Generazione di<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofi Utilizzando Transposon Mutagenesi

Riepilogo

Enterobacter sp. YSU cresce in glucosio sali minima quantità di terreno. Auxotrofi sono generati trasformandola con transposome che si inserisce in modo casuale nel genoma dell'ospite. Mutanti si trovano di replicazione delle piastre da medie complesso terreno minimo. Geni interrotti sono identificati da salvataggio e sequenziamento del gene.

Abstract

Prototrofici batteri crescono su M-9 sali minimi mezzo addizionato con glucosio (M-9 medio), che viene utilizzato come fonte di carbonio e di energia. Auxotrofi possono essere generati utilizzando un transposome. Il commercialmente disponibile, Tn 5 transposome -derived utilizzato in questo protocollo è costituito da un segmento lineare di DNA contenente una origine di replicazione γ R6K, un gene per la resistenza alla kanamicina e termina due sequenze mosaico, che servono come siti di legame trasposasi. Il transposome, fornito come un complesso proteico DNA / trasposasi, viene introdotta mediante elettroporazione nel ceppo prototrofici, Enterobacter sp. YSU, e si inserisce in modo casuale nel genoma di questo host. I trasformanti sono placcati in replica su Luria-Bertani agar piastre contenenti kanamicina, (LB-kan) e su piastre di agar M-9 medie contenenti kanamicina (M-9-kan). I trasformanti che crescono su piastre LB-kan, ma non su piastre M-9-kan sono considerati auxotrofi. Genomico purificatoDNA da un auxotroph è parzialmente digerito, legata e trasformato in un pir ⁺ Escherichia coli (E. coli) ceppo. L'origine di replicazione R6Kγ permette il plasmide di replicare in pir ⁺ E. ceppi di coli, e il marcatore di resistenza alla kanamicina consente per la selezione plasmide. Ogni trasformante possiede un nuovo plasmide contenente il trasposone affiancato dalla regione cromosomica interrotto. Sanger sequenziamento e il Local Alignment Search Tool di base (BLAST) suggeriscono una identità putativo del gene interrotto. Ci sono tre vantaggi nell'utilizzo di questa strategia mutagenesi transposome. In primo luogo, non si basa sulla espressione di un gene trasposasi dall'host. In secondo luogo, il transposome viene introdotto nel host di destinazione mediante elettroporazione, piuttosto che per coniugazione o trasduzione e quindi è più efficiente. In terzo luogo, l'origine di replicazione R6Kγ rende facile identificare il g mutatoene che è parzialmente recuperato in un plasmide ricombinante. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare i geni coinvolti nelle altre caratteristiche di Enterobacter sp. YSU o di una più ampia varietà di ceppi batterici.

Introduzione

Prototrofici batteri crescono in M-9 sali minimi terreno contenente glucosio (M-9 medio), la conversione del glucosio attraverso percorsi metabolici carbonio centrali per generare precursori, come amminoacidi, acidi nucleici e vitamine, per biosintesi ^1. M-9 terreno contiene cloruro di ammonio come fonte di azoto, sodio e fosfato di potassio come buffer e fonte di fosforo, solfato di magnesio come fonte di zolfo e glucosio come fonte di carbonio e di energia. Luria-Bertani (LB) mezzo è ricco di aminoacidi da tryptone e di vitamine e fattori di crescita da estratto di lievito. Esso supporta la crescita di auxotrofi che non possono sintetizzare aminoacidi, vitamine e altri fattori di crescita necessari per la crescita su M-9 medie. Così, prototrofi cresceranno in LB e M-9 medie, che auxotrofi cresceranno in terreno LB ma non in M-9 medie. Con l'introduzione di mutazioni in una popolazione prototrofici di batteri e di identificare geni mutati che causano fenotipi auxotrofi, è possible per ottenere una migliore comprensione del metabolismo in un ceppo batterico.

Transposon mutagenesi può essere utilizzato per identificare molti dei geni necessari per la crescita su glucosio nel M-9 medie. I trasposoni si inseriscono in modo casuale nel genoma dell'ospite ^2. Individuando trasformanti trasposoni su piastre di agar LB e replica li placcatura su piastre M-9 agar, è possibile selezionare per auxotrofi. Geni interrotti sono identificati attraverso il salvataggio del gene. Questo studio utilizza un Tn disponibile in commercio 5 -derived transposome che viene fornito come una soluzione di un segmento di DNA trasposone lineare mescolato con proteine ​​trasposasi. Il segmento di DNA manca un gene trasposasi, ma contiene un gene per la resistenza alla kanamicina, una origine di replicazione γ R6K e due motivi mosaico che sono sequenze di DNA per trasposasi vincolanti a ciascuna estremità del segmento ^3,4. Poiché la proteina trasposasi viene aggiunto direttamente al DNA, il segmento di DNA da solodefinito come il trasposone, e il complesso proteico DNA / trasposasi è definito come il transposome. Il transposome viene trasformato mediante elettroporazione ⁵ in un kanamicina ospitante sensibile (Figura 1A). Le colonie che crescono su piastre di agar LB contenenti kanamicina (LB-kan) hanno inserti di trasposoni (Figura 1B), e replica placcato trasformanti che non riescono a crescere su M 9-piastre di agar contenenti kanamicina (M-9-kan) sono auxotrofi (Figire 1C). DNA genomico da un mutante è purificata e parzialmente digerito con 4-base restrizione taglio endonucleasi, BFU CI (Figura 1D). Il DNA ligato si trasforma in un ceppo di Escherichia coli (E. coli) che contiene il gene pir (Figura 1E). Questo gene permette il nuovo plasmide contenente il trasposone e fiancheggiante regione cromosomica ospite di replicare in E. coli ^6. Il gene di resistenza alla kanamicina funge damarcatore eleggibile per il nuovo plasmide. Infine, sequenziamento usando primers complementari a ciascuna estremità del trasposone e Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Analisi ^7,8 della sequenza risultante viene utilizzata per determinare l'identità dei geni interrotti.

Questa strategia transposome mutagenesi offre tre vantaggi ^3. In primo luogo, poiché la proteina trasposasi è legato direttamente al trasposone, inserimento non dipende espressione del gene trasposasi all'interno dell'ospite. Una volta che il trasposone in sé incorpora nel genoma dell'ospite, la trasposasi è degradato, impedendo il movimento addizionale del trasposone. Tuttavia, il movimento supplementare non può essere evitata se l'host possiede un elemento endogeno Tn 5 traspositivo. In secondo luogo, l'introduzione del transposome mediante elettroporazione permette di utilizzarlo in un'ampia varietà di ospiti. Inoltre, elimina la necessità di introdurre il trasposone per coniugazione batterica o viinfezione ral. Entrambi i processi richiedono suscettibilità dell'ospite. Terzo, l'inserimento del gene per la resistenza alla kanamicina e l'origine di replicazione γ R6K nel transposome rende più facile identificare il gene interrotto. Regioni trasposone-interrotto possono essere memorizzati e sequenziati come plasmidi, eliminando la necessità di utilizzare la reazione a catena della polimerasi inversa (PCR) per l'identificazione del gene.

Il protocollo presentato in questo video descrive ogni passo per trasposone mutagenesi di Enterobacter sp. YSU ⁹ utilizzando un transposome dalla sua introduzione nelle cellule batteriche per l'identificazione del gene putativo è interrotto. Oltre ai protocolli precedentemente pubblicati ^3,4,10, metodi dettagliati per l'utilizzo di replicazione delle piastre per lo screening auxotrofi sono presentati. Questa tecnica di mutagenesi possono essere utilizzate per indagare altri fenotipi, quali antibiotici e metallo resistenze, in diversi tipi di batteri, per identcando il numero minimo di geni necessari per la crescita in condizioni di coltura definiti in studi di biologia sintetica, o per l'insegnamento di un componente di un laboratorio di genetica o corso di fisiologia microbica.

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Protocollo

1. elettroporazione di cellule competenti ^5,11

1. Diluire un O / N cultura LB di Enterobacter sp. YSU 1/20 in 50 ml di terreno LB fresco e crescere con agitazione a 120 rpm e 30 ° C ad un OD (600 nm) tra 0,4 e 0,6. Facoltativamente, crescere altri ceppi batterici alla loro temperatura di crescita ottimale.
2. Raffreddare le cellule in ghiaccio per 5 min e centrifugare a 4 ° C e 7.000 xg per 5 min.
3. Eliminare il surnatante, risospendere le cellule in 50 ml di acqua ghiacciata sterile e centrifugare a 4 ° C e 7.000 xg per 5 min. Ripetere questo passaggio.
4. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in un volume di acqua ghiacciata pari al volume pellet. Per la conservazione a lungo termine, lavare le cellule con 10 ml di ghiaccio freddo 10% (v / v) glicerolo, risospendere in un volume uguale di pellet di ghiaccio freddo 10% (v / v) glicerolo, conservare a -80 ° C, e disgelo in ghiaccio prima elettroporazione.
5. Aggiungere 0,5 ml di transposome a 40 ml dicellule. La soluzione transposome disponibile in commercio viene fornito ad una concentrazione di DNA di 0,33 mg / mL. Sebbene 0,33 mg è raccomandato, 0,165 mg DNA è sufficiente.
6. Posizionare la miscela di cellule / transposome in ghiacciata, 0,2 mm, elettroporazione cuvetta e toccare la miscela sul fondo della cuvetta. Shock le cellule a 25 uF, 200 Ω, e 2,5 kV. Al fine di garantire che le cellule rimangono refrigerati, memorizzare le cuvette elettroporazione in un freezer -20 ° C prima dell'uso.
7. Immediatamente, aggiungere 960 ml di filtro sterilizzati brodo eccellente ottimale con la repressione da cataboliti (SOC) di media. Mescolare pipettando su e giù e trasferire le cellule ad una sterile 1,5 ml provetta da microcentrifuga.
   NOTA: Le cellule iniziano a morire dopo lo shock, ma il sale nel mezzo SOC permette loro di recuperare. Per risparmiare, non è necessario aggiungere transposome o urti cellule di controllo negativo. Basta aggiungere 960 ml di mezzo SOC sterile ad esso.
8. Incubare le cellule a 30 ° C fo 45-60 min con agitazione a 120 rpm. Ciò fornisce il tempo per la transposome di ricombinarsi con il genoma ospite e per le celle di esprimere la resistenza alla kanamicina.
9. Distribuire 100 microlitri di cellule su una piastra di agar LB-kan e incubare la piastra di O / N a 30 ° C. Conservare la miscela trasformazione rimanente in frigorifero a 4 ° C. Stendere importi aggiuntivi in ​​un secondo momento fino a 2 settimane dopo l'elettroporazione iniziale, se necessario.

2. Gridding di trasformanti

1. Nastro una griglia al coperchio di un piatto 100 x 15 mm di Petri vuota. Copiare una griglia da "Un corso breve in Genetica batterica" ^​​12.
2. Tracciare una linea sul fondo di una piastra di agar LB-kan. Utilizzare un piccolo pezzo di nastro per ancorarlo al coperchio con griglia in modo che la griglia è visibile attraverso l'agar. Assicurarsi che la linea sulla parte inferiore della piastra è allineata con la parte superiore, centro della griglia. Ancoraggio del piatto con del nastro impedisce di scivolare, consentendo anche gridding. La linea facilita l'identificazione delle colonie dopo la replicazione delle piastre.
3. Scegliere un singolo trasformante con uno stuzzicadenti sterile e posto nel centro di un quadrato nella griglia. Basta toccare la colonia e il posto. Non scavare il stuzzicadenti nel agar. Per evitare di contaminare la piastra, gestire lo stuzzicadenti ad una sola estremità.
4. Spot altro trasformante in una casella adiacente come al punto 2.3. Quando la piastra è pieno, incubare O / N a 30 ° C. Questa è la piastra master.

3. Replica Plating determinare il fenotipo Auxotroph ¹²

1. Per ogni piastra che è stato grigliata; fare una pila di tre piastre di agar fresco numerati da uno a tre: uno per LB-kan, due per M-9-kan e tre per LB-kan. Essiccare le piastre a testa in giù, O / N a 37 ° C prima dell'uso.
2. Tracciare una linea sulla parte superiore di ciascuna piastra come al punto 2.2.
3. Pulire lo strumento replicazione delle piastre con il 70% di etanolo, posizionare un quadrato di velluto sterile in cima alla replicazione delle piastre diolo e bloccare la piazza velluto verso il basso. Le mani sono ricchi di microbi anche dopo il lavaggio loro. Evitare l'introduzione di contaminanti microbi gestendo la piazza velluto dal bordo.
4. Allineare la linea sulla piastra principale con una linea tracciata sul morsetto e posizionare la piastra di sopra del quadrato velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dalla piastra alla piazza velluto. Fare attenzione a non imbrattare i batteri. Rimuovere la piastra principale dalla piazza velluto.
5. Allineare la linea tracciata su una targa con la linea sulla pinza e posizionarlo sulla parte superiore della piazza velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dalla piazza velluto alla piastra. Rimuovere un numero di targa.
6. Eliminare la piazza velluto in un bicchiere di acqua e mettere un pulito, sterile, velluto piazza sullo strumento di replicazione delle piastre come descritto al punto 3.3. Questo passaggio impedisce over-inoculazione che causa la crescita svolta e dei risultati falsi positivi.
7. Allineare illine sul numero uno piastra con la linea sul morsetto e posizionarlo sulla parte superiore della nuova piazza velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri di targa uno alla piazza velluto. Rimuovere un numero di targa.
8. Allineare la linea tracciata sul numero due piastra con la linea sul morsetto e posizionarlo sulla parte superiore della piazza velluto. Applicare una leggera pressione per trasferire i batteri dalla piazza velluto di numero due piatto. Rimuovere numero due piatto.
9. Ripetere il punto 3.8 per il numero di targa tre. La terza piastra è un controllo per il trasferimento completo dalla piastra master agli altri due piastre. Eliminare la piazza velluto in un bicchiere d'acqua. Per riutilizzare le piazze di velluto, sterilizzare in autoclave il bicchiere contenente le piazze di velluto contaminati, lavarli, asciugarli, avvolgerli in un foglio di alluminio e li ri-sterilizzare in autoclave.
10. Incubare le piastre a 30 ° CO / N. Le colonie che crescono su entrambe le piastre di agar LB-kan, ma non riescono a crescere su piastre M-9-kan sono considerati auxotrofi ( Figura 2).
11. Streak fuori auxotrofi da un numero di targa su una piastra di agar LB-kan fresca e incubare la piastra a 30 ° CO / N.
12. Streak per isolamento 3 colonie dalla piastra striscia al punto 3.11 su una piastra LB-kan fresco. Incubare la piastra a 30 ° CO / N. Questo assicura che il mutante è ben isolato. Dividere il piatto in tre parti e strisciare fuori ogni colonia in una sezione.
13. Colonie Spot dalle colonie strisciate derivanti dal passaggio 3.12 su una piastra di LB-kan fresca per formare una griglia, come nei passaggi 2.1-2.4. Ogni mutante viene ri-testato in triplicato.
14. Replicare nuovo piatto come nei passaggi 3,1-3,10 per confermare il fenotipo auxotroph.

4. Gene Rescue

1. Grow 3 ml O / N di una coltura isolata colonia mutante dal punto 3.13 nel mezzo liquido LB-kan a 30 ° C. Purificare il DNA genomico da 1 ml di coltura usando un kit di purificazione del DNA genomico disponibile in commercio.
2. Impostare una miscela di 0.025 UBFU CI endonucleasi di restrizione e 14 microlitri di 1 mg / mL di DNA genomico in una reazione di 20 microlitri su ghiaccio. Poiché BFU CI taglia il trasposone a dodici siti diversi, può essere più efficiente utilizzare endonucleasi di restrizione, Bfa I o Hae III, che taglia il trasposone a due e tre siti diversi, rispettivamente.
3. Incubare la reazione a 37 ° C per 25 min e poi a 80 ° C per 20 minuti per inattivare l'enzima. Analizzare 3 ml di DNA parzialmente digerito su un gel di agarosio 0,8% (Figura 3). Un successo i risultati di digestione parziali in uno striscio di superiori a 10 kb fino al fondo del gel.
4. Legare 15 microlitri di DNA genomico parzialmente digerito con 800 unità di T4 DNA ligasi in una reazione 500 microlitri. Incubare la reazione di O / N a 4 ° C. Il volume di reazione ampio massimizza la legatura dei singoli frammenti a se stessi e minimizza le interazioni tra due o più frammenti di DNA.
5. Precipitazionite il DNA ligato aggiungendo 50 ml di 3 M acetato di sodio, pH 5,5, e 1 ml di etanolo al 95% e incubando è a -20 ° C per 20 min.
6. Microcentrifuga il DNA a 4 ° C e 13.500 xg per 10 min, lavare il pellet con il 70% di etanolo, asciugare in un concentratore a vuoto centrifuga, e risospendere in 10 ml di acqua priva di nucleasi. In alternativa, il DNA può essere essiccato all'aria a temperatura ambiente per 15 min.
7. Utilizzare 4 ml di DNA risospeso per trasformare E. coli ceppo ECD100D pir o ECD100D pir116 mediante elettroporazione come nel paragrafo 1. L'origine di replica γ R6k richiede un ceppo batterico con un gene pir per replicare ^6. I risultati di deformazione pir in plasmidi copia bassi, e il ceppo pir116 contiene un gene mutante pir che si traduce in plasmidi alta copia. Ogni trasformante contiene un nuovo plasmide con il trasposone e una regione del cromosoma interrotto (Figura 1E).
8. Inoculate 5 ml di terreno LB-kan con una singola colonia, crescere O / N con agitazione a 120 rpm e 37 ° C, e purificare DNA plasmidico dal / coltura intera O N utilizzando un kit commerciale.
9. Digest 14 ml di plasmide usando l'endonucleasi di restrizione Xho I. Assicurarsi che il volume finale della reazione è di 20 microlitri. Questo enzima riconosce un sito della metà del trasposone all'estremità 5 'del gene di resistenza alla kanamicina. Analizzare 10 ml di non digerito e digerito plasmide su un gel di agarosio 0,8% (Figura 3). Il plasmide è costituito dal 2 kb trasposone più accompagnamento DNA ospite.

Sequencing 5. DNA

1. Sequenza plasmide utilizzando un kit disponibile in commercio sequenziamento, primer che sono omologhe a ciascuna estremità del trasposone, e un sistema di analisi di sequenziamento capillare. In alternativa, il plasmide può essere spedito in un istituto esterno per il sequenziamento.
2. Utilizzare lo standard di peso molecolare (1 kb scala) inil gel di stimare le dimensioni del plasmide. Poi, stimare il numero di nanogrammi (ng) di plasmide che è necessario per il 50 fmol.
3. Misurare la concentrazione del DNA plasmidico utilizzando uno spettrofotometro a lunghezze d'onda di 260 nm (A ₂₆₀₎ e 280 nm (A _280). Assicurarsi che la lunghezza del percorso della luce attraverso la cuvetta è di 1 cm. Determinare la concentrazione moltiplicando l'assorbanza a 260 nm da 50 ng / ml. Alta qualità DNA plasmidico avrà un A ₂₆₀ / A ₂₈₀ Rapporto tra 1,8 e 2,0.
4. Il volume di DNA richiesto per ogni reazione di sequenziamento è il numero di ng necessario per il 50 fmol divisa per la concentrazione del plasmide. Mescolare il volume del plasmide richiesto con acqua per portare il volume totale di 10 microlitri.
5. Riscaldare la miscela di DNA plasmidico / acqua a 96 ° C per 1 min e poi raffreddare a temperatura ambiente.
6. Aggiungere 8 ml di master mix dal kit di sequenziamento e 2 ml di 1,6 mM di uno dei primer di sequenziamento.
7. Folbasso il protocollo del kit di sequenziamento per il programma termociclatore e la reazione di pulizia.
8. Analizzare ogni campione utilizzando un sistema di analisi del DNA capillare.
9. Utilizzare un pacchetto software disponibile in commercio per visualizzare la sequenza del DNA. Ricercare la sequenza "5'-GAGACAG-3 '", che è l'ultimo 7 bp del trasposone (Figura 4). La sequenza prima estremità 5 'di questo segmento 7 bp appartiene al trasposone. La sequenza dopo all'estremità 3 'di questo segmento 7 bp appartiene al gene interrotto.
10. Determinare la possibile funzione del gene interrotto utilizzando il Local Alignment Search Tool (BLAST) ^7,8 di base. Utilizzare la seguente link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Incollare la sequenza di interrupted gene nella casella di ricerca, selezionare "Altro" sotto la base di dati e clicca su "BLAST" in fondo alla pagina. Quando viene visualizzato il risultato, scorrere la pagina per visualizzare i risultati di allineamento (Figura 5).

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Risultati

Trasformazione di Enterobacter sp. YSU mediante elettroporazione con il transposome avviato inserimento genoma casuale nel genoma dell'ospite (Figura 1A, B). Un elettroporazione di successo ha prodotto diverse migliaia di trasformanti che crescono su piastre LB-Kan. Per ottenere 300-400, colonie per piastra ben distanziati, la quantità di trasformazione miscela diffusione su ciascuna piastra di agar LB-kan è stato ottimizzato. Ogni trasformante conteneva almeno un inserto trasposoni, ma n...

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Discussione

Mutagenesi trasposone utilizzando un transposome è uno strumento efficace per la generazione di auxotrofi in Enterobacter sp. YSU e altri tipi di Gram-negativi e batteri Gram-positivi ^3,4. Il processo è stato avviato con l'introduzione della Tn 5 transposome -derived nell'ospite mediante elettroporazione. Per identificare colonie con inserti, il ceppo di destinazione non trasformata doveva essere sensibili alla kanamicina per la selezione per il marcatore di resistenza portata dal ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentre (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate	Amresco, Inc.	0408-25G	When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate	Amresco, Inc.	0643-1KG
Yeast Extract	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium			0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I	NEB	R0636S	Partial digestion of genomic DNA
Xho I	NEB	R0146S	Plasmid digestion
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Nuclease Free Water	Amresco, Inc.	E476-1L	For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Promega	A1460	Plasmid purification
Replica Plating Block	Thermo Fisher	09-718-1
Velveteen Squares	Thermo Fisher	09-718-2	Replica plating
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grid for replica plating
Petri Dishes	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator	Labconco	7970010	Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System	Beckman Coulter		DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	DNA sequence analysis