioni sul tipo di cellule, numero di cellulare, i nomi e le concentrazioni di composti chimici utilizzati per il trattamento delle cellule.
   NOTA: Ai fini del presente protocollo almeno 4 repliche sono raccomandati per ogni trattamento.
3. Nella pagina software Pianificazione determinare "Steps" inclusi nell'esperimento, selezionando il numero di passate cella di misura Index e l'intervallo fra le passate per ogni passo. Dal Passo 1 è predeterminato per la misurazione di sfondo, selezionare "Aggiungi un passo" e impostare Fase 2 per misurare l'Indice cellulare ogni 15 minuti per 96 ore.
   NOTA: Per i trattamenti, in cui sono attesi effetti con cinetica rapida, impostare scansioni ad intervalli più brevi.
4. Fare clic su Start per avviare la Fase predeterminata automaticamente 1e misurare l'impedenza dei mezzi di sfondo. Questo valore viene sottratto automaticamente dal software in ciascun punto di dati una volta che le cellule vengono aggiunti ai pozzetti.
5. Utilizzare il preparato in precedenza al punto 1.5) sospensione cellulare di 300.000 cellule / ml nel terreno di proliferazione. 30.000 cellule / pozzetto per tossicità cellulare / studi di neuroprotezione e 15.000 cellule / pozzetto per gli studi di proliferazione cellulare. Estrarre la E-piastra e aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare per bene per tossicità delle cellule / studi di neuroprotezione e aggiungere sospensione cellulare 50 ml e 50 ml di media per la proliferazione e per gli studi di proliferazione cellulare. Il numero di cellule piastrate per pozzetto deve essere ottimizzato per ciascuna linea cellulare empiricamente.
6. Agitare delicatamente la E-Plate 96 anche per la placcatura delle cellule. Lasciare la E-piastra 96 ​​per 30 min nella cappa coltura tissutale a temperatura ambiente per permettere alle cellule depositano uniformemente sul fondo dei pozzetti.
7. Inserire la E-Plate 96 nella stazione di analizzatore di cellule in tempo reale e iniziare a passo 2 a Schedule petà. Monitorare i valori dell'Indice cellulare in tutto l'esperimento visualizzando le curve cellulari sulla pagina Plot ed i dati grezzi dell'Indice cellulare sull'Indice di pagina cella del software.

3 Siero Privazione

1. 24 ore dopo la placcatura le cellule, mettere in pausa l'esperimento, e rimuovere la E-Plate 96 dalla stazione di analizzatore di cellule in tempo reale. Diluire inibitori secondi messaggeri provenienti dalle scorte 1,000X con / F12 terreno privo di siero DMEM - a 200 × la concentrazione finale. Trattare le cellule con 1 ml inibitori di seconde vie Messenger per essere testati per il loro coinvolgimento in neurotossicità / neuroprotezione 30 minuti prima di iniziare la citotossicità, per inibire i rispettivi percorsi. Riportare la E-piastra 96 ​​alla stazione e riprendere le misure sperimentali Indice cellulare.
2. Dopo 30 min di pausa di nuovo l'esperimento. Rimuovere con cautela medio proliferazione completamente da E-Piastra a 96 pozzetti con una pipetta (o pipetta multicanale), facendo attenzione a non disturbare lo strato di cellule aderentidirigendo il bordo della punta della pipetta all'angolo del pozzo. Aggiungere 200 ml / pozzetto di DMEM privo di siero / F12 (siero medio privazione). Garantire scambio rapido di mezzo di coltura cellulare per minimizzare agitazione meccanica delle cellule.
3. Diluire composti da testare per i loro effetti neuroprotettivi di 1,000X magazzino con serum-free DMEM / F12 medio 200 × la concentrazione finale. Aggiungere 1 microlitri composti da testare per i loro effetti neuroprotettivi e 1 ml inibitori di secondi messaggeri percorsi nei singoli pozzetti secondo il piano sperimentale.
4. Nelle cellule per studi di proliferazione non cambiare mezzo. Diluire composti da testare da 1,000X magazzino a 200 × la concentrazione finale nel medio proliferazione, il trattamento con 1 ml per pozzetto e continuare a cultura medio proliferazione.
5. Riprendere l'esperimento per continuare con cellulare Indice misurazioni ogni 15 minuti per 96 ore come precedentemente impostato.

4 Dati AANALISI

1. Per neurotossicità / dati neuroprotezione normalizzare cellulare Index per l'ultimo punto prima del trattamento farmacologico o medio modifica a ridurre le variazioni tra esperimenti selezionando "normalizzato Indice Cell" e "normalizzare Time" sulla pagina Plot.
2. Evidenziare i pozzi nella pagina della trama per le condizioni sperimentali di interesse e cliccare su "Aggiungi" per tracciare le curve normalizzate Indice cellulare. Osservare la cinetica di effetto neurotossico / neuroprotettivo, o di seconda messaggeri inibizione come curve normalizzate Index cellulare in funzione del tempo.
3. Osservare le curve Indice cellulare per i trattamenti farmacologici testati in media la proliferazione in funzione del tempo per valutare se un effetto sulla proliferazione è coinvolta nell'effetto neuroprotettivo / neurotossico.
4. Esportare le informazioni sperimentale per tutti i punti di cellulare temporali Indice dalla pagina del software Indice cellulare in un file di Excel per avviare la valutazione statistica dei risultati
   NOTA: Come primo passo nell'analisi statistica di una serie di programmi MATLAB modificati che utilizzano t-test di Welch, con il p-value tracciato semilogarithmically, utilizzare l'asse invertito contro la scala del tempo (fornito come file di codice supplementari). Questi programmi consentono il rilevamento dei valori p nel tempo-corso di un intero esperimento analizzatore cella in tempo reale, e quindi facilitare la selezione dei punti di tempo per l'analisi statistica più dettagliata. Vedere il materiale supplementare per informazioni dettagliate sui programmi.
5. Per l'analisi statistica delle differenze di cella Valori indice sotto diverse condizioni di trattamento in punti temporali specifici, selezionare i valori dell'Indice cellulare a rispettivi punti di tempo dal file Excel esportato. Analizzare i valori dell'Indice cellulare per i punti di tempo selezionati con unidirezionale o bidirezionale analisi della varianza (ANOVA) seguita da un test post-hoc utilizzando il software statistico.

Risultati

Deprivazione di siero porta a diminuire in cella i valori dell'Indice, che possono essere monitorati continuamente con l'analizzatore di cellule in tempo reale

Stimoli neurotossici verso le cellule portano ad una diminuzione della cella i valori dell'Indice, che può essere monitorato in tempo reale con la tecnica presentata e la cui dinamica dipende dallo stimolo neurotossico specifica e il tipo di cella studiata. Figura 2 illustra l'a...

Discussione

Il protocollo attuale presenta l'utilità di un analizzatore di cellule in tempo reale per valutare in modo continuo e in condizioni di libera-label / gli effetti neurotossici neuroprotettivi dei composti in linee cellulari neuronali e al fine di conoscere le seconde vie messaggeri coinvolti nell'effetto.

Anche se l'utilità analizzatore di cellule in tempo reale di studiare la citotossicità e gli effetti dei farmaci sulla proliferazione cellulare è generalmente riconosciuto, s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate