Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Riepilogo

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Poiché la microscopia elettronica a trasmissione 1940 (TEM) ha fornito i biologi con immagini ultra-alta risoluzione di materiali biologici. Tuttavia, a causa dei protocolli laboriose e lunghe che richiedono anche esperienza nella preparazione dei campioni prive di artefatti, TEM non è considerata una tecnica di facile utilizzo. Preparazione del campione Tradizionale per TEM usato fissativi chimici per preservare le strutture cellulari. Di congelamento ad alta pressione è il cryofixation di campioni biologici sotto alte pressioni per produrre velocità di raffreddamento molto rapidi, limitando in tal modo la formazione di ghiaccio, che è dannoso per l'integrità della ultrastruttura cellulare. Di congelamento ad alta pressione e la sostituzione congelamento sono attualmente i metodi di scelta per produrre la morfologia più alta qualità nelle sezioni in resina per TEM. Questi metodi minimizzano i manufatti normalmente connessi con l'elaborazione convenzionale per TEM di sezioni sottili. Dopo cryofixation l'acqua congelata nel campione viene sostituito con il liquidosolvente organico a basse temperature, un processo chiamato sostituzione congelamento. Sostituzione di Fermo è tipicamente effettuata per diversi giorni in dedicati, attrezzature costose. Una recente innovazione permette il processo per essere completato in tre ore, invece dei soliti due giorni. Questo è in genere seguito da diversi giorni di preparazione del campione, che comprende l'infiltrazione e l'inclusione in resine epossidiche prima del sezionamento. Qui vi presentiamo un protocollo che combina il congelamento ad alta pressione e la sostituzione di congelamento rapido che consente la fissazione del campione pianta per essere realizzato in poche ore. Il protocollo può essere facilmente adattato per lavorare con altri tessuti o organismi. Tessuti vegetali sono di particolare interesse per la presenza di spazi aerati e vacuoli pieni d'acqua che impediscono il congelamento senza ghiaccio d'acqua. Inoltre, il processo di sintesi chimica è particolarmente lunghi in piante dovuto a pareti cellulari che impediscono la penetrazione delle sostanze chimiche di profondità all'interno dei tessuti. Tessuti vegetali sono quindi particlarmente impegnativo, ma questo protocollo è affidabile e produce campioni di altissima qualità.

Introduzione

La nostra conoscenza della ultrastruttura cellulare proviene principalmente da microscopia elettronica, che possono risolvere dettagli nell'intervallo di pochi nanometri ^1. Pur essendo così potente nella risoluzione TEM non è considerato user-friendly, come la preparazione del campione richiede tempo e protocolli laboriosi, e richiede una certa esperienza da professionista. Fissazione tradizionale dei campioni ha combinato l'uso di aldeidi e tetrossido di osmio prima di ulteriori trasformazioni che comprende la disidratazione, inclusione in resina e poi sezionamento per la produzione di sezioni ultrasottili che vengono poi colorate con metalli pesanti. Tuttavia, è noto che la fissazione chimica può produrre artefatti compresi aggregazione proteica e la perdita di lipidi ^1, e modifiche alle membrane che influenzano in definitiva più compartimenti cellulari ^2. Questi manufatti sono in gran parte attribuite al basso tasso di fissazione e disidratazione a temperatura ambiente ^{3, 4, 5.}

Cryofixation da alta pressione congelamento (HPF) evita la maggior parte degli artefatti causati dalla fissazione chimica. Il principio di cryofixation è che abbassa il punto di congelamento dell'acqua di 20 gradi, rallenta la nucleazione e la crescita dei cristalli di ghiaccio e aumenta la viscosità dell'acqua in un campione biologico in modo che costituenti cellulari sono essenzialmente immobilizzati ^{6, 7.} HPF diminuisce un temperatura del campione a quella dell'azoto liquido, sotto pressione molto elevata (210 MPa o 2.100 bar) in millisecondi. Quando fatto correttamente HPF impedisce la formazione di grossi cristalli di ghiaccio che possono causare gravi danni alla ultrastruttura delle cellule. HPF può essere utilizzato per fissare i campioni di 100-200 micron di spessore a concentrazioni tipiche di soluti biologici ^7. Ci sono numerose recensioni sulla fisica ei principi di base HPF, ad ^{esempio, 1, 7, 8.}

Dopo HPF, i campioni vengono incubati a bassa temperatura (-78,5 ° C a -90 &# 176, C) in presenza di solventi contenenti fissativi chimici liquidi organici come tetrossido di osmio, generalmente per un paio di giorni. A questa bassa temperatura, l'acqua del campione è sostituito dal solvente organico, tipicamente acetone o metanolo ^{1, 9.} Pertanto, questo processo è chiamato sostituzione congelamento (FS). Il campione viene poi gradualmente riscaldato e durante questo tempo è fisso, di solito con tetrossido di osmio e acetato di uranile ^9. Reticolazione a bassa temperatura ha il vantaggio di fissare molecole che sono immobilizzati ^1. FS produce pertanto campioni di qualità superiore rispetto a quelli fissati dalla fissazione chimica convenzionale a temperatura ambiente, in particolare si traduce in una migliore conservazione ultrastrutturale, migliore conservazione di antigenicità e ridotta perdita di componenti cellulari non legati ^{10, 11.}

La maggior parte delle FS viene effettuata su periodi di tempo lunghi, in genere fino a diversi giorni. Ciò è particolarmente true per le piante campioni ^{12, 13, 14.} Un protocollo recente sviluppato da McDonald e Webb riduce notevolmente il tempo di FS da diversi giorni a poche ore ^15. Nella procedura loro rapida sostituzione congelamento (QFS), FS viene effettuata più di 3 ore, mentre nelle FS super veloce (SQFS) campioni vengono processati in 90 minuti. La qualità dei campioni prodotti da questi metodi è paragonabile a quelli derivanti dai protocolli FS tradizionali. Abbiamo adottato il protocollo QFS per la lavorazione a valle di campioni vegetali dopo HPF. Questo ha dimostrato di risparmiare non solo tempo ma anche denaro, come QFS e SQFS utilizzano apparecchiature di laboratorio comune al posto delle macchine FS disponibili in commercio costosi.

Tessuti vegetali sono spesso molto impegnativo per preparare TEM. In media, le cellule vegetali sono più grandi di quanto sia cellule batteriche o animali. La presenza di idrofobica cuticola cerosa, pareti cellulari spesse, grandi vacuoli pieni d'acqua contenenti acidi organici, idrolasi e fenolica compounds che possono occupare fino al 90% del volume cellulare totale ^16, e la presenza di spazi aerati diminuisce notevolmente la conducibilità termica del sistema ^17. Inoltre, nel caso di impianti, lo spessore del campione supera quasi sempre 20 micron, il limite per l'uso di fissaggio chimico. A questi spessori, la bassa conducibilità termica di acqua impedisce una velocità di congelamento più di -10.000 ° C / sec al centro del campione. Questo tasso è necessaria per evitare la formazione di ghiaccio danneggiare esagonale (cristalli di ghiaccio con una densità più bassa e più grande di 10 a 15 nm) ^8. Insieme, questi presentano sfide sia corretto congelamento del campione e FS successive. Tuttavia, cryofixation è il metodo migliore per il fissaggio campioni vegetali. Qui un protocollo per HPF-QFS di campioni di tessuto vegetale è presentato. Si concentra sul modello di specie Arabidopsis thaliana, ma è stato utilizzato anche con Nicotiana benthamiana. I risultati tipici dimostrano che HPF-QFS produce samples di qualità paragonabile a tradizionali HPF-FS in una frazione del tempo. Con aggiustamenti, questo protocollo può essere utilizzato anche per altri campioni biologici relativamente spessi.

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Protocollo

NOTA: La procedura QFS richiede estrema attenzione e cautela da parte dell'utente e che evidenziare queste precauzioni di sicurezza qui come attenzione e note ove applicabili.

1.Preparazione per HPF Run

1. Prima di iniziare la preparazione del campione, accendere il congelatore ad alta pressione seguendo le istruzioni del produttore.
   NOTA: L'unità HPF utilizzata in questo protocollo è una unità compatta Wohlwend 02 (Figura 1A), e ci vuole circa un a un'ora e mezzo di procedura di avviamento prima HPF corre può cominciare.
   1. Accensione del Wohlwend Compact 02 alta pressione Freezer.
      1. Accendere lo strumento ruotando l'interruttore principale da "0" a "1".
      2. Rilasciare l'aria compressa alla macchina.
      3. Rilasciare azoto liquido alla macchina.
      4. Premere il pulsante "sistema a secco UP".
      5. Dopo 30 minuti, premere il tasto "SYSTEM DRY UP "di nuovo il pulsante.
      6. Premere il tasto "ON / OFF" per accendere lo strumento.
      7. Premere il tasto "AZOTO".
      8. Attendere che la macchina si raffreddi per 20 minuti, anche se il "DRIVE IN" pulsante è già illuminato.
      9. Il "DRIVE IN" si accende.
      10. Premere il tasto "DRIVE IN" pulsante.
      11. Premere il pulsante "AUTO".
      12. Il "sistema READY" si accende.
      13. Inserire la sonda di temperatura e pressione nella camera di pressione e bloccarlo con il perno.
      14. Premere il tasto "JET AUTO". Questo passo verifica che l'aumento di pressione e la temperatura diminuiscono sono come desiderato; essenzialmente un giro di prova. Sharp gocce di temperatura e un forte aumento della pressione sono attesi (Figura 1B).
      15. Effettuare altre due cicli JET.

2 Preparazione per la ricng congelati Campioni

1. Riempire una scatola isolata contenente titolari esageratamente con azoto liquido (vedi Avvertenze per la sicurezza), in modo che i titolari sono completamente coperti (Figura 1C).
   NOTA: Utilizzare DPI compresi cryogloves e occhiali di protezione durante la manipolazione di azoto liquido.
2. Collocare il numero appropriato di flaconi contenenti del mezzo FS nei supporti in tubo d'alluminio in azoto liquido (Figura 1C). Con questo protocollo fino a quattro dischi ciascuno contenente un singolo campione può essere collocato in un unico esageratamente.
   NOTA: I flaconcini devono essere etichettati con un forte strumento come uno scriba diamantato e matita molto morbida.
   1. Per fissativo durante QFS utilizzare 1% OsO ₄ e il 0,1% di acetato di uranile in acetone ^9. Preparare la soluzione in grande volume, dispensare aliquote di 1,5 ml in cryovials e conservare congelati in azoto liquido.
      NOTA: Seguire le avvertenze di sicurezza per la gestione OsO ₄ e acetato di uranile.
      NOTA: OsO ₄ e acetato di uranile sono sostanze chimiche pericolose e devono essere maneggiati nella cappa indossando opportuni dispositivi di protezione individuale (DPI) tra cui scarpe-piantati chiuso, camice da laboratorio e guanti.
      NOTA: I cryovials utilizzati per contenere campioni per QFS dovrebbe avere un O-ring duramente per assicurare che i tubi restare sigillati durante il QFS per evitare perdite di OsO _4.
3. Preparare la pasta di lievito mescolando il lievito di birra con un uguale volume di circa il 10% di metanolo con uno stuzzicadenti o altro strumento fino a quando la pasta è liscia. Il lievito in pasta agisce come crioprotettore extracellulare e viene utilizzato per riempire lo spazio attorno al campione nel supporto del campione. La quantità di pasta dipende dal numero di campioni; per 10 campioni o meno la pasta (1 ml) possono essere miscelati in una provetta.

3 ad alta-pressione di congelamento dei campioni

1. Rimuovere una foglia (o di altri tessuti) di interesse dalla pianta e delicatamente posizionarlo su un pezzo di dentacera l o altra superficie di taglio. Utilizzare un punzone di 2,0 mm o dimensione desiderata per tagliare un campione di foglia. Maneggiare il campione delicatamente con un paio di pinze e lavorare il più rapidamente possibile.
2. Lavorare sotto un microscopio da dissezione, collocare il disco foglia nella parte 0.2 mm di tipo A supporto del campione e coprire completamente in pasta di lievito. Assicurarsi che il disco sia completamente piena e la pasta è a livello con il bordo del titolare problema rendendo l'impasto con un pennello fine (Figura 2).
3. Posizionare il vettore nel supporto del campione. Coprire il campione con il vettore campione di tipo B, superficie piatta verso il basso.
   NOTA: Il supporto del campione deve essere asciutto ed a temperatura ambiente.
4. Prendere campione portacampione, inserirlo nella macchina e avviare un ciclo di congelamento premendo il tasto "JET AUTO", che dovrebbe completare in un secondo o due.
5. Lavorare il più rapidamente possibile, rimuovere il supporto dalla macchina e posizionare la punta tenendo la sample in azoto liquido nella scatola isolata sulla parte superiore della macchina HPF. Immergere la punta delle due coppie di pinze in azoto liquido per raffreddare loro.
   NOTA: Dopo il congelamento, i vettori devono essere trattati solo con una pinza azoto raffreddato a liquido. Caldi (temperatura ambiente) pinze sono spesso la causa di fallimento in cryotechniques.
6. Aprire un esageratamente contenente il supporto FS, e posizionare il coperchio sul lato della scatola. Con l'aiuto di un paio di pinze azoto raffreddato a liquido, rimuovere delicatamente il disco dal supporto del campione, assicurandosi che il disco è sempre in azoto liquido o di vapore. Lavorare nel vapore di azoto liquido, tenere il tubo FS con una pinza pre-raffreddato e utilizzare l'altro per posizionare il supporto nel flacone FS. Avvitare il coperchio della fiala FS indietro. Non intrappolare qualsiasi azoto liquido nel flaconcino.
   NOTA: Durante il trasferimento dei campioni di cryovials per QFS, assicurarsi che nessun azoto liquido è intrappolato in fiale. L'azoto liquido si espande 700 volte durante il riscaldamento e qualsiasi Trapped azoto liquido può causare esplosioni durante questo tempo.
7. Ripetere i punti da 3.1 a 3.7 fino a quando tutti i campioni desiderati sono congelati. Dischi fogliari multiple contenenti lo stesso tipo di campione possono essere collocati nella stessa fiala. Si noti che il titolare del campione deve essere asciugato e portato a temperatura ambiente tra i funzionamenti di congelamento. Per fare questo in modo rapido, scaldare con un phon, e controllare la sua temperatura al tatto.

4 Preparazione Fermo Sostituzione

1. Immergere completamente il blocco riscaldatore in alluminio in azoto liquido per 10 minuti o fino a quando si ferma ebollizione nucleata. Mentre questo accade, uno strato di ghiaccio secco (1-2 cm) nel fondo del contenitore utilizzato come camera di FS (figura 3). Un contenitore di polistirolo o secchiello per il ghiaccio può essere utilizzato per FS, con ghiaccio o pellet secco schiacciato.
2. Inserire velocemente i cryovials contenenti i campioni con la sonda di temperatura nelle righe centrali del blocco riscaldatore. Accertarsi che i coperchi sulflaconi sono strettamente avvitati in modo che i media FS non fuoriesca durante FS. Iniziare la registrazione della temperatura.
   1. Effettuare la sonda di temperatura posizionando una termocoppia attraverso la parte superiore di un esageratamente in modo che raggiunga il fondo della provetta. Sigillare il coperchio del tubo con resina modo che non perda liquido fuori. Riempire la provetta con 1,5 ml di acetone all'inizio di ogni esecuzione QFS.
3. Utilizzando cryogloves isolati o grandi pinze, versare tutto l'azoto liquido dal blocco del riscaldatore. Fare attenzione a non versare i cryovials.
   NOTA: Utilizzare DPI compresi cryogloves e occhiali di protezione durante la manipolazione di azoto liquido.
4. Posizionare il blocco contenente le fiale sullo strato di ghiaccio secco nella camera QFS. Assicurarsi che il blocco viene posizionato in modo che i tubi sono distesi orizzontalmente, ma con una leggera inclinazione verso l'alto. Non ci dovrebbero essere perdite se vengono utilizzati i cryovials corretti.
5. Confezione camera QFS con ghiaccio secco in modo che i tubi FS sono coperti, anche se non è necessariocoprire la parte superiore del blocco. Posizionare il coperchio sulla camera.

5. rapida FS

NOTA: Eseguire la corsa QFS in una cappa aspirante nel caso in cui qualsiasi perdita di OsO ₄ si verifica involontariamente nonostante altre precauzioni.

1. Mettere camera QFS su una piattaforma agitatore rotante in una cappa aspirante e ruotare a 125 rpm per 120 min. Durante questo tempo la temperatura del blocco dovrebbe aumentare gradualmente fino a circa -80 ° C. L'agitazione assicura la miscelazione dei componenti per FS migliori.
   NOTA: Il posizionamento di shaker nella cappa e la posizione della porta cappa deve essere la stessa per tutta la procedura QFS e per ogni QFS gestite per garantire il riscaldamento costante di campioni.
2. Togliere il ghiaccio secco dalla camera e continuare l'agitazione per un'altra ora.
   NOTA: necessario aumentare la temperatura a circa -15 ° C a -20 ° C.
3. Rimuovere i campioni e sonda di temperatura dalla camera QFS e immettere sulagitatore a temperatura ambiente per un altro 10-15 minuti, fino a raggiungere la temperatura ambiente. Interrompere la registrazione della temperatura.
4. Durante FS, spegnere la macchina HPF.
   1. Chiudere il rubinetto del serbatoio di azoto liquido mentre la macchina HPF viene riempito con azoto.
   2. Premere il tasto "AZOTO".
   3. Attendere che le rosse "PISTONE DOWN" si spegne la luce.
   4. Premere il tasto "ON / OFF".
   5. Premere il pulsante "sistema a secco UP".
   6. Interrompere l'alimentazione di aria compressa alla macchina.
   7. Dopo un minimo di 12 ore (per garantire l'essiccazione di umidità), spegnere la macchina portando l'interruttore principale da "1" a "0".

6 post FS Processing

1. Rimuovere con cautela il supporto FS con pipette di plastica e posto in apposito contenitore per rifiuti tossici.
   NOTA: OsO ₄ e acetato di uranile sono sostanze chimiche pericolosee deve essere maneggiato nella cappa indossando opportuni dispositivi di protezione individuale (DPI) tra cui scarpe-piantati chiuso, camice da laboratorio e guanti.
2. Campioni Lavare quattro volte con il 100% di acetone. Raccogliere i primi due lavaggi e posizionare nel contenitore rifiuti tossici.
3. Utilizzando una pinza sottile, togliere i campioni di tessuto dai titolari. Conservare i campioni bagnato con acetone come questo è fatto, e lavorare molto delicatamente per evitare la rottura dei campioni.
   NOTA: Non è insolito e può effettivamente essere utile avere la pasta di lievito cadono lontano dai campioni a questo punto. La pasta lievito è di solito marrone molto scuro, mentre il tessuto foglia è ancora verde.
4. Raccogliere i campioni in cryovials contenenti acetone. Procedere con la preparazione del campione (infiltrazione e embedding) per TEM secondo i protocolli usuali.

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Risultati

I risultati presentati di seguito sono stati ottenuti utilizzando un Wohlwend Compact 02 per HPF (Figura 1A). Uno dei principali vantaggi di questo strumento è la facilità di utilizzo dei vettori dei campioni e dei suoi titolari. Quando si utilizzano altri strumenti, McDonald raccomanda che due utenti devono effettuare la preparazione del campione e HPF, una preparazione dei campioni, mentre l'altro fa il congelamento e trasferimento FS cryovials ^9. Tuttavia, il Wohlwend provino vettori...

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Discussione

Il successo del protocollo presentato qui dipende molto l'utente. In primo luogo, una preparazione avanzata è necessaria per garantire che tutti i materiali necessari sono facilmente disponibili e in quantità sufficiente per completare un intero run HPF-QFS. In secondo luogo, l'utente deve lavorare velocemente, passando da passo-a-passo in modo efficiente che minimizza la manipolazione del campione, riducendo così al minimo i cambiamenti allo stato nativo del tessuto. Una volta che i campioni sono congelati e...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 ml	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs