Monitoraggio della sistemici e epatica parametri emodinamici nei topi

Riepilogo

Questo film dimostra come acquisire l'emodinamica sistemica e epatici nei topi. L'intero controllo comprende l'acquisizione dei parametri vitali, pressione sanguigna sistemica, pressione venosa centrale, portata arteria epatica comune, e di pressione della vena porta e la portata portale in topi.

Abstract

L'uso di modelli murini di ricerca sperimentale è di enorme importanza per lo studio della fisiologia epatica e disturbi fisiopatologici. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni del mouse, dettagli tecnici della procedura di controllo intraoperatorio adatto per il mouse sono stati raramente descritti. In precedenza abbiamo riportato una procedura di controllo per ottenere i parametri emodinamici per i ratti. Ora, abbiamo adattato la procedura per l'acquisizione dei parametri emodinamici sistemici e epatici nei topi, una specie dieci volte più piccolo di ratti. Questo film dimostra la strumentazione degli animali così come il processo di acquisizione dei dati necessari per valutare l'emodinamica sistemica ed epatico nei topi. Parametri vitali, tra cui la temperatura corporea, la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca sono state registrate durante l'intera procedura. Parametri emodinamici sistemici consistono di pressione carotidea (PAC) e la pressione venosa centrale (CVP). Parametri di perfusione epatica includono portale vpressione ein (PVP), portata portale, nonché la portata dell'arteria epatica comune (tabella 1). Strumentazione ed acquisizione dati per registrare i valori normali sono stati completati entro 1,5 ore. Parametri emodinamici sistemici ed epatico sono rimaste entro i valori normali durante questa procedura.

Questa procedura è impegnativo ma fattibile. Abbiamo già applicato questa procedura per valutare l'emodinamica epatica in topi normali, così come durante il 70% epatectomia parziale e nel lobo epatico di serraggio esperimenti. PVP media dopo la resezione (n = 20), era 11,41 ± 2,94 cm H ₂ O, che era significativamente più elevata (p <0.05) rispetto a prima resezione (6,87 ± 2,39 cm H ₂ O). I risultati del lobo epatico di serraggio esperimento hanno indicato che questa procedura di controllo è sensibile e adatto per rilevare piccole variazioni nella pressione portale e portata portale. In conclusione, questa procedura è affidabile nelle mani di un micro-chirurgo esperto, ma dovrebbe essere limitato a experiments in cui sono assolutamente necessari i topi.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo video è stato quello di dare prova di una procedura di monitoraggio in tempo reale per l'acquisizione di parametri emodinamici sistemici ed epatico. Il razionale per lo sviluppo di questa procedura è il suo grande valore per gli interventi sperimentali nei topi che richiedono l'ottenimento di parametri emodinamici sistemici ed epatico. La procedura può essere applicata agli animali naïve e durante o dopo un determinato intervento chirurgico sperimentale epato-biliare, come epatectomia parziale, legatura della vena porta e il trapianto di fegato.

Acquisizione dei dati emodinamici epatici nei roditori richiede la procedura invasiva proposta. Perfusione epatica non può essere ottenuto in modo non invasivo. Tuttavia, ci sono alternative per l'acquisizione della pressione arteriosa sistemica. Tecniche di monitoraggio come la tecnica bracciale coda ⁸ sono stati utilizzati per l'acquisizione della pressione arteriosa in entrambi i ratti e topi. La tecnica bracciale coda può essere applicato in ben fatanimali unità organizzative. Quando la misurazione della pressione sanguigna, l'animale deve essere posizionato e fissato in una posizione scomoda specifico. Nel manuale del dispositivo di coda-bracciale, il produttore dichiara che i topi possono diventare nervosi e stressati che possono diminuire la circolazione nella coda. In tale circostanza, la pressione del sangue periferico acquisito nella coda può essere molto inferiore rispetto alla pressione arteriosa centrale.

La procedura di controllo completo è stato eseguito con un monitor multicanale integrato utilizzando una serie di sensori di acquisizione dati. La pressione sanguigna è stata ottenuta con l'inserimento di un catetere nel rispettivo recipiente dopo un'attenta dissezione microchirurgica e l'esposizione al microscopio. La portata è stata misurata posizionando una sonda di flusso transonico attorno a ciascuna nave.

Abbiamo già segnalato una simile procedura di monitoraggio intraoperatorio per i ratti con conseguente una serie completa di dati fisiologici emodinamici comparabili a singlE i dati riportati da altri gruppi di ^7. Pertanto abbiamo considerato questa procedura per rappresentare una buona base per il suo adeguamento al mouse, una specie 10 volte più piccolo del ratto. La differenza fondamentale alla procedura ratto è l'uso di cateteri Millar per acquisire dati sulla pressione sanguigna invece di un sistema di catetere fluidodinamica. Dati di flusso sono stati acquisiti con sonde di flusso transonico, solo quelli molto più piccoli che per i corrispondenti vasi di ratto.

A causa delle piccole dimensioni dell'animale, strumentazione di topi è tecnicamente impegnativo, ma fattibile. Una volta che la strumentazione è completata, l'acquisizione dei dati e l'analisi dei dati primari vita è semplice, dal momento che un file di impostazione predefinita può essere utilizzato. Il file di impostazione deve essere definita una volta all'inizio di una serie di esperimenti e può essere immagazzinato e utilizzato per tutti gli esperimenti successivi.

Fino ad ora abbiamo applicato questa procedura per valutare gli effetti emodinamici epatici negli esperimenti acuti. Abbiamo misurato CAP e PVP prima e subito dopo il 70% epatectomia parziale (PH) e nel bloccaggio / bloccaggio de-gli esperimenti. Abbiamo bloccato il legamento epato-duodenale del lobo destro che rappresenta il 20% del fegato massa seguita da breve (5min) di bloccaggio del lobo mediano e laterale sinistro che rappresenta totalmente il 90% della massa epatica. De-bloccaggio iniziato con rilasciando il morsetto dal lobo destro seguito da liberare la mediana e il lobo laterale sinistro. Tempo di serraggio massima era inferiore a 10 min.

Protocollo

Housing e tutte le procedure eseguite sono in conformità con la legislazione tedesca Animal Welfare.

1 Sensori di calibrazione (Seguire le istruzioni del produttore per la taratura dei sensori)

1.1) la calibrazione del catetere Millar. Pre-immergere la punta del catetere in acqua sterile o soluzione salina per 30 minuti prima di bilanciare (azzeramento) e la calibrazione.

1. Collegare il sensore Millar al canale millar1 di ponte amplificatore e inserire la punta del sensore Millar nella colonna d'acqua.
2. Impostare il valore della colonna d'acqua a 0 cm H ₂ O. Nella finestra del software di analisi dei dati, scegliere il ponte amplificare e azzerare esso. Il valore di riferimento 0 cm H ₂ O può essere impostato.
3. Impostare il valore della colonna d'acqua di 20 cm H ₂ O. Esegui avanzamento finestra del software di analisi dei dati, e stop. Scegli "unità" nella finestra di ponte amplificare, impostare la linea di base di 0 e 20 cm H ₂ O di conseguenza. Regolare l '"unità" per cmH _{2 O.}
4. Calibrare il millar2 per la misurazione della PAC allo stesso modo (impostare due linea di base 90 e 110 cm H ₂ O).

1.2) Calibrazione sonda flusso sanguigno

1. Mettere la sonda in acqua deionizzata. Collegare la sonda con transonico sistema sonda di mandata.
2. Nella finestra del software di analisi dei dati, scegliere Input amplifica a zero la sonda di mandata. Regolare le unità.
3. Premere il pulsante di "canale di test" per raccogliere il segnale: se il segnale ha 3-4 bar, significa che il segnale è buono. Nel caso in cui un buon segnale viene acquisito, la procedura può essere continuata.
4. Premere il pulsante di "canale zero" e il canale di scala per vedere se il valore è stato calibrato o no.
5. Premere il pulsante di "canale di misura" per la misurazione successiva.

2 Preparare il mouse per la procedura chirurgica

1. Posizionare il mouse in una camera di induzione e anestetizzare il mouse con il 2% isoflurano e0,3 ml / min di ossigeno. L'operazione può essere eseguita se la convergenza pizzico ritiro riflesso del mouse è assente.
2. Accorciare il pelo delle regioni chirurgici, tra cui il collo sinistro e l'addome.
3. Posizionare il mouse sulla tabella operazione e fissarla con nastri. Utilizzare veterinario unguento sugli occhi per prevenire la secchezza durante il periodo di funzionamento.
4. Inserire un cuscino garza sotto il collo per l'esposizione ottimale del campo operatorio di collo.
5. Disinfettare il campo di funzionamento e posizionare garze sterilizzate per coprire il mouse solo lasciando il campo operatorio aperto.

3. parametri vitali di misura

1. Inserire gli aghi ECG per via sottocutanea nelle zampe del topo.
2. Posizionare il sensore respiratorio sotto la parte posteriore del mouse.
3. Posizionare la sonda di temperatura nel retto del mouse.
4. Record di temperatura, ECG e la frequenza respiratoria del mouse nel software di analisi dei dati.

4. collo Operazione per Systemic monitoraggio cardiovascolare

4.1) Vessel dissezione

1. Identificare la linea mediana del collo, punto medio della clavicola, l'angolo della mandibola.
2. Effettuare una incisione longitudinale 2 centimetri dall'angolo della mandibola al punto medio clavicola che è 0,5 centimetri sul lato sinistro della linea centrale.
3. Sezionare la ghiandola sottomandibolare, capovolgerlo e coprire con garza imbevuta di soluzione salina.
4. Identificare la vena giugulare, sezionarlo e posizionare tre 6-0 punti di sutura in seta sotto la vena per la legatura più tardi e la fissazione.
5. Identificare il muscolo sternocleidomastoideo, separarlo dal ventre superiore del ventre omoioideo e posteriore del muscolo digastrico, e tirarlo con un divaricatore per una facile esposizione della carotide.
6. Sezionare l'arteria carotide e posizionare tre 6-0 punti di sutura in seta sotto l'arteria per la legatura più tardi e la fissazione.

4.2) misura il flusso di sangue dell'arteria carotidea

1. Posizionare il transonicosondare intorno alla carotide, mantenerlo stabile, e ottimizzare il contatto con ultrasuoni gel o soluzione salina.
2. Record velocità del flusso sanguigno dell'arteria carotide come indicato sul piccolo schermo del dispositivo transonica utilizzando il software di analisi dei dati
3. Rimuovere la sonda dopo aver completato la misurazione

4.3) misurazione della pressione arteriosa carotidea (PAC)

1. Legare l'estremità distale della carotide e bloccare la sua estremità prossimale.
2. Mettere 2 suture di fissaggio intorno alla carotide. Utilizzare 10-0 prolene per il soggiorno sutura.
3. Fai una piccola incisione sulla parete anteriore della nave.
4. Inserire il catetere Millar e fissarlo con punti di sutura pre-posto.
5. Registrare la PAC nel software di analisi dei dati.

4.4) misura il flusso di sangue della vena giugulare

1. Sollevare la vena giugulare e posizionare la sonda flusso transonico per misurare la portata.
2. Registrare la velocità di flusso nel software di analisi dei dati.

4.5) misurazione della pressione venosa centrale (CVP)

1. Bloccare l'estremità prossimale della vena giugulare e legare l'estremità distale.
2. Tagliare una piccola incisione utilizzando microscissors sulla parete anteriore della nave.
3. Inserire il catetere pieno di liquido e fissarlo con le linee di sutura pre-posto.
4. Registrare il CVP nel software di analisi dei dati.

5. addominale funzionamento per l'acquisizione di epatiche Emodinamica

5.1) Identificazione della nave

1. Effettuare una incisione trasversale sull'addome.
2. Eventerate l'intestino a sinistra e coprire con garza umida.
3. Identificare la vena cava inferiore, la vena porta, l'arteria epatica comune e l'arteria epatica propria.
4. Eliminare alcuni salina calda nell'addome e sulla superficie degli intestini ogni 5 min durante l'intera procedura di monitoraggio.

5.2) Misurazione del portale flusso sanguigno

1. Sezionare la vena porta.
2. Mettere 6-0 seta sotto la vena porta per facilitare il sollevamento della nave quando si posiziona la sonda di flusso.
3. Posizionare la sonda di flusso transonico attorno alla vena porta e misurare la sua velocità di flusso di sangue.
4. Registrare la velocità di flusso del sangue della vena porta.

5.3) Misura del flusso dell'arteria epatica comune

1. Sezionare l'arteria epatica comune con cautela.
2. Posizionare un 6-0 sutura di seta intorno alla nave per facilitare il sollevamento della nave.
3. Posizionare la sonda di mandata intorno all'arteria.
4. Misurare il flusso sanguigno e acquisire i dati.

5.4) Misura della pressione della vena porta (PVP)

1. Scegli un ramo della vena mesenterica con pochi rami laterali, che drena direttamente nella vena porta.
2. Legare l'estremità distale della vena mesenterica selezionato. Assicurarsi che la legatura è vicino al tubo intestinale. Legare i suoi piccoli rami
3. Mettere 2 Fissaggio suture utilizzando 6-0 prolene intorno alla vena. Il punto chiave di questa procedura è quello di evitare di toccare l'arteria mesenterica quando legatura della vena.
4. Fissare l'estremità prossimale della vena porta.
5. Place 2 Stay suture utilizzando 10-0 prolene. Alcuni sanguinamento si verifica in quanto il soggiorno sutura dovrebbe penetrare la parete vascolare dell'ammenda vena mesenterica.
6. Fai una piccola incisione sulla vena con un microscissor obliquamente a un angolo di 45 gradi.
7. Inserire il catetere Millar attraverso la vena mesenterica nella vena porta e fissarla
8. Registrare la pressione della vena porta. Al termine della procedura, sacrificare i topi da dissanguamento sotto anestesia.

Risultati

Parametri vitali dei topi come la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca sono ovviamente molto superiore nel ratto. Media pressione arteriosa sistemica e della pressione venosa giugulare sono simili ai valori di ratto e anche simili ai dati umani.

Dati emodinamici epatici sono ovviamente diversi. Abbiamo ottenuto valori normali da 8 topi. Portale flusso di sangue in topi normali era compresa tra 1,6-2,3 ml / min. Flusso in arteria epatica comune variava 0,10-0,35 ml / min. Pressione ...

Discussione

Il monitoraggio di emodinamica epatica è un importante strumento di ricerca in epatologia e chirurgia epatobiliare. Acquisizione dei dati emodinamici epatici aiuta a caratterizzare l'effetto delle procedure epatobiliare sul sistema circolatorio. È necessaria l'acquisizione di dati emodinamici epatici anche per studiare l'effetto di farmaci che influenzano la pressione portale e flusso portale, ad esempio, a seconda delle necessità in studi di valutazione di farmaci vasoattivi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PowerLab 16/30	ADInstruments	PL3516
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224	Bridge amplifier
Animal Bio Amp	ADInstruments	FE136
Needle Electrodes for FE136 (3 pk)	ADInstruments	MLA1213
Perivascular Flowmeter Module	Transonic	TS420
Flowprobe MA0.5PSB/MA1PSB	Transonic	MA0.5PSB/MA1PSB
SPR-1000 Mouse Pressure Catheter	Millar instruments	841-0001
fluid filled catheter	Terumo	SR+DU2619PX	26G, 0.64×19mm
micro scissors	F·S·L	No. 14058-09
micro serrefine	F·S·L	No.18055-05
Micro clamps applicator	F·S·L	No. 18057-14
Straight micro forceps	F·S·L	No. 00632-11
Curved micro forceps	F·S·L	No. 00649-11
needle-holder	F·S·L	No. 12061-01
6-0 silk	ethicon
6-0 prolene	ethicon
7-0 prolene	ethicon
10-0 prolene	ethicon
Tail cut-off device	Kent Scientific		www.kentscientific.com
LabChart7	ADInstruments		data  analysis software