Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Riepilogo

Recording Ca²⁺ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca²⁺ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Abstract

Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido. Potenziale d'azione guidato afflusso di Ca ^{2 +} nel terminale presinaptico, attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (VGCCs) situati nella membrana faccia rilascio, è l'innesco per fusione della vescicola e il rilascio dei neurotrasmettitori. Fondamentale per la rapidità di trasmissione sinaptica è la sincronia spaziale e temporale tra l'arrivo del potenziale d'azione, VGCCs e macchinari rilascio dei neurotrasmettitori. La possibilità di registrare direttamente Ca ^{2 +} correnti dalla membrana di rilascio volto dei singoli terminali presinaptici è indispensabile per una precisa comprensione del rapporto tra presinaptica Ca ^{2 +} e il rilascio dei neurotrasmettitori. L'accesso alla membrana di rilascio presinaptico viso per la registrazione elettrofisiologica non è disponibile nella maggior parte dei preparati e Ca ^{2 +} presinaptico voce è stata caratterizzata mediante tecniche di imaging e macroscopica MeasureMe attualenti - tecniche che non hanno risoluzione temporale sufficiente per visualizzare Ca ^{2 +} voce. La caratterizzazione di VGCCs direttamente presso i terminali presinaptici singoli non è stato possibile in sinapsi centrali ed è stato finora realizzato con successo soltanto nel calice-tipo sinapsi del ganglio ciliare pulcino e in calici di ratto. Abbiamo affrontato con successo questo problema nella sinapsi reticulospinal gigante del lampreda midollo spinale attraverso lo sviluppo di una preparazione acutamente dissociata del midollo spinale che produce isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali prive di strutture di post-sinaptici. Possiamo fluorescente etichettare e identificare i singoli terminali presinaptici e loro destinazione per la registrazione. Utilizzando questa preparazione, abbiamo caratterizzato VGCCs direttamente in faccia rilascio dei singoli terminali presinaptici utilizzando approcci di immunoistochimica e di elettrofisiologia. Ca ^{2 +} correnti sono stati registrati direttamente al rilascio viso membrana of singoli terminali presinaptici, il primo di tali registrazioni da effettuare a livello delle sinapsi centrali.

Introduzione

Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido e preciso. Azione potenziale invasione del terminale presinaptico porta all'apertura dei VGCCs situati nella membrana di rilascio viso, il conseguente aumento della presinaptico Ca ^{2 +} che funge da innesco per la fusione della vescicola e neurotrasmettitore rilascio ^1. Tutti questi passaggi si verificano all'interno di centinaia di microsecondi ^2, e quindi richiedono accoppiamento spaziale stretto VGCCs alle macchine di fusione delle vescicole ^3. Presinaptici Ca ^{2 +} flussi sono stati caratterizzati principalmente attraverso approcci di imaging utilizzando Ca ^{2 +} coloranti sensibili ^4. Integrare Ca ^{2 +} buffer che modulano Ca ^{2 +} nei neuroni presinaptici è stato utilizzato per caratterizzare indirettamente il rapporto tra calcio presinaptico e neurotrasmissione ^3. Inoltre, modulando la presinaptico libera Ca ^{2 +} concentrazione da uncaging Ca ^{2 + 5} o registrazione macroscopic Ca ^{2 +} correnti sono stati utilizzati in combinazione con misure di fusione della vescicola e / o rilascio; quali misure di capacità ^{di 6} o postsinaptici ² risposte per affrontare la stessa domanda. Tuttavia, caratterizzando Ca ^{2 +} correnti direttamente in faccia rilascio, la sezione specializzata della membrana presinaptica dove depolarizzazione della membrana viene tradotto in Ca ^{2 +} correnti di attivazione sinaptica fusione delle vescicole e il rilascio dei neurotrasmettitori, è parte integrante di ottenere una misura precisa del Ca ^{2 +} requisito per la fusione delle vescicole sinaptiche. Inoltre, la capacità di caratterizzare direttamente Ca ^{2 +} correnti a singoli terminali presinaptici, accoppiato con misure simultanee accurate di fusione della vescicola e rilascio permette una spiegazione precisa della relazione temporale tra l'andamento temporale del potenziale d'azione, presinaptico Ca ^{2 +} corrente, fusione della vescicola e rilascio. L'accesso alla membrana di rilascio visonon è disponibile nella maggior parte dei terminali presinaptici dovuti a chiudere apposizione da parte dei dendriti postsinaptici. Questa inaccessibilità è stato un grande ostacolo nella caratterizzazione di VGCCs quanto impedisce misure dirette di corrente a singoli terminali presinaptici. Caratterizzazione diretta di presinaptici Ca ^{2 +} correnti a singoli terminali presinaptici non è finora stato possibile in sinapsi centrali ed è stato raggiunto solo in due terminali presinaptici di tipo caliceale; calice-tipo sinapsi delle pulcino ganglio ciliare ^7-10 e ratto calici ^11,12. In tutti gli altri terminali presinaptici tra cui la sinapsi reticulospinal gigante nella lampreda midollo spinale ^13, la mancanza di accesso alla membrana di rilascio volto presinaptica ha reso necessario l'utilizzo di approcci indiretti come Ca ^{2 +} di imaging per studiare presinaptici Ca ^{2 +} flussi.

Figura 1 Lampreda gigante sinapsi reticulospinal. (A) Sezione di lampreda midollo spinale che indica l'orientamento dorso-ventrale. Assoni reticulospinal sono contrassegnati dall'asterisco verde. (B) 3-D ricostruzione della sinapsi reticulospinal nella lampreda midollo spinale che mostra presinaptico assone reticulospinal facendo numerosi en passant contatti (contrassegnato da frecce verdi) sul neurone postsinaptico ^13. Terminali presinaptici sono stati etichettati con Alexa Fluor 488 hydrazide falloidina coniugato (verde), mentre il neurone postsinaptico è stato riempito con Alexa Fluor 568 hydrazide (rosso).

Lampreda assoni giganti reticulospinal, situato nella regione ventrale del midollo spinale parallelo al rostrale-caudale asse Figura 1a, forma multipla en passant contatti sinaptici sui neuroni delspinale corno ventrale ¹⁴ Figura 1b ^13. Whole-cell macroscopica Ca ^{2 +} correnti sono state registrate da assoni reticulospinal nel midollo spinale intatto ^13,15. Tuttavia, precedenti tentativi ciechi a misura diretta di Ca ^{2 +} correnti in assoni reticulospinal nel intatta lampreda midollo spinale utilizzando cellule-attached tecnica del patch clamp hanno provato senza successo ¹³ a causa della mancanza di accesso alla membrana presinaptica rilascio volto a causa dei processi di postsinaptici opposte Figura 1b. La membrana di rilascio volto è stato in precedenza reso accessibile dalla rimozione del neurone postsinaptico ^11, perturbazione meccanica della sinapsi prima di registrare ¹² o trattamento enzimatico accoppiato con dissociazione meccanica ^16. Data la complessa organizzazione del midollo spinale, che si sarebbe rivelato estremamente difficile identificare il neurone postsinaptico e ritrarre meccanicamente o perturbare the sinapsi. Quindi, abbiamo deciso di utilizzare il trattamento enzimatico ¹⁷ seguita da dissociazione meccanica.

Usando questo approccio, abbiamo sviluppato una preparazione acutamente dissociata della lampreda midollo spinale che produce vitali isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali privi di qualsiasi processo post-sinaptici, fornendo così un accesso illimitato ai singoli terminali presinaptici. In combinazione con un microscopio invertito e standard di imaging di fluorescenza, che ci permette di identificare e indirizzare i singoli terminali presinaptici fluorescenti-identificato, con una pipetta di patch contenente una soluzione di registrazione che isola Ca ^{2 +} correnti figura 4c e 4d figura, per la registrazione utilizzando cellulo- allegato tecnica voltage-clamp. Ca ^{2 +} correnti sono state registrate direttamente a livello della membrana presinaptica del rilascio volto dell'individuo terminali presinaptici figura 4f. Questo è un significant passo avanti nel campo della trasmissione sinaptica poiché è la prima di tali registrazioni da effettuare in sinapsi centrali.

Protocollo

1 Preparazione di Poly-D-lisina Hydrobromide

1. Preparare 1 mg / ml di poli-D-lisina bromidrato in 0,1 M tampone borato (pH 8,5).
2. Aliquota e conservare a -20 ° C.

Rivestimento 2 Poly-lisina di vetrini

Nota: Eseguire tutte le operazioni di pulizia e di rivestimento in una camera di flusso laminare.

1. Luogo coprioggetto in una capsula di Petri contenente 1 N acido cloridrico (HCl) per 2 ore.
2. Aspirare tutto HCl e risciacquare con il 70% di etanolo (EtOH) 2-3x.
3. Lasciare in 70% EtOH per 1 ora.
4. Aspirare tutto il 70% EtOH e risciacquare con il 100% EtOH 2-3x.
5. Lasciare in 100% EtOH per 2 ore. Aspirare tutto EtOH.
6. Asciugare con carta da filtro e asciugare all'aria per pochi secondi.
7. Luogo O / N in 1 mg / soluzione poli-lisina ml.
8. Sciacquare coprioggetto giorno dopo con acqua Millipore 4-5x.
9. Aria secca poli-lisina rivestite coprioggetto su rulli di vetro in un piatto pulito Petri.
10. Per immunohistochemistry, utilizzare 35 x 10 mm Petri coperchi piatto. Preparare sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) fiancheggiata piatti versando PDMS (elastomero e induritore 10: 1 in peso) nella capsula ad uno spessore di 0,3 cm, permettono di fissare a 30 ° CO / N. Una volta che questo è impostato, tagliare 2 cm di 1 cm incastonate nelle PDMS. Pulire e ricoprire il riquadro con poli-lisina seguendo la stessa procedura di cui sopra per coprioggetto.
11. Conservare coprioggetti e piatti rivestiti di poli-lisina coperti all'interno della camera a flusso laminare fino al momento dell'uso (fino a 2 settimane, ma ottenere i migliori risultati adesive preparando periodicamente ogni 3-4 giorni).
12. Preparare un blocco PDMS, al pin del midollo spinale nel affettatrice tessuto vibrante. Mix Elastomero Elastomero A e B 1: 1 in peso. Versare in una piastra di Petri di 100 x 15 mm e permettono di impostare O / N a 30 ° C. Tagliare un pezzo rettangolare di PMDS e la colla alla piastra di base per affettare con colla epossidica. Lasciare che la colla per impostare fissa i PDMS in atto e affettare più sezioni sottili sulla superficie per ottenere un appartamentosuperficie al pin del tessuto su.

3. acuta dissociazione della Lampreda Spinal Cord cedere isolati reticulospinal assoni

1. Anestetizzare un ammoecoete o adulto lampreda (Petromyzon marinus) con tricaine metansulfonato (MS-222, 100 mg / L). Aggiungere anestetico in acqua, in una tazza di plastica coperto da un coperchio, contenente la lampreda di essere sacrificato.
2. Decapitare lampreda a freddo (4 ° C), soluzione di Ringer avente la seguente composizione (in mM): 130 NaCl, 2.1 KCl, 2,6 CaCl _2, 1.8 MgCl _2, 4 HEPES, 4 destrosio (pH 7.6, osmolarità 270 mOsm) e rimuovere il corpo muscoli della parete per esporre la superficie dorsale del midollo spinale.
3. Rimuovere meninge primitiva dalla superficie dorsale del midollo spinale con una pinza sottile. Non rimuovere ventrale meninge primitiva in questa fase.
4. Tagliare midollo spinale in 1 cm di lunghezza pezzi.
5. Pin un pezzo del midollo spinale utilizzando sottili perni di insetti, lato dorsale rivolta verso l'alto, su un PDMS affettare pla di base foderatote (vedi 2.12) in un tessuto vibrante camera di affettatrice contenente soluzione ghiacciata di Ringer.
6. Rimuovere una sezione centrale della colonna dorsale del midollo spinale mediante tranciatura lungo l'asse rostro-caudale con la lama, lasciando intatte le sezioni di colonna dorsale sul rostrale e caudale finisce per servire come maniglie durante il processo di dissociazione Figura 2a e la Figura 2b. Utilizzare l'impostazione più lenta della velocità che permette affettare e un ambiente profondità che rimuove solo la colonna dorsale lasciando sottostante colonna assone reticulospinal Figura 2b non danneggiato.
7. Incubare pezzi del midollo spinale a fette a temperatura ambiente per 45 minuti in un cocktail di 1 mg / proteasi ml (tipo XIV da Streptomyces griseus) e 1 mg / collagenasi ml di preparato (tipo IA da Clostridium histolyticum) in soluzione di Ringer (adattato da El Manira & Bussières 1997 17).
8. Pezzi del midollo spinale Pin enzimi trattati con perni sottili in un PDMS allineati Petri dish Contavorazio freddo (4 ° C), soluzione di Ringer.
9. Rimuovere ventrale meninge primitiva con una pinza sottile.
10. Tagliare tratti laterali del midollo spinale con una lama di bisturi a metà della sezione dorsale fette lasciando la colonna centrale di assoni reticulospinal intatti nel midollo spinale Figura 2d.
11. Mettere una goccia di olio di immersione sulla lente.
12. Posizionare il coprioggetto poli-lisina rivestito (figura 3a, pezzo superiore, rettangolo rosso) nella fessura della figura camera di registrazione 3 e applicare grasso per vuoto a tutti i bordi (spazio tra rettangoli rossi e blu in figura 3a, per facilitare un sigillo. Vite la parte superiore in posizione. Inserite la camera nel riquadro sulla piattaforma di registrazione.
13. Aggiungere la soluzione di Ringer nella camera di registrazione con una pipetta Pasteur.
14. Collegare il tubo di efflusso della bombola a pressione contenente soluzione antigelo per il tubo di ingresso del dispositivo di raffreddamento termoelettrico. Collegare il output tubo del dispositivo di raffreddamento termoelettrico al fine di ingresso della camicia di raffreddamento esterno e l'estremità di uscita al serbatoio Figura 3b.
15. Mettete un pezzo di midollo spinale in un momento in camera di registrazione e separare delicatamente il midollo spinale mantenendo lungo il vetrino in ogni momento utilizzando pinze rivestite in teflon fino assoni sono isolati Figura 2e e 2f Figura.
16. Portare la temperatura della soluzione di registrazione a 10 ° C facendo passare l'(azoto gassoso viene spinto nella bottiglia) pressurizzato soluzione antigelo (per spostamento), tramite il dispositivo di raffreddamento termoelettrico, attraverso la camicia di raffreddamento esterno della camera di Figura 3b registrazione.
17. Consenti assoni di recuperare per 1 ora posto dissociazione a 10 ° C.

Figura 2 Descrizione schematica del protocollo di dissociazione per l'isolamento degli assoni reticulospinal. (A) la rimozione della colonna dorsale. La freccia indica la direzione di taglio del tessuto. Le corna dorsali sono contrassegnati da l'alfabeto D (font color rosso), mentre le corna ventrali per l'alfabeto V (font color rosso). (B) colonna Dorsale rimosso nella porzione centrale del midollo spinale esponendo gli assoni reticulospinal (linee verdi ). Le corna ventrali, che rimangono intatti dopo il processo di taglio, sono contrassegnati da l'alfabeto V (font color rosso). (C) 45 min trattamento con proteasi e collagenasi enzimi cocktail (1 mg / ml). (D) Taglio delle vie laterali del midollo spinale; che indica la posizione, la direzione e la portata del taglio laterale. (e) dissociazione meccanica del midollo spinale. Le frecce indicano la posizione delle pinze e la direzione della forza di separazione durante la dissociazione. (F) representative esempio di dissociato preparazione assone reticulospinal. Le frecce verdi indicano le regioni di assoni reticulospinal acutamente dissociate, senza alcun processo post-sinaptici.

Figura 3 Schema di registrazione da camera per esperimenti di elettrofisiologia. Dimensioni previste sono in pollici. Rettangolo rosso mostrato nel diagramma basepiece (a) indica il posizionamento del coprioggetto nella scanalatura coprioggetto in basepiece. La regione tra il rettangolo rosso e blu, illustrato nel diagramma basepiece (a) è dove viene applicato il grasso alto vuoto. (B) mostra la camera di registrazione assemblato.

4. etichettatura e identificazione di terminali presinaptici con FM 1-43

1. Etichetta terminali presinaptici, incorporando FM 1-43 in vesicles durante synaptic eso-endocitosi durante l'alta K + depolarizzazione. Profumato preparato con 5 mM FM 1-43 (in soluzione 5 ml di Ringer contenente KCl 30 mM).
2. Profumato preparato con 1 mg / ml Advasep-7 (in 5 ml di soluzione di Ringer) per rimuovere l'eccesso di colorante FM) ^18.
3. Profumato preparazione con la soluzione di Ringer per 15 min a dilavamenti qualsiasi colorante Remant e la Advasep.
4. Immagine con 100 X obiettivo a immersione in olio (NA 1,25) su un microscopio a fluorescenza invertito, in combinazione con una fotocamera digitale CCD e acquisizione delle immagini software micromanager, utilizzando protocolli di imaging di fluorescenza standard.
5. Identificare i terminali presinaptici fluorescente a bersaglio per la registrazione Figura 4c e 4d Figura.

5. immunoistochimica di isolati reticulospinal assoni

1. Riempire piatto inserto (sezione Protocol 2.10.) Con bivalente-ione (Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} gratisSoluzione di Ringer.
2. Realizzare pipette di patch in una micropipetta estrattore P-87. Mettere una piccola quantità di colla sutura ad una estremità del kit di poli-lisina utilizzando una pipetta di patch (1,5 millimetri di vetro di diametro esterno) e di aspirazione (utilizzando un tubo in silicone 0,89 millimetri di diametro interno con una punta micropipetta fissato all'estremità di aspirazione).
3. Effettuare dissociazioni utilizzando la stessa procedura di cui alla sezione Protocollo 3 Figura 2. Posizionare un'estremità del midollo spinale sulla colla sutura e premere delicatamente con una pinza ad aderire con forza alla superficie. Mettere una goccia di colla sutura all'altra estremità del riquadro e allungare delicatamente il midollo spinale fino assoni sono dissociate e aderire l'estremità del midollo spinale libero trascinandola delicatamente sopra la colla sutura. Fissare in posizione da pressatura soffice verso il basso con le pinze.
4. Bivalente Libero scambio soluzione di Ringer con la soluzione regolare di Ringer da perfusione.
5. Consenti assoni di recuperare per 20 min dopo dissociation a 10 ° C.
6. Fissare assoni dissociate in 4% paraformaldeide (PFA) {preparato in tampone fosfato salino (PBS, (mm) 137 NaCl, KCl 2.7, Na ₂ HPO ₄ 10, KH ₂ PO ₄ 1.8, pH 7,4)} per 20 min. Filtrare la soluzione PFA prima dell'uso passando attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron.
7. Lavare il PFA mediante perfusione 0,1 M glicina (in PBS) per 10 min.
8. Incubare in 0,1% Triton-X (in PBS) per 10 min.
9. Lavare mediante perfusione PBS per 20 min.
10. Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 6 ore a 4 ° C.
11. Aggiungi in anticorpo primario per VGCC di interesse (1: 200 diluizione in PBS) e incubare per 20 ore a 4 ° C.
12. Lavare mediante perfusione PBS per 20 min.
13. Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 10 min a 4 ° C.
14. Aggiungi a anticorpo secondario (1: 400 diluizione in PBS) e incubare al buio per 2 ore a 4 ° C.
15. Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min.
16. Blocco con 1% di siero bovino Albumin (in PBS) per 20 min.
17. Aggiungi a Alexa Fluor 488 falloidina (5 unità / ml concentrazione di lavoro; magazzino preparato in metanolo 200 Unità / ml).
18. Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min.
19. Immagine con obiettivo a immersione 100X acqua sul microscopio confocale.

6. elettrofisiologiche di registrazione

1. Realizzare pipette di patch di vetro alluminosilicato (resistenza pipetta 2-5 MW) in una micropipetta estrattore P-87. Progettazione di patch pipetta in modo che la punta della pipetta abbraccia tutto il diametro del terminale presinaptico.
2. PDMS pipette di patch cappotto immergendo la pipetta di patch sotto pressione 50-60 psi in PDMS ²³ (allegare un tubo di silicone, 0,89 millimetri di diametro interno, collegato ad una bombola di gas di azoto, al back-end della pipetta di patch) e asciugare con un calore pistola. In alternativa, cappotto manualmente la pipetta con PDMS, applicando il rivestimento più vicino alla punta più possibile, sotto un microscopio composto.
3. Fuoco pipette di patch smalto utilizzando un microforge (un filamento di platino su misura montata sul palco di un microscopio composto).
4. Identificare assoni isolate dimostrano terminali presinaptici etichettati da microscopia a fluorescenza.
5. Riempire soluzione di registrazione (progettata per isolare Ca ^{2 +} correnti; 10 mM CaCl ₂ o 90 mm ​​BaCl ₂ come portatori di carica, tamponata con HEPES pH 7,6, osmolarità 270 mOsm) nella pipetta di patch con una siringa.
6. Inserire la pipetta di patch nel supporto pipetta e la posizione sopra il bagno utilizzando un manipolatore MP225 motorizzato. Abbassare delicatamente la pipetta di patch nel bagno e la posizione contro la faccia di un terminale presinaptico fluorescente identificato.
7. Anticipo la pipetta di patch lentamente fino di contatto con la membrana. A questo punto, ottenere una tenuta gigaohm da aspirazione delicata bocca attraverso un tubo collegato al titolare pipetta.
8. Per ottenere i bassissimi livelli di rumore di fondo necessarie per la registrazione di singolo canale Ca ^{2 +} correnti, utilizzare un Axopatch 200B con un headstage raffreddata per le registrazioni. Dati campione a 20-50 kHz e filtro con un filtro di Bessel 5 kHz. Eseguire l'acquisizione di dati tramite un Axograph X.
9. Utilizzare un protocollo standard di passo, in incrementi di 10 mV come stimolo. Incorporare un pre-impulso nel protocollo, che precede il protocollo passo, al fine di garantire l'attivazione massima di canali del Ca ^{2 +.} Incorporare un 10 mV perdita passo verso il protocollo step per la post-analisi sottrazione delle correnti di fuga.

Risultati

Questo produce protocollo dissociazione sani e funzionali isolate assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia conservano terminali presinaptici funzionali capaci di vescicole sinaptiche evocate eso-ed endocitosi Figura 4c e 4d Figura. Sezioni delle regioni isolate degli assoni reticulospinal possano essere chiaramente identificati al microscopio ottico per essere chiari di altri processi neuronali che consentono l'accesso...

Discussione

Il nostro protocollo dissociazione è significativa cedendo isolati assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia mantengono funzionale presinaptica terminali Figura 4c e 4d Figura. L'assenza di processi di post-sinaptici che si oppongono al terminale presinaptico registrazione consente l'accesso diretto alla membrana di rilascio presinaptico faccia a terminali presinaptici singoli, in precedenza non possibile in sinapsi cent...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm Syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22 x 60 mm Coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100 x 15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35 x 10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300,000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodies R-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces Griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Pressure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	14046230132
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon