Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo

Riepilogo

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Abstract

La maggior parte dei processi morfogenetici nell'intestino fetale sono stati dedotto dalle sezioni sottili di tessuti fissati, fornendo istantanee di cambiamenti nel corso stadi di sviluppo. Informazioni tridimensionale da sezioni seriali sottili può essere difficile da interpretare a causa della difficoltà di ricostruire sezioni seriali perfettamente e mantenere il corretto orientamento del tessuto su sezioni seriali. Recenti scoperte di Grosse et al. 2011 sottolineano l'importanza di tre informazioni dimensionali nella comprensione morfogenesi dei villi sviluppo dell'intestino ^1. Ricostruzione tridimensionale delle cellule intestinali singolarmente etichettati dimostrato che la maggior parte delle cellule epiteliali intestinali contattare sia le superfici apicali e basali. Inoltre, ricostruzione tridimensionale del citoscheletro actina alla superficie apicale dell'epitelio dimostrato che lume intestinale è continua e che lumen secondarie sono un artefatto di sectioning. Questi due punti, insieme con la dimostrazione della migrazione nucleare interkinetic nell'epitelio intestinale, definita l'epitelio intestinale in via di sviluppo come un epitelio pseudostratificato e non stratificati come si pensava ^1. La capacità di osservare l'epitelio tridimensionale è stato seminale per dimostrare questo punto e ridefinendo morfogenesi epiteliale nell'intestino del feto. Con l'evoluzione della tecnologia di imaging multi-fotone e software di ricostruzione tridimensionale, la capacità di visualizzare intatto, lo sviluppo di organi sta rapidamente migliorando. Eccitazione a due fotoni permette la penetrazione meno dannoso più in profondità i tessuti con alta risoluzione. Due fotoni di imaging e la ricostruzione in 3D di tutto il fetali intestini del mouse in Walton et al., 2012 hanno contribuito a definire il modello di villi escrescenza ^2. Qui si descrive un intero sistema di coltura d'organo che permette ex vivo sviluppo dei villi e le estensioni di quel sistema di coltura per consentirel'intestino ad essere tridimensionalmente ripreso durante il loro sviluppo.

Introduzione

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

Protocollo

NOTA: Tutti i topi sono stati trattati umanamente utilizzando protocolli approvati dalla University of Michigan Medical School Unità per la Medicina di Laboratorio animali e secondo le linee guida della Commissione di Ateneo per l'uso e la cura degli animali.

1. intero sistema Cultura Organo

1. Preparazione dei supporti e piastre di coltura
   1. In una cappa di coltura tissutale, rimuovere 5 ml di BGJb supporto dalla bottiglia stock e aggiungere 5 ml di Pen / Strep. Preparare uno stock di lavoro di media in un tubo conico da 50 ml, con l'aggiunta di 1 ml di 5 mg / ml di acido ascorbico a 49 ml di BGJb media (con Pen / Strep).
   2. Preparare una piastra di coltura ben 6 con l'aggiunta di 1 ml di sotto ciascuna delle transwells.
      NOTA: Se non si utilizzano tutti i 6 transwells, spostare transwells in più in una sterile piatto 6 e fresco per un uso successivo. Aggiungere 3 ml di lavorare BGJb media per ciascuna delle tre piastre di Petri sterili 10 centimetri.
2. Preparazione per la dissezione
   1. Immergere gli strumenti di dissezione nel 70% etanolo perNol ed essere sicuri di mantenere gli strumenti puliti durante il lavoro.
   2. Impostare l'area dissezione con un grande secchio di ghiaccio e posizionare la piastra di coltura ben 6 e 10 centimetri di Petri con BGJb multimediale su ghiaccio. Lavorare sul ghiaccio il più possibile mentre dissezione e preparare l'intestino per la cultura.
   3. Anestetizzare adulto topi femmina in una camera con isofluorane (100 ml) prima euthanization da dislocazione cervicale per la raccolta di intestino fetale.
   4. Dopo la raccolta i feti dalla madre, in scena ogni feto con attenzione secondo la Theiler messa in scena tabella ^13. Non fare affidamento nei giorni post-coito per determinare l'età di ogni feto come variazioni fino a 24 ore in fase di sviluppo sono abitualmente osservati all'interno di una singola cucciolata.
3. Dissezione di intestini fetali
   1. Euthanize feti di decapitazione prima della rimozione di intestino.
   2. Sezionare ogni intestino di 1x Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e poi place in una piastra di Petri 10 centimetri con il lavoro BGJb media.
   3. Rimuovere con cautela la milza dallo stomaco e il pancreas dallo stomaco e duodeno superiore.
   4. Separare delicatamente il omento avendo cura di lasciare il omento divisoria per quanto possibile e separare connessioni solo sufficiente a permettere l'intestino da raddrizzare.
      NOTA: Per intestini di età superiore a E14.5 o quelli in coltura più di 24 ore, separare delicatamente l'intestino in 3 segmenti uguali per consentire contenuto luminale di fluire attraverso l'intestino ed essere espulsi dalle estremità tagliate. Tuttavia, per le culture iniziato prima E13.5, attendere fino a dopo 24 ore di coltura prima di separare i tre segmenti di intestino per permettere la sierosa di crescere correttamente sulla lunghezza dell'intestino.
   5. Utilizzare una pipetta bocca per trasferire i pezzi intestinali sui transwells della piastra di coltura (1.1.2).
   6. Riposizionare delicatamente l'intestino, se necessario in modo che siano dritti alla transwell.
      NOTA: Una volta che gli intestini cominciano muoversi contenuto luminale attraverso il tubo, eventuali pieghe a livello intestinale causerà un backup e danni per l'intestino.
4. Cultura e trattamento
   1. Rimuovere il supporto da sotto il transwell, aggiungere 700 ml di mezzi di trattamento (dei media che lavorano con l'aggiunta di proteine ​​ricombinanti o inibitori farmacologici) sotto il transwell.
   2. Aggiungere 300 ml di supporti trattamento goccia a goccia sulla parte superiore dell'intestino e lasciare in ammollo attraverso il transwell. Riposizionare l'intestino, se necessario.
   3. Cambiare mezzi trattamento almeno una volta al giorno o più spesso a seconda del tempo di dimezzamento del reagente trattamento.
5. Preparazione di proteine ​​imbevuto agarosio perline per una fonte localizzata di reagente trattamento
   1. Risospendere le perline agarosio nel loro contenitore e trasferire 100 ml di perline agarosio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
   2. Riempire il volume rimanente del tubo con sterile 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) e mescolare le perle di lavarli. Collocare la provetta da microcentrifuga in un rack per alcuni minuti per consentire le perle di depositarsi sul fondo e poi pipettare fuori dalla PBS in cima alle perline. Riempire la provetta per microcentrifuga con 1x PBS sterile e ripetere il processo di lavaggio altre due volte.
   3. Preparare la proteina di interesse a due volte la concentrazione desiderata per il trattamento.
   4. Mescolare 5 ml di perline agarosio lavato con 5 ml di proteina magazzino 2x e agitare delicatamente le perline nella proteina. Porre la provetta in ghiaccio per 1 ora, mescolando delicatamente ogni 10-15 min.
   5. Sciacquare le perline brevemente sterile 1x PBS prima di mettere le perline su intestini.
6. Posizionamento di perline agarosio
   1. Posizionare delicatamente le perline agarosio sulla parte superiore dell'intestino utilizzando una pipetta bocca con aghi capillari tirato. Posizionare le perle con estrema cautela in quanto un trasporto sicuro danneggia l'intestino e prevenire lo sviluppo dei villi nella zona lesa.
   2. Posizionare il doppio delle perle come sono necessari per l'analisi in quanto l'intestino saranno sottoposti a movimenti peristaltici e circa la metà delle perline poste rotolerà fuori degli intestini oltre il tempo di coltura.
7. Fissazione di intestino in coltura
   1. Rimuovere con cautela il supporto di trattamento da sotto la transwell e permettere l'intestino di aria secca per 3 min.
   2. Aggiungere 1 ml di fissativo sotto la transwell per 2 minuti, quindi coprire la parte superiore dell'intestino con 2 ml di fissativo per il resto del tempo di fissazione. Fissare con 4% paraformaldeide O / N a 4 ° C o per 2 ore a temperatura ambiente.

2 Imaging di Intestino fisse

1. Immagini Wholemount
   1. Posizionare l'intero intestino (con fluorescenza endogena) su un vetrino con 100 ml di 1x DPBS. Usare pinze per organizzare delicatamente l'intestino.
   2. Utilizzare un tessuto laboratorio per rimuovere con attenzione i DPBS e immediatamente aggiungere 100 ml di glicerolo 70% per rendere il mo tessutiri trasparente e aumentare la possibile profondità di imaging.
      NOTA: Se si desidera ulteriore penetrazione dell'intestino, invece di montare l'intestino in 70% glicerolo, immergere l'intestino in poche gocce di soluzione di messa a fuoco libero per 10-30 min. Pipettare fuori la soluzione messa a fuoco chiara e montare l'intestino con il Monte Chiaro.
   3. Immergere ciascuno dei quattro angoli di un coprioggetto in creta e raccogliere una piccola quantità di argilla da utilizzare come distanziatori tra il vetrino e coprioggetto per mantenere il coprioggetto da appiattimento dell'intestino.
   4. Sigillare il coprioggetto sul vetrino con VALAP fusa applicato con un batuffolo di cotone.
   5. Immagine l'intestino su entrambi un microscopio confocale in posizione verticale o invertita. Si prega di fare riferimento alla discussione per ulteriori dettagli.
2. Vibratome sezionamento di intestino fissi (per la vista in sezione trasversale di strutture intestinali)
   1. Intestini incorporare nel 7% di agarosio in piccoli stampi di plastica (10 x 10 x 15 mm) e consentire i blocchi di agarosio araffreddare e solidificare.
   2. Rimuovere i blocchi di agarosio dagli stampi di plastica e blocchi di colla di agarosio alla fase di raccolta vibratome con colla istantanea.
   3. Riempire la fase della raccolta con il freddo ghiaccio 1x DPBS.
   4. Tagliare sezioni ad uno spessore compreso tra 100-150 micron. Per le sezioni più spesse utilizzano le soluzioni di compensazione (descritti nella sezione 2.1.2) per visualizzare più in profondità la sezione trasversale.
   5. Versare vibratome sezioni dalla fase di raccolta in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti per la conservazione a 4 ° C.
3. Immunofluorescenza colorazione dei tessuti, vibratome sezionati fissi
   1. Posizionare 5-12 sezioni vibratome per bene in un 24-pozzetti con 1x DPBS.
   2. Rimuovere 1x DPBS e aggiungere 500 ml di soluzione di permeabilizzazione per pozzetto. Agitare delicatamente i campioni per 25 minuti a temperatura ambiente.
   3. Dopo permeabilizzazione, lavare i campioni 3 volte con PBS 1x.
   4. Bloccare i campioni per almeno 30 minuti in 500 ml di Blocking Solution.
   5. Dopo il blocco, exchange la soluzione di saturazione con 500 ml di anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante e mantenere i campioni a 4 ° CO / N.
      NOTA: Le diluizioni degli anticorpi primari che funzionano bene su sezioni congelate e paraffina generalmente funzionano bene su vibratome sezioni troppo, ma gli anticorpi che richiede il recupero dell'antigene nucleare in genere non funzionano bene con questo protocollo (ad esempio, BrdU).
   6. Il giorno seguente, lavare i campioni 3 volte per 15 minuti ogni volta con soluzione bloccante.
   7. Dopo il lavaggio, applicare 500 ml di anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante. Avvolgere la piastra di 24 pozzetti in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori dalla luce e rock i campioni per 45 minuti a 2 ore a temperatura ambiente.
   8. Lavare i campioni 3 volte con PBS 1x per 15 minuti ciascuno e montare le sezioni vibratome su vetrini come descritto nella Sezione 2.4.
4. Montaggio vibratome sezioni
   1. Preparare i vetrini per vibratome il montaggio tagliando fette sottili di double-stinastro ck e metterli lungo i lati lunghi delle diapositive.
   2. Posizionare con cura 5-10 sezioni vibratome tra il nastro biadesivo sulle diapositive in una goccia di 100 microlitri di PBS 1x.
   3. Aprire tutte le sezioni e diffondere fuori in un unico livello in tutta la diapositiva.
   4. Rimuovere eventuali agarosio eccesso o pezzi irregolari che potrebbero impedire un coprioggetto da seduta piatta.
   5. Utilizzare con cautela un tessuto laboratorio per assorbire l'eccesso di PBS 1x attorno alle sezioni vibratome.
   6. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio acquoso sulla cima delle sezioni vibratome e poi coprioggetto.
   7. Sigillare i coprioggetti sui vetrini con fuso VALAP applicato con un batuffolo di cotone.
   8. Immagine sezioni vibratome su entrambi un microscopio confocale diritta o capovolta. Si prega di fare riferimento alla discussione per ulteriori dettagli sulla selezione di un sistema di imaging.

3 Immagini dal vivo di Intestino interi

Intestino raccolte da fetuses dopo E12.5, con l'omento collegato lasciato intatto, sviluppare con successo villi in coltura utilizzando il sistema di cui sopra. Pertanto, questo sistema ex vivo permette la cattura di immagini z-sezione live dell'intestino sviluppo che possono essere ricostruite per una vista tridimensionale della morfogenesi nel tempo.

1. Impostazione di immagini dal vivo
   1. Utilizzare colla istantanea di aderire una membrana di policarbonato individuo a uno schermo a maglia fine. Questo fornisce un'impalcatura di sostegno per tenere l'intestino in posizione sotto la lente immersione del microscopio confocale montante. Si prega di consultare la sezione di discussione per ulteriori dettagli sulla selezione di microscopi di imaging dal vivo.
   2. Posizionare lo schermo a rete al centro e di una piastra di coltura.
   3. Posizionare l'intestino sezionato sulla membrana di policarbonato e aggiungere una goccia di colla istantanea alle due estremità. Utilizzare solo abbastanza colla per apporre l'intestino, ma non ricoprirlo!
   4. Aggiungi terreni di coltura privo di fenolo rosso sotto il policarbonatomembrana nel centro pozzetto della piastra di coltura.
   5. Aggiungere acqua al bordo esterno della piastra di coltura per fornire umidità.
   6. Dal momento che l'intestino fetale subisce onde peristaltiche simili di contrazione nella cultura, aggiungere 100 ml di una soluzione 1: 5 di xilazina in 1x PBS a 3 ml di media per controllare il movimento dell'intestino durante l'imaging. Questo dosaggio controllerà i movimenti intestinali per circa 8-10 ore senza compromettere lo sviluppo dei villi.
   7. Per una vista trasversale dell'intestino, incorporare gli intestini vivi in ​​una soluzione di agarosio 3-4% e tagliare sezioni spesse (150-500 micron) su un vibratome. Abbinare la rigidità del agarosio con la rigidità dell'intestino essere tagliati ed empiricamente determinata fase di sviluppo. In generale, una soluzione di agarosio al 3% funziona bene per l'intestino di età inferiore E14.5 e una soluzione al 4% funziona bene per l'intestino E15-E16.
   8. Incollare le sezioni vibratome ad una membrana di policarbonato, apposto su un schermo di maglia (come al punto 3.1.1) ecultura come descritto nella sezione 3.1.2-3.1.6.
   9. Condurre l'imaging dal vivo utilizzando un microscopio confocale a due fotoni (laser di eccitazione tra 690-1,040 nm) su un supporto verticale con un tavolo sintonizzabile.
   10. Laser a due fotoni sintonizzato a 900 nm fornisce penetrazione profonda con la migliore risoluzione per i segnali GFP. Riduce i danni ai tessuti durante l'imaging. Inoltre, impostando la potenza del laser per l'emissione più bassa riduce il danno tissutale. Tipicamente per ottenere una buona eccitazione di GFP, utilizzare potenza 12% sul laser a due fotoni.

Risultati

Cultura di espianti interi di intestini fetali consente per le analisi del luogo, la distribuzione, e la durata delle molecole di segnalazione che coordinano lo sviluppo intestinale, in quanto questo sistema consente la manipolazione della segnalazione con reagenti farmacologici o proteine ​​ricombinanti. Il sistema di coltura transwell (Figura 1A, riprodotto da Walton et al., 2012) ² fornisce una interfaccia aria-liquido, che permette di posizionare droga o proteine ​​imbevu...

Discussione

La natura dinamica e le interazioni complesse dei tessuti dell'intestino in via di sviluppo richiede la visualizzazione 3D per avere una comprensione completa di questi eventi morfogenetici. Con la continua evoluzione tecnologia di imaging, la capacità di esaminare villi morfogenesi in dettaglio si sta sviluppando / miglioramento e con esso, la comprensione della comunicazione spaziale e l'interazione durante l'organogenesi è notevolmente migliorata.

Metodi di coltura intestini...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416