Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

Riepilogo

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Abstract

Cellule NG2 che esprimono (polydendrocytes, cellule precursori degli oligodendrociti) sono la quarta maggiore popolazione di cellule gliali nel sistema nervoso centrale. Durante lo sviluppo embrionale e postnatale che proliferano attivamente e generano oligodendrociti mielinizzanti. Queste cellule sono state comunemente studiate in colture primarie dissociate, co-colture di neuroni, e nel tessuto fisso. Utilizzo di recente disponibili linee di topi transgenici fetta sistemi di coltura possono essere utilizzati per studiare la proliferazione e la differenziazione delle cellule oligodendrociti lineage in entrambe le regioni grigi e bianchi questione di proencefalo e cervelletto. Culture fetta sono preparati dai primi topi postnatale e sono tenuti in coltura per fino a 1 mese. Queste sezioni possono essere esposte più volte nel corso del periodo di coltura per studiare il comportamento e le interazioni cellulari. Questo metodo permette la visualizzazione di divisione cellulare NG2 e le fasi che portano alla differenziazione degli oligodendrociti consentendo un'analisi dettagliata della regione dipendeent cellule NG2 e oligodendrociti eterogeneità funzionale. Questa è una tecnica potente che può essere usato per studiare i segnali intrinseci ed estrinseci che influenzano queste cellule nel tempo in un ambiente cellulare che si avvicina a quella trovata in vivo.

Introduzione

Culture fetta Organoytpic del sistema nervoso centrale, hanno dimostrato di essere estremamente utile per lo studio dei neuroni e della biologia delle cellule gliali in un sistema semiintact ^{1 - 4.} Queste culture sono relativamente semplici da adottare e mantenere molti benefici di colture primarie di cellule dissociate, come manipolazione dell'ambiente extracellulare e di facile accesso per i ripetuti a lungo termine imaging cellulare dal vivo e registrazioni elettrofisiologiche ^5-9. Inoltre, culture fetta mantengono citoarchitettura tessuto 3-dimensionale, connettività neurale regionale, e la maggior parte dei tipi di cellule principali sono presenti nel sistema. Queste proprietà fanno di queste culture un sistema unico e conveniente per studiare il comportamento di singole cellule e fisiologia con interazioni cellulari e ambientali.

Cellule NG2 sono una popolazione di cellule gliali nel sistema nervoso centrale dei mammiferi che continuano a proliferare e generare myelinating oligodendrociti durante lo sviluppo embrionale e postnatale ^10. Essi sono stati ampiamente studiati in colture cellulari primarie dissociate, e recente sviluppo di linee di topi transgenici con espressione specifica delle cellule NG2 di proteine ​​fluorescenti ha facilitato nella mappatura vivo destino e registrazioni elettrofisiologiche in fettine acute. Anche con questi studi, poco si sa circa le dinamiche temporali di proliferazione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti. Sebbene coltura cellulare dissociata è ampiamente usato per la relativa facilità di manipolazioni farmacologiche e genetiche, non è adatto per interrogare differenze funzionali di queste cellule in differenti regioni cerebrali in particolare quando è desiderabile mantenere contesto del microambiente cellulare. Culture fetta forniscono una semplice alternativa che è suscettibile di manipolazioni farmacologiche e sono stati utilizzati per indagare oligodendrociti mielinizzazione ^11,12, cellulerisposta colare dopo lisolecitina (LPC) o di anticorpi indotta demielinizzazione ^13,14, e l'induzione di rimielinizzazione tramite trattamento farmacologico ^15.

Un metodo per indagare ed eseguire l'imaging dal vivo e tessuto fissato (o postfixation) analisi della proliferazione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti in culture fetta organotipica prelevati sia dal prosencefalo e il cervelletto è descritto. Questo è un metodo potente che può essere utilizzato per studiare il destino delle cellule di singole cellule NG2 dopo la divisione ¹⁶ e per scoprire le differenze o una regione e di età-dipendente in fattore di crescita NG2 indotta proliferazione cellulare ^17. Questo relativamente semplice tecnica è ampiamente accessibile di approfondire intrinseca e / o ambientale cella meccanismi che regolano la fisiologia di queste cellule gliali e la loro risposta all'attività neuronale o danneggiamento della mielina.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali stanno seguendo le linee guida e sono stati approvati dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso l'Università del Connecticut.

NOTA: Per questi esperimenti costitutive NG2cre ¹⁸ (JAX # 008533) e inducibile NG2creER ¹⁶ (JAX # 008538) topi transgenici attraversato dalla A alla Z / EG ¹⁹ (JAX # 003920) o gtRosa26: YFP giornalista ²⁰ (JAX # 006148) linee, rispettivamente, sono stati utilizzati di immagine cellule NG2 e la loro progenie. Per immagini oligodendrociti maturi, PLPDsRed topi transgenici ²¹ sono stati utilizzati. Per la sopravvivenza coerente, fette possono essere isolati da topi fino a 10 giorni dopo la nascita sia dal prosencefalo e il cervelletto.

1 fetta Preparazione

1. In una cappa cultura, posizionare inserti di coltura di tessuti in sei pozzetti e aggiungere 1 ml di fetta di terreno di coltura (ricetta nella sezione reagenti). Mettere le piastre nell'incubatore coltura cellulare a 37 ° C con 5% di CO ₂ di almeno 2 ore prima della dissezione.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti e chopper tessuto con il 70% di etanolo.
3. Tampone Bubble dissezione (ricetta nella sezione reagenti) con il 95% O _2, 5% di CO ₂ in ghiaccio per almeno 15 minuti prima dell'inizio della dissezione.
4. Anestetizzare cuccioli di topo mettendoli in ghiaccio per 5-10 minuti secondo protocolli approvati animali. Accertare la profondità appropriata di anestesia confermando che i topi non rispondono alla coda e pizzicare punta.
5. Decapitare animali utilizzando forbici affilate seguenti protocolli di animali. Rimuovere rapidamente il teschio sopra il proencefalo e cervelletto facendo prima un taglio sagittale seguita da incisione laterale, utilizzando strumenti sterilizzati. Tagliare nervi cranici dalla superficie ventrale del cervello e cervelletto rotolando attentamente il tessuto al lato.
6. Posizionare il tessuto in un piatto sterile 35 millimetri contenente tampone dissezione ossigenato ghiacciato.
7. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il cervelletto e proencefalo. Poi fare un taglio medio-sagittale through proencefalo e cervelletto, che separa gli emisferi.
8. Tagliare 300 micron di spessore sezioni coronali e sagittali del proencefalo e cervelletto con un elicottero del tessuto manuale. NOTA: Un elicottero tessuto manuale permette una rapida trasformazione da dissezione alla cultura incubazione senza la necessità di incorporamento agarosio. Un vibratome può anche essere usato come descritto in precedenza ^9.
9. Trasferire le fette separate in appena bolle buffer di dissezione a freddo su ghiaccio.
10. Utilizzare piccola dissezione o di peso spatole per separare singole sezioni e trasferire loro di preincubato sei piatti e con inserti di cultura.
11. Rimuovere eventuali buffer di dissezione in eccesso dalla superficie dell'inserto cultura con una pipetta di trasferimento monouso o un suggerimento P 200 pipetta. Da due a tre proencefalo o tre fettine di cervelletto può essere collocata in un inserto cultura.
    NOTA: Per i risultati coerenti con le culture del prosencefalo, è ideale per prendere le fette che attraversa il anteriore un terzo del corpo calloso(Figura 1A) al fine di studiare entrambe le regioni materia grigia e bianca nella stessa sezione. Ogni animale di solito produce 6 fette prosencefalo e 6 fette cervelletto.
12. Posizionare le sei pozzetti in incubatrice e sostituire il supporto fetta con 1 ml di terreno fetta 1 giorno dopo la preparazione fetta e poi a giorni alterni fino fissazione fetta.
13. A seconda dell'esperimento, utilizzare fette dopo 5-7 giorni di coltura. Utilizzare solo le fette che diventano trasparenti dopo i primi giorni e scartare quelli che hanno le regioni opache irregolari. NOTA: le regioni opache all'interno fette sono visibili ad occhio e appaiono come un grumo di cellule scuri sotto a contrasto di fase. Dopo che la tecnica è stato masterizzato, fette opache morti si verificano raramente, in meno del 1-5% di fette.

2 Time-Lapse Imaging di divisione delle cellule NG2 e Oligodendrocyte Differenziazione

NOTA: Per eseguire lasso di tempo di imaging della proliferazione delle cellule NG2 e differenziazione usiamo NG2cre: ZEG topi ¹⁶che esprimono EGFP in cellule NG2 e la loro progenie (Figura 1C-E). Reporter espressione in questa linea è sufficientemente robusto per ottenere immagini in diretta di GFP + cellule in fettine subito dopo il sezionamento per un periodo di tempo di almeno quattro settimane. Le immagini più chiare sono ottenute dopo il periodo iniziale assottigliamento della fetta, che si verifica durante i primi 3-5 giorni di coltura.

1. Durante l'esperimento, mantenere le fette in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e rimuovere solo per brevi periodi di tempo (meno di 15 min per fetta), mantenendo il coperchio sulla piastra ben sei durante l'imaging.
2. Utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito dotato di una fotocamera digitale, catturare immagini al primo punto temporale utilizzando un obiettivo 10X. NOTA: Primi punti di tempo può variare da esperimento e può essere il giorno in cui sono state preparate le fette o in qualsiasi punto nel tempo dopo.
3. Cattura immagini da più regioni in punto una volta in entrambe le zone grigie e bianche materia della fetta. Nota the regione ripreso da punti di riferimento specifici all'interno la fetta e mappando la posizione dell'immagine su uno schema che può essere utilizzato per le sessioni di imaging successive. Punti di riferimento utili possono includere bordi delle fette e / o l'orientamento dei tratti di sostanza bianca. Immagine 4-8 posizioni su ogni fetta in ogni punto.
4. Cattura immagini successive con un intervallo di 4-6 ore se l'esame di divisione delle cellule NG2 e la differenziazione degli oligodendrociti, idealmente più di 5-7 giorni.
5. Catturare un'immagine finale di tutte le regioni e fissare le fette immediatamente. Aggiungere 1 ml di fissativo (4% PFA con 0.1M L-lisina 0,01 M di sodio meta-periodato) al fondo dell'inserto cultura, quindi aggiungere altre 1 ml sopra le fette. Fare attenzione a non spruzzare il fissativo direttamente sulla fetta come si può staccare dalla membrana. Fissare il tessuto per 30 minuti e procedere con immunoistochimica utilizzando marcatori specifici stadi di sviluppo, come descritto nella sezione 4.
6. Fette Lavare con 0,2 M di sodio tampone fosfato 3 x 10 m. Se necessario, memorizzate fette a 4 ° C in 0.2 M tampone fosfato di sodio per 1-3 giorni prima di immunoistochimica ma idealmente eseguire colorazione entro 24 ore. Procedere con immunoistochimica come descritto di seguito nella sezione 4 per determinare la percentuale di cellule che si sono differenziate in oligodendrociti (Figura 2D-F).

3 Fate Mappatura di Progeny cellule NG2 Utilizzando topi inducibile Reporter transgenici nelle culture fetta

NOTA: Per monitorare il destino delle cellule NG2 da un particolare punto di tempo nella cultura, inducibili NG2creER: possono essere utilizzati YFP topi transgenici.

1. Indurre Cre ricombinazione e di espressione giornalista con l'aggiunta di 100 4OHT nM disciolto in etanolo al mezzo di coltura. NOTA: cellule positive Reporter dovrebbero apparire entro 1-2 giorni ad una efficienza di induzione di ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + cellule ed a questo punto di tempo saranno tutti cellule in fase di cellule NG2 (Figura 2A-C)
2. Fissare e lavare la fettas in diversi momenti dopo varie manipolazioni (descritti nelle sezioni 2.5 e 2.6).

4 Slice Immunoistochimica

1. Tagliare le membrane con le fette allegate fuori degli inserti utilizzando un bisturi.
2. Trasferimento fette ai singoli pozzetti di una soluzione salina 24 piatto contenente ben tamponata con fosfato (PBS) utilizzando un set di pinzette, facendo attenzione a non interrompere la composizione della fetta al momento del ritiro la membrana.
3. Trasferire le fettine su un piatto ben 24 con la soluzione bloccante contenente siero 5% di capra normale (NGS) e 0,1% Triton-X100 in PBS per 1 ora.
4. Incubare le fette in anticorpo primario O / N a 5% NGS in PBS a 4 ° C. Per identificare le cellule in fase di cellule NG2, utilizzare anticorpi anti NG2 e PDGFRα. Per identificare oligodendrociti differenziati, utilizzare un anticorpo per la poliposi adenomatosa dell'antigene coli (APC; clone CC1).
5. Al secondo giorno fette di lavaggio in PBS 3 x15 min, poi incubare in Antibo secondariamuore in 5% NGS in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le fette in PBS 3 x15 min e montare su vetrini. Montare con le fette su e membrana di fronte alla diapositiva in modo che la membrana non sarà tra l'obiettivo e il tessuto.

Risultati

Esempi di dati rappresentativi sono riportati qui di seguito, che sono stati ottenuti con culture fetta sia dal proencefalo e nel cervelletto di P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP e PLPDsRed linee di topi transgenici. Cellule NG2 possono essere esposte nei giorni in prosencefalo e cervelletto fette (Figura 1B-D, video 1) e il fenotipo di queste cellule può essere determinata dopo la fissazione e immunoistochimica con anticorpi NG2 e CC1 (Figura 1E). Oltre a vivere l'imaging, la prolifer...

Discussione

Mielinizzazione nel sistema nervoso centrale è essenziale per un'efficiente comunicazione neuronale e la sopravvivenza assonale ^22. Cellule NG2 continuano a generare oligodendrociti mielinizzanti in età adulta, pur mantenendo una popolazione residente nella maggior parte delle regioni del cervello ^{16,23 - 25.} Alcuni meccanismi genetici e molecolari che regolano il differenziamento di queste cellule sono state descritte, ma resta ancora molto da scoprire. Culture fetta organotipica sono un com...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slice Culture Medium
Minimum Essential Medium	Invitrogen	11090	50%
Hank’s Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175	25%
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034	25mM
L-Glutamine	Invitrogen	25030	1mM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	1mg/L
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	0.4mM
Horse Serum	Hyclone	SH30074.03	25%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	124mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3.004mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	1.25mM
MgSO4 (anhydrous)	Sigma-Aldrich	M7506	4.004mM
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	2mM
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	26mM
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	10mM
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	2.0mM
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	0.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT)	Sigma-Aldrich	H7904	100nM
Paraformaldehyde (PFA)	EM Sciences	19200	4%
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L-6027	0.1M
Sodium Metaperiodate	Sigma-Aldrich	S-1878	0.01M
Rabbit anti NG2 antibody	Chemicon (Millipore)	AB5320	1:500
Mouse anti CC1 antibody	Calbiochem (Millipore)	OP80	1:200
Mouse anti Ki67 antibody	Vision Biosystems	NCL-Ki67-MM1	1:300
Mouse anti NeuN antibody	Chemicon (Millipore)	MAB377	1:500
Species specific secondary antibodies	Jackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS)			5%
Triton X-100			0.10%
Mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size	Fisher Scientific	PICM03050
Bottle top filters	Fisher Scientific	09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope