Preparazione di un Sangue cultura pellet per il Rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici

Riepilogo

Una rapida preparazione pellet batterico da una emocoltura positiva può essere utilizzato come campione per le applicazioni quali l'identificazione mediante MALDI-TOF, colorazione di Gram, test di sensibilità agli antibiotici e test di PCR-based. I risultati possono essere tempestivamente ai medici di migliorare la prognosi dei pazienti affetti da infezioni del sangue.

Abstract

Infezioni del sangue e sepsi sono una delle principali cause di morbilità e mortalità. Il buon esito dei pazienti affetti da batteriemia dipende da una rapida identificazione dell'agente infettivo per guidare il trattamento antibiotico ottimale. L'analisi delle macchie di Gram da emocoltura positiva può essere rapidamente condotto e già un impatto significativamente il regime antibiotico. Tuttavia, l'accurata identificazione dell'agente infettivo è ancora necessaria per stabilire il trattamento ottimale mirato. Presentiamo qui una preparazione pellet batterico semplice e veloce da una cultura del sangue positivo che può essere utilizzato come campione per diverse applicazioni a valle essenziali quali l'identificazione mediante MALDI-TOF MS, test di sensibilità agli antibiotici (AST) mediante saggio di diffusione del disco o sistemi automatizzati AST e automatizzato PCR-based test diagnostici. Le prestazioni di questi diversi sistemi di identificazione e AST applicati direttamente sulle emocolture pellet batterico è molto SImilar alla performance, normalmente ottenuto da colonie isolate cresciute su piastre di agar. Rispetto ai metodi tradizionali, la rapida acquisizione di un pellet batterico riduce notevolmente il tempo di segnalare sia l'identificazione e AST. Così, seguendo la cultura positività del sangue, l'identificazione mediante MALDI-TOF può essere segnalato in meno di 1 ora, mentre i risultati di AST da sistemi automatizzati o AST test di diffusione del disco entro 8 a 18 ore, rispettivamente. Allo stesso modo, i risultati di un test rapido basato su PCR possono essere comunicati ai medici meno di 2 ore a seguito della relazione di una batteriemia. Insieme, questi risultati dimostrano che la rapida preparazione di un pellet batterico cultura del sangue ha un impatto significativo sulla identificazione e AST turnaround tempo e quindi sul buon esito dei pazienti affetti da infezioni del sangue.

Introduzione

Infezioni del sangue e sepsi nei pazienti ospedalizzati sono una delle principali cause di morbilità e mortalità. Così, la mortalità correlata al flusso sanguigno infezioni si osserva in circa il 14% al 37% dei pazienti ricoverati in ospedale e può aumentare fino al 35% in unità di terapia intensiva dei pazienti ^1-3. La rapida identificazione dell'agente infettivo è fondamentale per guidare il trattamento antimicrobico ottimale e di aumentare il buon esito della terapia antimicrobica ^4,5. La rapida analisi delle macchie di Gram da emocoltura positiva ha già un impatto significativo sull'adattamento della terapia antimicrobica ^6,7 ma accurata identificazione dell'agente infettivo è tenuto a fornire il trattamento antibiotico più adatto ai pazienti. Per esempio, diversi regimi di trattamento antibiotico deve essere attuato a seguito batteriemia con enterococchi e streptococchi che sono difficili da distinguere da colorazione di Gram. Allo stesso modo, l'identificazione alle specie Level è tenuto a rilevare enterobatteri Gram negativi che codifica per una cromosomico AMPC gene che conferisce una maggiore resistenza ai β-lattamici ^8.

Con una emocoltura positiva, l'approccio diagnostico convenzionale è di sottocultura l'agente infettivo su diverse piastre di agar, che richiede diverse ore di incubazione supplementare prima identificazione con vari metodi tra cui i test biochimici, la crescita su diversi terreni selettivi e di sistemi di identificazione microbica automatizzati. Il tempo per i risultati di un approccio diagnostico convenzionale è di circa 1 a 3 giorni.

L'emergere della tecnologia matrix-assisted laser desorbimento / spettrometria di massa a ionizzazione a tempo di volo (MALDI-TOF) per una rapida identificazione dei microrganismi ha fornito un nuovo strumento per identificare rapidamente microrganismi da colonie cresciute su piastre di agar, ma anche direttamente dal sangue positivo culture (Figura 1) ^9-12. The l'uso di MALDI-TOF per identificare un agente infettivo da colture di sangue ha ridotto significativamente il tempo di risultati per alcuni minuti invece delle ore e dei giorni richiesti dai metodi tradizionali. Come discusso da Croxatto et al. ^13, l'efficienza di identificazione MALDI-TOF si basa su diversi parametri compresa la purezza e la quantità del microrganismo. Questi due criteri sono facilmente ottenuti da colonie discrete cresciute su piastre di agar, ma richiedevano un trattamento pre-analitico per l'arricchimento batterica e purificazione da campioni complessi come la cultura del sangue, che contengono più componenti cellulari e proteine ​​che possono interferire con l'identificazione MALDI-TOF.

Metodi di isolamento vari microrganismi 'di coltura sangue sono stati utilizzati in un certo numero di studi inclusi saponina o altro metodo detergenti delicati per l'estrazione batterica ^9,14, siero metodo separatore ^10, lisi metodi di centrifugazione ¹² e soluzioni commercialmente, come il kit sepsityper. Il nostro laboratorio diagnostico batteriologico ha sviluppato un semplice sangue-coltura preparazione pellet batterico base di cloruro di ammonio eritrociti-lisi che consentono rapida identificazione di batteri e lieviti mediante MALDI-TOF e sistemi di identificazione automatizzati (Figura 2) ^15. Questa preparazione sangue-cultura pellet anche fornire un campione per altre applicazioni a valle diretti come colorazione di Gram, test automatizzati basati sulla PCR diagnostici come POCT-PCR per il rilevamento rapido di meticillino-resistente Staphyloccocus aureus (MRSA), e test di sensibilità agli antibiotici con sistemi automatizzati di AST e / o mediante saggi di diffusione del disco su piastre di agar (Figura 3).

In questo lavoro, descriviamo le fasi per la preparazione del pellet batterico sangue-cultura come spiegato da Prod'hom et al. ¹⁵ (Figura 4). Ci sarà anche descrivano i protocolli per tre delle principali applicazioni che possono essere eseguite sul pellet cultura del sangue: Identificazione mediante MALDI-TOF ^15, di identificazione (ID) e test di sensibilità agli antibiotici (AST) con i sistemi automatizzati ¹⁶ per Enterobacteriaceae e stafilococchi e PCR-automatizzato test diagnostico basato per la rilevazione di MRSA ^17.

Protocollo

Questo protocollo è stato sviluppato e validato seguendo i processi di ricerca e sviluppo e le regole etiche della nostra istituzione, prima di essere implementato come strumento di routine.

1 Preparazione di una cultura Sangue batterica pellet da Ammonio Cloruro Procedura eritrociti-lisi

1. Preparazione di una coltura ematica positiva per la successiva centrifugazione.
   1. Sterilizzare il tappo cultura del sangue. Aggiungere etanolo al 70% sul tappo della bottiglia e bruciarlo.
      NOTA: Non eseguire questo passaggio sotto una cappa a flusso laminare.
   2. Spostare la bottiglia di una cappa a flusso laminare. Raccogliere 5 ml della coltura di sangue con una siringa da 20 G.
   3. Aggiungere i 5 ml di coltura di sangue in un tubo da centrifuga da 50 ml contenente 45 ml di acqua sterile (H ₂ O) e miscelare il campione.
2. Preparazione di una coltura sangue pellet batterico per lisi centrifugazione.
   1. Centrifugare il campione a 1000 xg per 10 minuti a temperatura ambiente.
   2. Remove il surnatante (contenente principalmente H ₂ O e cellule del sangue) con una pompa a vuoto laboratorio.
   3. Risospendere il pellet in 1 ml di fatto in casa di cloruro di ammonio Soluzione di Lisi (0,15 M NH ₄ Cl, 1 KHCO mm _3). Abbattere il pellet mediante raschiatura e vortex la provetta e centrifugare il campione a 140 xg per 10 minuti a temperatura ambiente.
   4. Eliminare il surnatante contenente principalmente detriti globuli rossi.
      1. Se il pellet rimasto emorragica, risospendere il pellet in 2 ml di acqua distillata sterile e H ₂ 0 per lisare i globuli rossi ulteriori residui e lavare il pellet. Centrifugare il campione a 140 xg per 10 min a RT e scartare il surnatante.
   5. Risospendere il pellet in 200 ml di H ₂ O
3. Subculture della cultura sangue su vari supporti agar selettivo e non selettivo.
   1. Raccogliere 1 ml della cultura di sangue con una siringa da 20 G.
   2. Inoculare 1 goccia di sangue cultura into quattro quadranti su agar sangue, agar cioccolato, McConkey agar e agar Schaedler.
   3. Incubare a 37 ° C l'agar sangue e piastre di agar cioccolato in una atmosfera di CO ₂ 5%, l'agar McConkey in ambiente normale, e la piastra di agar Schaedler in condizioni anaerobiche.
   4. Seguire la crescita batterica sui diversi media.
   5. Verificare la purezza batterica.

2 Identificazione mediante MALDI-TOF MS

1. Identificazione diretta dal pellet sangue.
   1. Trasferire 1 ml di pellet di sangue su una piastra segnale MALDI e lasciarlo asciugare su una piattaforma di riscaldamento 42 ° C.
   2. Sovrapporre il campione con 1 ml del 70% di acido formico e lasciarlo asciugare su una piattaforma di riscaldamento 42 ° C.
   3. Sovrapporre il campione con 1 ml di matrice MALDI (soluzione satura di α-ciano-4-idrossicinnamico acido nel 50% acetonitrile-2.5% di acido trifluoroacetico) e lasciarlo asciugare su una piattaforma C di riscaldamento 42 °.
   4. Procedere alla MALDI-TOF MS analisi di un sistema MALDI-TOF MS, come descritto dai produttori.
   5. Se il punteggio di identificazione non è valida a livello di specie (ad esempio con un punteggio <2), eseguire una estrazione di proteine ​​del campione di pellet di sangue.
2. Identificazione dopo l'estrazione di proteine ​​dal sangue pellet cultura.
   1. Mescolare 20 ml di pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 13.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
   2. Eliminare il surnatante e aggiungere 25 ml di 70% di acido formico e 25 ml di acetonitrile 100% al pellet. Vortex vigorosamente per risospendere il pellet. Risospendere pellet difficili da rompere giù con puntali delle pipette prima di vortex.
   3. Centrifugare a 13.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Trasferire 1 ml di surnatante (che contengono proteine ​​estratte) su una piastra segnale MALDI e lasciarlo asciugare su una piattaforma di riscaldamento 42 ° C. Procedere come descritto in 2.1.2.

3. batterica Identificazione e antibiotici test di suscettibilità con un sistema automatizzato microbica

1. Preparazione di una sospensione batterica di identificazione batterica e AST con un sistema automatizzato microbica.
   1. Preparare una provetta di plastica contenente 3 ml di soluzione sterile 0,45% NaCl compatibile con il sistema automatizzato microbica.
   2. Aggiungere un volume sufficiente di pellet cultura sangue nella soluzione di NaCl 0,45% per ottenere una sospensione batterica corrispondente ad una torbidità McFarland di 0,6 e 0,8. Misurare la torbidità utilizzando una macchina densitometro.
      NOTA: Il volume del pellet batterico coltura sangue varia da 50 a 200 microlitri per ottenere una torbidità McFarland di 0,6 e 0,8.
2. Inoculare i Gram-positivi (GP) o Gram-negativi (GN) schede automatizzate per l'identificazione e le schede AST automatizzati per i test di sensibilità antimicrobica di cocchi Gram-positivi e Gram-negativi batteri come descritto dal produttore.
   NOTA: IDENTIFICAZIONEn con il medico di famiglia o carte GN non si applica se il MALDI-TOF MS valore punteggio di identificazione è> 2. Controllare la purezza della sospensione batterica subcoltura la sospensione batterica su agar sangue (GP e GN) e MacConkey agar (GN) piatti.

4. antibiotici test di suscettibilità da Disk Diffusion Assay

Il test di diffusione del disco è descritto dal Comitato europeo sui test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST, versione 3.0, aprile 2013, www.eucast.org).

1. Preparazione di una sospensione batterica di eseguire il test di sensibilità antimicrobica mediante saggio disco-diffusione.
   1. Preparare un tubo di vetro contenente 3 ml di soluzione di NaCl allo 0,9% sterile.
   2. Aggiungere un volume sufficiente di pellet cultura sangue nella soluzione di NaCl allo 0,9% per ottenere una sospensione batterica corrispondente ad una torbidità McFarland 0,5. Misurare la torbidità utilizzando una macchina densitometro.
      NOTA: Il volume della coltura sanguepellet batterico varia da 50 a 200 microlitri per ottenere una torbidità McFarland di 0,6 e 0,8.
   3. Agitare la sospensione batterica.
2. Inoculazione di sospensione batterica su agar Mueller-Hinton (MH) o Mueller-Hinton agar-agar esigenti organismi (MHF) (MH integrato con 5% di sangue defibrinato di cavallo e 20 mg / L di β-nicotinamide adenina dinucleotide).
   1. Immergere un tampone di cotone sterile nella sospensione batterica e rimuovere delicatamente il liquido in eccesso ruotando il tampone sulla parete interna del tubo di vetro.
   2. Distribuire la sospensione batterica in modo uniforme su tutta la superficie della piastra di agar MH / MHF tamponando in tre direzioni o utilizzando una piastra rotatore automatizzato.
3. Applicazione di dischi antimicrobici su piastre di agar inoculate.
   1. Applicare da vicino i dischi sulla superficie delle piastre di agar inoculate secchi manualmente o utilizzando un dispenser disco di suscettibilità.
   2. Incubare la piastra a tempe appropriatoratura e l'atmosfera come descritto nel metodo di diffusione su disco EUCAST test di suscettibilità antimicrobica (Versione 3.0, aprile 2013, www.eucast.org).

5. Automated PCR-based Test diagnostico per la rilevazione di MRSA

1. Usando una micropipetta, trasferire 50 ml di pellet cultura di sangue nel flacone di reagente esempio fornito con l'MRSA automatizzato kit diagnostico basato su PCR e vortex per 20 sec.
2. Usando una micropipetta 1 ml, dispensare il campione nella porta campione della cartuccia. Inserire la cartuccia nel sistema PCR automatico e avviare il test come descritto dal produttore.

Risultati

Nello studio effettuato da Prod'hom et al. ^15, pellet batterici ottenuti da cloruro di ammonio lisi centrifugazione di 122 emocoltura positiva da 78 pazienti sono stati analizzati mediante MALDI-TOF MS. Su 122 emocoltura positiva, 95 (77,9%) sono stati correttamente identificati a livello di specie e uno (0,8%) a livello di genere. I restanti 26 (21,3%) Pellets emocoltura non hanno dato un'identificazione affidabile mediante MALDI-TOF. Tra questi, 21 sono stati i batteri Gram-positivi, tra cu...

Discussione

Rispetto a emocoltura positiva approcci diagnostici convenzionali, la rapida acquisizione di un pellet batterico utilizzando il cloruro di lisi approccio centrifugazione ammonio ridurre il tempo di segnalare l'identificazione da 16 a 24 ore e il tempo di riferire AST per 24 per 48 ore (figure 1 e 3).

Rapida introduzione di un'appropriata terapia antibiotica è fondamentale per migliorare la prognosi dei pazienti affetti da infezioni del sangue. Così, l'identific...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 G needle	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar